Tata Cara Penelitian

BAB III. METODOLOGI PENELITIAN

E. Tata Cara Penelitian

Minyak cengkeh (Oleum caryophylli) yang diperoleh dari CV Indaroma Yogyakarta dan telah diuji identitasnya, dibuktikan dengan Certificate of Analysis.

2. Verifikasi Minyak Cengkeh

a. Verifikasi indeks bias minyak cengkeh. Indeks bias minyak cengkeh diukur

menggunakan refractometer Abbe. Minyak cengkeh diteteskan pada prisma utama, kemudian prisma ditutup dan refraktometer diarahkan ke cahaya

terang, sehingga melalui lensa skala sehingga dapat dilihat dengan jelas dan

ditentukan nilai indeks biasnya. Refraktometer dialiri air mengalir dan diatur

suhunya menjadi 20^oC. Nilai indeks bias minyak cengkeh ditunjukkan oleh

skala yang pada saat terdapat garis batas yang memisahkan sisi terang dan sisi

gelap pada bagian atas dan bawah. Dilakukan replikasi sebanyak 3 kali.

b. Verifikasi bobot jenis minyak cengkeh. Bobot jenis minyak cengkeh diukur

dengan menggunakan piknometer yang telah dikalibrasi, dengan menetapkan

bobot piknometer kosong dan bobot air pada suhu 25OC. Piknometer diisi

27

ditimbang. Bobot piknometer yang telah diisi minyak cengkeh kemudian

dikurangi bobot piknometer kosong. Bobot jenis minyak cengkeh merupakan

perbandingan antara bobot jenis minyak cengkeh dengan bobot air, pada suhu

25OC. Dilakukan replikasi sebanyak 3 kali.

3. Formulasi Emulgel dengan Kombinasi Lama pencampuran dan Kecepatan Putar mixer

Formula yang digunakan adalah :

R/ Minyak cengkeh 15 g Carbopol 940 2 g Trietanolamin 0,6 g Paraffin liquidum 1 g Tween 80 17,5 g Span 80 2,5 g Gliserin 2,0 g Metil paraben 0,18 g Propil paraben 0,02 g Aquadest 56,3 g

Cara pembuatan emulgel:

Carbopol 940 dikembangkan dengan menggunakan sebagian aquadest dari formula selama 24 jam, kemudian semua bahan yang termasuk dalam fase minyak (minyak cengkeh, parafin cair, dan span 80) dicampur terlebih dahulu pada suhu 50^oC. Semua bahan yang termasuk fase air juga dicampur terlebih dahulu pada suhu 50^oC. Campuran fase minyak dicampurkan ke dalam fase air dengan mixer. Selanjutnya ke dalam emulsi ditambahkan Carbopol 940 yang sebelumnya telah dikembangkan dengan aquadest dan dicampur dengan mixer. Proses pencampuran (emulsifikasi dan penambahan

Carbopol) dilakukan sesuai dengan level faktor yang telah ditentukan (lama pencampuran : 10 menit dan 30 menit; kecepatan putar 200 rpm

dan 500 rpm). Triethanolamin ditambahkan ke dalam campuran, kemudian campuran diaduk kembali dengan mixer selama 5 menit dan terbentuk emulgel.

Tabel II. Level rendah dan level tinggi lama dan kecepatan putar pada proses pembuatan emulgel minyak cengkeh

Formula Lama Pencampuran Kecepatan Putar

1 10 menit 200 rpm

a 30 menit 200 rpm

b 10 menit 500 rpm

ab 30 menit 500 rpm

Keterangan :

F (1) = lama pencampuran level rendah, kecepatan putar level rendah F (a) = lama pencampuran level tinggi, kecepatan putar level rendah F (b) = lama pencampuran level rendah, kecepatan putar level tinggi F (ab) = lama pencampuran level tinggi, kecepatan putar level tinggi 4. Uji pH

Uji pH dilakukan dengan cara mengukur pH sediaan emulgel minyak cengkeh setelah dibuat menggunakan indikator kertas pH. Nilai pH yang diinginkan adalah berada dalam rentang pH yang tidak mengiritasi kulit, yaitu 5-6.

5. Uji Iritasi Primer Emulgel

Bulu bagian punggung kelinci dicukur kemudian dibagi menjadi 2 sisi (kiri dan kanan) untuk sediaan emulgel dan basis emulgel sebagai kontrol dengan area berukuran kira-kira 1 inchi x 1 inchi (2,54 cm x 2,54 cm) di masing-masing sisi. Setiap formula yang akan diuji dan basis ditimbang 0,5 gram, kemudian diaplikasikan ke kulit kelinci. Bagian kulit kelinci ditutup dan

29

dibungkus dengan kain kasa. Kelinci tersebut dikembalikan ke kandang. Hasil uji diamati pada 24, 48, dan 72 jam setelah perlakuan. Sediaan emulgel dan basis dihilangkan, sisi perlakuan dibersihkan dengan air untuk menghilangkan

residu (Deveda, et al., 2010).

