BAB III. METODOLOGI PENELITIAN
E. Tata Cara Penelitian
1. Ekstraksi
Satu kilogram buah tomat segar dicuci dengan air mengalir kemudian
diblender hingga halus. Buah tomat yang telah diblender kemudian
dimasukkan ke dalam 4 buah Erlenmeyer 500 mL masing-masing 250 gram.
Dilakukan penambahan 250 mL pelarut etil asetat ke dalam masing-masing
Erlenmeyer. Kemudian tabung Erlenmeyer dilapisi dengan alumunium foil
untuk mencegah terjadinya reaksi oksidasi likopen karena pengaruh cahaya.
Setelah itu, dilakukan maserasi dengan cara pendiaman selama 7 hari dan
dilakukan penggojogan berkala setiap harinya.
Maserat dikeluarkan dari tabung Erlenmeyer, lalu ekstrak cair
dipisahkan dari ampas dengan menggunakan saringan. Ekstrak cair yang
diperoleh kemudian dimasukkan ke dalam corong pisah untuk memisahkan
antara fase etil asetat dan fase air. Fase etil asetat diambil, kemudian etil asetat
yang terkandung dalam ekstrak diuapkan dengan menggunakan vaccum
rotary evaporator pada tekanan rendah dan suhu 40-60oC hingga tidak ada
pelarut yang menetes lagi dan hingga terbentuk ekstrak kental (Narendran
dkk., 2013).
Ekstrak kental yang diperoleh kemudian dicampurkan dengan talkum
(ekstrak kental : talkum = 1 : 5) lalu diaduk hingga homogen. Kemudian
ekstrak kering yang didapat disimpan pada tempat yang terlindung dari cahaya
2. Uji Kualitatif Antioksidan
Ekstrak kental tomat diteteskan pada bagian tengah kertas Whattmann.
Kemudian diteteskan pula larutan DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil) 0,2%
pada seluruh bagian dari kertas Whattmann. Ditunggu beberapa saat dan
diamati perubahan yang terjadi. Warna ungu pada bagian tengah kertas
Whattmann akan memudar menunjukkan bahwa ekstrak kental tomat memiliki
aktivitas antioksidan (Elya dkk., 2013).
3. Formula Sediaan Krim
Formula yang digunakan dalam pembuatan krim ekstrak etil asetat
tomat mengacu pada formula dalam Formularium Medicamentorium Selectum
(Ikatan Sarjana Farmasi Indonesia, 1971). Komposisi dari formula dapat
dilihat pada tabel III.
Tabel III. Formula acuan (Ikatan Sarjana Farmasi Indonesia, 1971)
Formula Komposisi Asam stearat 14,2 g Trietanolamin 1 g Gliserol 10 g Boraks 0,25 g Nipagin 0,1 g Nipasol 0,05 g Aquadest ad 100 mL
Formula modifikasi berdasarkan hasil orientasi untuk formula krim
100 gram dapat dilihat pada tabel IV.
Tabel IV. Formula modifikasi
Formula Komposisi
Asam Stearat 20 gram Trietanolamin 1,35 gram PEG 6000 2 - 6 gram Texapon® N70 1 – 2,5 gram Metil Paraben 0,2 gram Propilen Glikol 5 gram Aquadest 60 mL Ekstrak kering tomat 6 gram
Formula seperti pada tabel IV dibuat krim ekstrak etil asetat tomat
dengan surfaktan Texapon® N70 dan basis PEG 6000. Level rendah Texapon®
N70 adalah 1 gram dan level tinggi Texapon® N70 adalah 2,5 gram.
Sedangkan level rendah PEG 6000 adalah 2 gram dan level tinggi PEG 6000
adalah 6 gram. Penggunaan level rendah dan level tinggi tersebut berdasarkan
Tabel V. Rancangan formula desain faktorial Formula 1 (g) a (g) b (g) ab (g)
Ekstrak Etil Asetat Tomat 6 6 6 6 Asam Stearat 20 20 20 20 Trietanolamin 1,35 1,35 1,35 1,35 PEG 6000 2 2 6 6 Texapon® N70 1 2,5 1 2,5 Metil Paraben 0,2 0,2 0,2 0,2 Propilen Glikol 5 5 5 5 Aquadest 60 60 60 60 Total 95,55 97,05 99,55 101,05
4. Pembuatan Krim Ekstrak Etil Asetat Tomat
Asam stearat dilelehkan diatas waterbath pada suhu 70°C. PEG 6000
juga dilelehkan diatas waterbath pada suhu 70°C. Setelah PEG 6000 meleleh
lalu dimasukkan Texapon® N70, trietanolamin, propilen glikol, dan metil
paraben. Kemudian fase minyak (asam stearat) dan fase air (campuran PEG
6000, Texapon® N70, trietanolamin, propilen glikol, dan metil paraben)
dituang ke dalam mortar hangat lalu diaduk dengan menggunakan mixer
dengan kecepatan konstan, lalu ditambahkan ekstrak etil asetat tomat dan
aquadest, lalu aduk hingga homogen dan terbentuk masa krim (Young, 1972).
Setelah terbentuk basis krim yang homogen kemudian ditunggu hingga dingin.
5. Orientasi Formula Krim Ekstrak Etil Asetat Tomat
Beberapa macam krim dibuat dengan membuat variasi pada jumlah
Texapon® N70 berturut-turut 0,5 gram, 1 gram, 1,5 gram, 2 gram, dan 2,5
gram. Masing-masing krim kemudian dilihat respon viskositas dan ukuran
droplet setelah 48 jam. Irisan dari jumlah terkecil dan terbesar Texapon® N70
dari kedua respon yang masih memberikan perubahan yang linear akan
menjadi level rendah dan level tinggi pada penelitian ini.
