BAB III METODOLOGI PENELITIAN
E. Tata Cara Penelitian
1. Pengumpulan bahan
Bahan uji yang digunakan adalah simplisia basah daun pukul empat (Mirabilis jalapa L.) yang diperoleh dari distributor Dipokusumo Farm (Rasamala A4, Semarang Kota, Jawa Tengah) berasal dari kebun di Malang, Jawa Timur yang dipanen pada bulan Juni 2014.
2. Pengeringan
Tanaman segar yang didapat, dipisahkan dari batang, akar, dan bunga. Kemudian bagian daun dikeringkan untuk mendapatkan simplisia kering yang akan digunakan dalam penelitian.
3. Pembuatan ekstrak etanol daun pukul empat
Simplisia yang telah disortasi, dibuat serbuk dengan menggunakan blender. Serbuk yang telah halus kemudian diekstrak dengan merendam 10 gram serbuk daun pukul empat dalam 50 mL etanol : air (7:3). Kemudian dilakukan homogenisasi campuran dengan cara pengadukan. Lalu, dimaserasi selama 48 jam dengan kecepatan 150 rpm. Setelah dimaserasi, kemudian larutan disaring, bagian cair diambil dan dipekatkan menggunakan rotatory evaporator dengan suhu 80oC selama 5 menit dan dilanjutkan dengan penguapan menggunakan waterbath suhu 80oC selama 4,5 jam. Hasil diperoleh hingga didapat bobot tetap pada ekstrak dengan konsistensi semisolid berwarna hijau gelap.
4. Persiapan ekstrak
Ekstrak kental yang telah dibuat ditimbang dan dilarutkan menggunakan DMSO. Kemudian di-vortex agar ekstrak kental dan DMSO menjadi homogen.
5. Preparasi sel
Semua alat disterilisasi terlebih dahulu. Sel diambil dari tangki nitrogen cair, kemudian dicairkan dalam penangas air pada suhu 37oC. Ampul disemprot dengan etanol 70% dan dimasukkan ke dalam LAF. Lalu ampul dibuka dan sel dipindahkan ke dalam conical tube steril yang berisi media.
Suspensi sel disentrifus dengan kecepatan 650 rpm selama 3 menit, kemudian supernatan dibuang. Media yang baru ditambahkan pada endapan sel kemudian disuspensi perlahan hingga homogen. Sel ditumbuhkan dalam beberapa buah tissue culture dish/flask dan diinkubasi dalam inkubator CO2
pada suhu 37oC dengan aliran CO2 5%. Setelah diinkubasi selama 24 jam, kemudian dilakukan penggantian media kultur. Sel ditumbuhkan hingga konfluen dan jumlahnya cukup untuk penelitian. Setelah sel konfluen, media dibuang dan sel diresuspensi hingga terlepas semua dari dinding dish/flask. Suspensi sel kemudian dipindahkan ke dalam conical tube steril baru. Sel dihitung dengan haecytometer dan cell counter lalu dibuat suspensi sel dengan konsentrasi sel sesuai dengan kebutuhan.
Jumlah sel dihitung dengan cara :
(Doyle and Griffiths, 2000).
6. Preparasi larutan uji
Larutan uji dilarutkan dalam DMSO sehingga diperoleh konsentrasi larutan induk dengan konsentrasi 100.000 µg/mL. Larutan induk selanjutnya diencerkan dengan media kultur sehingga diperoleh konsentrasi 2000-0,01 µg/mL untuk uji sitotoksik tunggal.
7. Pengamatan viabilitas sel
Sel T47D (kepadatan 5 x 104 sel/sumuran) diambil dan ditanam pada
Kemudian diinkubasi selama 24 jam. Plate diambil, media sel dibuang (dibalikkan 180o plate, dikeringkan diatas tisu). Larutan ekstrak etanol daun pukul empat (seri konsentrasi sampel, triplo) ditambahkan dalam sumuran dan diinkubasi selama 24 jam. Plate diambil, media sel dibuang, dicuci PBS 1x. Reagen MTT 100 µL ditambahkan, diinkubasi selama 2-4 jam dalam inkubator (sampai terbentuk formazan). SDS 10% dalam 0,1 N HCl 100 µL ditambahkan jika formazan telah terbentuk. Plate dibungkus dengan aluminium foil dan diinkubasi selama 24 jam di tempat gelap (tidak dalam inkubator). Kemudian plate dibaca dengan ELISA reader pada λ 595 nm (ATCC, 2011).
