BAB III METODOLOGI PENELITIAN
E. Tata Cara Penelitian
Determinasi buah cabai rawit putih yang digunakan berdasarkan pengamatan morfologinya dilakukan dengan membandingkan literatur dari Bosland, Bailey, Iglesias-Olivas (1996).
2. Pengumpulan bahan
Buah cabai rawit putih diperoleh dari Pasar Beringharjo, Yogyakarta.
3. Pembuatan ekstrak buah cabai rawit putih
Buah cabai rawit putih sebanyak 1 kg yang masih segar dibersihkan dan dicuci kemudian dibuang bagian tangkainya. Buah cabai rawit putih dikeringkan pada oven dengan suhu 500C, kemudian dihaluskan dengan
blender. Simplisia yang telah halus ditimbang sebanyak 25,0 g, dibungkus menggunakan kertas saring. Simplisia dimasukkan dalam labu alas bulat berisi 350,0 mL etanol p.a. Soxheltasi dilakukan pada suhu 700C selama 8 jam sampai didapat hasil ekstrasi yang jernih. Filtrat hasil ekstraksi dipekatkan dengan menggunakan vacuum rotary evaporator.
4. Penentuan aktivitas antioksidan dengan metode DPPH
a. Pembuatan larutan DPPH, sebanyak 15,80 mg serbuk DPPH dilarutkan dengan 100,0 mL etanol p.a hingga diperoleh larutan DPPH dengan konsentrasi 0,4 mM. Larutan DPPH ditutup dengan aluminium foil dan harus selalu dibuat baru.
b. Pembuatan larutan stok kapsaisin, sebanyak 2,50 mg kapsaisin dimasukkan dalam labu ukur 10 mL, kemudian dilarutkan etanol p.a hingga batas.
c. Pembuatan larutan seri baku kapsaisin, diambil sebanyak 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; dan 5,0 mL larutan stok kapsaisin, kemudian ditambahkan etanol p.a sampai 10,0 mL sehingga diperoleh larutan baku kapsaisin sebesar 25; 50; 75; 100; dan 125 µg/mL.
d. Pembuatan larutan uji, sejumlah 25,0 mg ekstrak buah cabai rawit putih ditimbang kemudian ditambahkan etanol p.a sampai 25,0 mL. Dari larutan tersebut diambil 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 dan 5,0 mL kemudian ditambah etanol p.a sampai 10,0 mL sehingga diperoleh larutan uji dengan konsentrasi 100; 200; 300; 400 dan 500 µg/mL.
e. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan, sebanyak 1,0 mL larutan DPPH dimasukkan ke dalam masing-masing tiga tabung reaksi. Masing-masing tabung reaksi ditambahkan 1,0 mL etanol p.a, larutan baku kapsaisin 75 µg/mL, dan larutan uji 300 µg/mL. Kemudian ditambahkan 3,0 mL etanol p.a pada masing-masing larutan. Larutan divortex selama 30 detik. Setelah 30 menit, perubahan warna yang terjadi diamati.
f. Penentuan panjang gelombang maksimum, pada 3 labu ukur 10 mL, dimasukkan masing-masing 0,50; 1,0; dan 1,50 mL larutan DPPH. Larutan ditambahkan dengan etanol p.a hingga tanda batas sehingga konsentrasi DPPH menjadi 0,020; 0,040; dan 0,080 mM. Larutan divortex selama 30 detik. Lalu dilakukan scanning panjang gelombang serapan maksimum dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 400 – 600 nm.
g. Penentuan operating time (OT), sebanyak 1,0 mL larutan DPPH dimasukkan ke dalam masing-masing tiga labu ukur 5 mL, ditambahkan masing-masing dengan 1,0 mL larutan baku kapsaisin 25; 75; dan 125 µg/mL. Kemudian larutan ditambahkan dengan etanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut divortex selama 30 detik. Setelah itu dibaca
absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 517 nm setiap 5 menit selama 1 jam.