6. Uji Sifat Fisik Emulgel

a. Uji viskositas. Pengukuran viskositas menggunakan alat Viscotester Rion-Japan seri VT-04 dengan cara : sediaan emulgel dimasukkan dalam wadah dan dipasang pada portable viscotester. Viskositas emulgel diketahui dengan mengamati gerakan jarum penunjuk viskositas. Viskositas yang dikehendaki dalam penelitian ini antara 200 – 300 d.Pa.s. Pengujian viskositas dilakukan 48 jam setelah emulgel dibuat. Dilakukan replikasi sebanyak 3 kali.

b. Uji daya sebar. Sediaan emulgel ditimbang seberat 1 gram dan diletakkan di tengah kaca bulat berskala. Di atas emulgel diletakkan kaca bulat lain seberat 55 gram, didiamkan selama 1 menit, kemudian dicatat penyebarannya. Daya sebar yang dikehendaki di dalam penelitian ini yaitu 3 – 5 cm. Pengujian daya sebar dilakukan 48 jam setelah emulgel selesai dibuat. Dilakukan replikasi sebanyak 3 kali.

7. Uji Stabilitas Fisik Emulgel

Uji stabilitas fisik dilihat dengan melihat presentase pergeseran viskositas setelah penyimpanan selama satu bulan. Presentase pergeseran viskositas dihitung dengan cara selisih viskositas setelah satu bulan penyimpanan dan viskositas setelah 48 jam pendiaman dibandingkan

viskositas setelah 48 pendiaman dikalikan 100%. Pergeseran viskositas yang dikehendaki dalam penelitian ini adalah kurang dari 10%.

8. Uji Antimikroba Emulgel terhadap Staphyloccus epidermidis

a. Pembuatan stok bakteri Staphylococcus epidermidis. Media Muller Hinton Agar (MHA) dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 5 mL, kemudian disterilkan dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121^oC selama 15 menit. Selanjutnya dimiringkan dan dibiarkan memadat. Diambil 1 ose biakan murni Staphylococcus epidermidis dan diinokulasikan secara goresan zig-zag, kemudian diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37^oC dalam inkubator.

b. Pembuatan suspensi Staphylococcus epidermidis. Diambil 1 ose koloni bakteri Staphylococcus epidermidis dari stok bakteri, dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang telah berisi media Mueller Hinton Broth (MHB) steril, kemudian diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37^oC dalam inkubator, selanjutnya kekeruhan suspensi bakteri Staphylococcus

epidermidis disesuaikan dengan standar 0,5 Mac Farland (1,5 x 10⁸

CFU/mL).

c. Pembuatan kontrol media. Media MHA steril dituang ke dalam cawan petri, dan ditunggu hingga memadat, kemudian diinkubasi selama 48 jam dengan suhu 37^oC. Setelah diinkubasi, diamati, dan dibandingkan dengan perlakuan.

d. Pembuatan kontrol pertumbuhan bakteri uji Staphylococcus epidermidis.

31

kemudian ditambahkan media MHA steril dengan suhu 45-50^oC, cawan petri digoyang sehingga pertumbuhan bakteri dapat merata. Cawan petri tersebut kemudian diinkubasi selama 48 jam, dengan suhu 37^oC. Setelah diinkubasi, diamati pertumbuhan bakteri uji melalui kekeruhan media dan dibandingkan dengan perlakuan.

e. Uji daya antibakteri emulgel terhadap Staphylococcus epidermidis. Dalam kondisi aseptis, suspensi bakteri dituangkan pada cawan petri, kemudian ditambahkan media MHA steril dengan suhu 45-50^oC, cawan petri digoyang sehingga pertumbuhan bakteri dapat merata. Media dibiarkan memadat kemudian dilakukan pelobangan sampai ke dasar dan penambalan kembali dengan media untuk memberikan sejumlah ruang bagi sediaan (single layer method). Lubang sumuran yang dibuat berjumlah 5, masing-masing diisi dengan emulgel formula 1, formula a, formula b, formula ab, dan kontrol basis. Cawan petri tersebut kemudian diinkubasi selama 48 jam dengan suhu 37^oC. Kemudian diukur diameter zona hambat yang dihasilkan. Dilakukan replikasi sebanyak 3 kali.