8. Pengamatan apoptosis
Sel T47D sejumlah 5 x 105/2mL/sumuran didistribusikan ke dalam 6 well-plate. Kemudian diinkubasi 24 jam, supaya sel beradaptasi. Sel yang telah diinkubasi kemudian dicuci PBS, diberi perlakuan dan diinkubasi kembali selama 24 jam. Pada akhir inkubasi, media pada tiap sumuran diambil dan dipindahkan pada tiap konical. Conical tube diberi label. Kemudian sumuran pada 6 well-plate diberi PBS, PBS diambil dan dimasukkan pada tiap conical yang sesuai. Pada 6 well-plate diberi tripsin sebanyak 200 µL dan diinkubasi selama 3 menit. Lalu diberi media kultur 1 mL dan ditampung ke conical yang sesuai. Konikal disentrifugasi selama 4 menit, 4000 rpm. Kemudian supernatan dibuang dan sisa endapan diberi PBS dingin 1 mL, diresuspensi dan dipindahkan ke eppendorf sebanyak 1 mL.
Eppendorf kemudian disentrifugasi selama 5 menit, 5000 rpm. Supernatan dibuang dan sisa endapan ditambah dengan Reagen Annexin V Flous dan diinkubasi selama 10 menit dalam ruangan tanpa cahaya. Reagen annexin berupa campuran dari buffer, reagen annexin dan reagen pi. Setelah diinkubasi kemudian larutan ditambah buffer 300 µL dan dianalisis (CCRC, 2009).
9. Pengamatan ekspresi protein dengan imunositokimia
Sel T47D sejumlah 5 x 104 sel/sumuran ditanam pada coverslip
dalam 24 well-plate dengan kondisi 80% konfluen untuk dipanen dan diinkubasi selama 24 jam di dalam inkubator. Kemudian 24 well-plate
diambil dan medium sel dibuang. Well-plate diisi PBS masing-masing 500 µL, lalu buang PBS (dicuci PBS). Sampel larutan uji ditambahkan dalam sumuran, dan diinkubasi selama 24 jam. Pada jam ke-24 diambil plate dan media sel dibuang, lalu dicuci dengan PBS. Coverslip diambil dan diletakkan dalam kaca preparat. Lalu diberi label pada kaca preparat. Metanol dingin 300 µL diteteskan, diinkubasi selama 10 menit. Metanol dibuang secara perlahan. Preparat dicuci menggunakan PBS. Kemudian ditambah 500 µL aquades, didiamkan 5 menit, dan dibuang (dicuci aquades). Selanjutnya preparat ditetesi larutan hidrogen peroxsidase (blocking solution), diinkubasi 10 menit. Lalu larutan dibuang. Selanjutnya ditetesi prediluted blocking serum, diinkubasi selama 10 menit. Lalu larutan dibuang. Kemudian ditetesi Primer Antibodi Monoklonal anti-ERα pengenceran 1:100 selama 1 jam dan dicuci
dengan PBS. Kemudian ditetesi biotinylated universal secondary antibody
sebanyak 100 µL, diinkubasi 20 menit dan dicuci PBS selama 5 menit. Reagen kompleks streptavidin-peroxidase ditetesi sebanyak 100 µL dan diinkubasi selama 10 menit. Lalu dicuci dengan PBS. Larutan DAB 100 µL diteteskan, lalu diinkubasi selama 2 menit. Kemudian dicuci aquades. Lalu larutan Mayer Haematoxylin sebanyak 100 µL diteteskan dan diinkubasi 5 menit, kemudian dicuci aquades. Coverslip diangkat dan dicelupkan dalam etanol absolut. Kemudian dicelupkan dalam xylol, keringkan. Coverslip
diletakkan di atas object glass, ditetesi dengan etelen (mounting media), cover slip ditutup dan diamati menggunakan mikroskop cahaya perbesaran 10-100x (Javois, 2007).
F. Tata Cara Analisis Hasil