h. Penentuan aktivitas antioksidan buah cabai rawit putih,
i. Pengukuran absorbansi larutan DPPH (kontrol), pada labu ukur 5 mL, dimasukkan sebanyak 1,0 mL larutan DPPH. Larutan ditambahkan dengan etanol p.a hingga tanda batas. Kemudian larutan tersebut dibaca absorbansinya pada saat OT dan panjang gelombang maksimum. Pengerjaan dilakukan sebanyak tiga kali. Larutan ini digunakan sebagai kontrol untuk menguji larutan baku dan larutan uji.
ii. Pengukuran absorbansi larutan pembanding dan larutan uji, sebanyak 1,0 mL larutan DPPH dimasukkan ke dalam labu ukur 5 mL kemudian ditambah dengan 1,0 mL larutan pembanding dan larutan uji pada berbagai seri konsentrasi yang telah dibuat. Selanjutnya, larutan tersebut ditambah dengan etanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut kemudian divortex selama 30 detik dan didiamkan selama OT. Larutan dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum hasil optimasi. Pengujian dilakukan dengan tiga kali replikasi.
i. Validasi metode uji aktivitas antioksidan, hasil dari prosedur 4h (i) dan (ii) divalidasi akurasi (% recovery), presisi (% CV), spesifisitas (spektra kontrol), dan linearitas (nilai r).
Standar e iasi rata rata konsentrasi standar kapsaisin terukurS konsentrasi standar kapsaisin terukur j. Estimasi aktivitas antioksidan, hasil dari prosedur 4h (i) dan (ii), dihitung
nilai % IC dan IC50 untuk kapsaisin dan ekstrak buah cabai rawit putih.
5. Penentuan kadar kapsaisin
a. Pembuatan fase gerak, fase gerak yang digunakan pada penelitian ini dibuat dalam perbandingan, yaitu toluena - kloroform - aseton (45:25:30, v/v/v). Fase gerak dituang dalam bejana kromatografi kemudian kertas saring dimasukkan dalam bejana yang berisi fase gerak. Bejana ditutup rapat dan dibiarkan hingga seluruh kertas saring terbasahi oleh fase gerak.
b. Pembuatan larutan stok kapsaisin, baku kapsaisin ditimbang seksama 5,0 mg ditimbang seksama dan dimasukkan ke dalam labu takar 10 ml, kemudian dilarutkan dengan metanol sampai tanda batas sehingga diperoleh larutan stok kapsaisin 0,50 mg/mL.
c. Pembuatan larutan seri baku kapsaisin, larutan stok kapsaisin 0,50 mg/mL ditotolkan dengan volume 1,0; 2,0; 4,0; dan 8,0 L pada lempeng silika gel 60 F254 sehingga diperoleh seri kapsaisin dengan jumlah 0,5; 1,0; 2,0; dan 4,0 µg.
d. Pembuatan larutan uji, sejumlah 50,0 mg ekstrak buah cabai rawit putih ditimbang seksama kemudian dilarutkan dengan metanol sebanyak 500,0 µL. Larutan tersebut divortex selama 10 menit dengan pemanasan di atas
menit dan disaring dengan ayakan mesh 60. Larutan uji dibuat replikasi sebanyak tiga kali.
e. Penetuan kadar kapsaisin buah cabai rawit putih, sebanyak 10,0 L larutan uji ditotolkan pada lempeng silika gel 60 F254, kemudian dikembangkan dalam bejana kromatografi yang telah dijenuhkan dengan fase gerak toluena - kloroform - aseton (45:25:30, v/v/v). Pengembangan dilakukan setinggi 10 cm, lempeng silika kemudian dikeluarkan dan ditunggu hingga kering. Bercak diamati di bawah lampu UV 254 nm kemudian dianalisis dengan densitometer pada panjang gelombang maksimum. Bercak seri baku kapsaisin diukur AUC-nya dengan densitometri pada panjang gelombang pengamatan yang telah diperoleh. Puncak kromatogram dan nilai AUC yang muncul diamati. Dengan metode regresi linear, nilai seri kadar (µg/mL) diplotkan terhadap nilai AUC masing-masing seri larutan baku sehingga diperoleh persamaan y = bx + a dimana y merupakan nilai respon (AUC), x merupakan konsentrasi senyawa baku, a adalah intersept, dan b adalah slope. Kadar kapsaisin dalam sampel ditentukan berdasarkan persamaan kurva baku yang paling baik.