Beberapa macam krim dibuat dengan membuat variasi pada jumlah
PEG 6000 berturut-turut 2 gram, 4 gram, 6 gram, 8 gram, dan 10 gram.
Masing-masing krim kemudian dilihat respon viskositas dan ukuran droplet
setalah 48 jam. Irisan dari jumlah terkecil dan terbesar PEG 6000 dari kedua
respon yang masih memberikan perubahan yang linear akan menjadi level
rendah dan level tinggi pada penelitian ini.
6. Evaluasi Formula Krim Etil Asetat Tomat
a. Pengujian organoleptis
Uji organoleptis dilakukan dengan mengamati bau, warna, dan
homogenitas sediaan krim pada 48 jam setelah pembuatan.
b. Pengujian tipe emulsi dengan metode pewarnaan
Sejumlah krim dioleskan pada gelas objek lalu ditambahkan satu
tetes methylene blue. Selanjutnya dilakukan pengamatan secara
bertipe M/A atau A/M. Jika menunjukkan warna seragam berarti tipe
emulsi M/A, karena air adalah fase luar.
c. Pengujian pH
Sejumlah krim dioleskan pada kertas pH universal dan kemudian
ditentukan pH dari sediaan krim tersebut.
d. Pengujian daya sebar
Uji daya sebar dilakukan setelah 48 jam pembuatan sediaan krim.
Uji dilakukan dengan cara menimbang krim seberat 1 gram, diletakkan di
tengah horizontal plate. Diatas krim diletakkan horizontal plate dan
pemberat sehingga total berat horizontal plate dan pemberat menjadi
125,0 gram, didiamkan selama 1 menit, kemudian diukur dan dicatat
diameter penyebaran krim.
e. Pengujian viskositas
Uji viskositas dilakukan 5 kali yaitu setelah 48 jam pembuatan
krim, pada penyimpanan krim 1 minggu, 2 minggu, 3 minggu, dan 1
bulan. Pengukuran viskositas dilakukan dengan menggunakan alat
Viscotester seri VT 04 (RION-JAPAN) dengan cara memasukkan krim ke
dalam wadah dan pasang pada portabel viscotester. Viskositas krim
diketahui dengan mengamati gerakan jarum penunjuk viskositas.
f. Pengujian mikromeritik (ukuran droplet)
Uji mikromeritik dilakukan 5 kali yaitu setelah 48 jam pembuatan
krim, pada penyimpanan krim 1 minggu, 2 minngu, 3 minggu, dan 1
lensa mikroskop. Cara pengujian mikromeritik yaitu sejumlah krim
dioleskan pada gelas objek kemudian diletakkan di meja benda pada
mikroskop. Diamati ukuran droplet yang terdispersi pada krim. Untuk
menentukan objek digunakan pembesar lemah kemudian diganti pembesar
kuat. Diameter droplet diukur sebanyak 500 droplet (Martin dkk., 1993).
Pengukuran ini dilakukan dengan metode mean.
g. Uji Iritasi Primer dengan Metode HET CAM
Telur ayam kampung yang digunakan adalah telur yang telah
tumbuh menjadi embrio (setelah dierami selama 8-12 hari). Kemudian
buka cangkang telur pada bagian yang memiliki rongga udara. Kontrol
positif (NaOH 0,1 N) dan kontrol negatif (NaCl 0,9%) diambil
menggunakan spuit sebanyak 0,3 mL kemudian disuntikkan pada daerah
pada membran yang dekat dengan pembuluh darah, kemudian amati
perubahan yang terjdi pada pembuluh darah. Sedangkan untuk formula
krim yang akan diuji diambil sebanyak 0,3 gram kemudian diletakkan
pada pada daerah pada membrane yang dekat dengan pembuluh darah,
kemudian amati perubahan pada pembuluh darah.
Pengamatan reaksi CAM (chorioallantoic membrane) dilakukan
selama 300 detik. Waktu timbulnya gejala diamati dan dicatat.
Gejala-gejala yang diamati adalah hemoragi (pendarahan), vascular lysis
(disintegrasi pembuluh darah), dan koagulasi (denaturasi protein ekstra
vaskular dan intra vaskular). Kemudian hasil yang diperoleh dimasukkan
I S= 301−
300 5 + 301−
300 7 + 301−
300 9
Hemorage time yaitu dimulai dalam detik reaksi hemoragi atau
terjadi pendarahan pada CAM. Lysis time yaitu dimulai dalam detik lisis
pembuluh darah hingga pembuluh darah hilang pada CAM. Coagulation
time yaitu dimulai dalam detik pembentukan koagulan pada CAM
(Rudianto, 2010).
7. Validasi Formula Krim Ekstrak Etil Asetat Tomat
Validasi formula dilakukan dengan cara menentuakan daerah optimum
hasil optimasi, kemudian berdasarkan superimposed contour plot maka
diambil 1 titik untuk membuat formula validasi yaitu pada Texapon® N70 1,5
gram dan PEG 6000 5,5 gram. Setelah itu dibuat formula dengan komposisi
surfaktan dan basis yang telah ditentukan untuk dijadikan sebagai formula
validasi. Kemudian formula yang dibuat dilakukan replikasi 3 kali. Krim yang
telah terbentuk kemudian dilakukan pengujian viskositas dan ukuran droplet
pada 48 jam setelah pembuatan.