BAB III METODOLOGI PENELITIAN
E. Tata Cara Penelitian
a. Pembuatan larutan natrium asetat 0,2 M.
Sebanyak 16,4 g natrium asetat ditimbang seksama, dimasukkan ke dalam labu ukur 1 L kemudian dilarutkan dengan akuades sampai tanda.
b. Pembuatan larutan asam asetat 0,2 M.
Sebanyak 12,5 mL asam asetat 96 % dipipet, kemudian diencerkan dengan akuades sampai volume 1,0 L.
c. Pembuatan larutan NaOH 1 M.
Ditimbang seksama 0,4 g NaOH kemudian dilarutkan dalam akuades bebas CO2 sampai volume 10,0 mL.
28
d. Pembuatan larutan HCl encer P mengandung HCl 7,3 % b/v (lebih kurang 2 M).
Larutkan 20 g atau 17 mL HCl pekat pada 100 mL akuades. e. Pembuatan larutan pereaksi campuran asetilaseton dan formalin .
Sebanyak 16,0 mL natrium asetat 0,2 M dan 34,0 mL asam asetat 0,2 M dicampur dengan 7,8 mL asetilaseton dan 15,0 mL formalin. Panaskan 5 menit dengan suhu 800C, dinginkan, pH diatur dengan menggunakan pH meter sampai pH yang dikehendaki, kemudian diencerkan dengan akuades sampai 100,0 mL (Patel et al., 1992).
f. Pembuatan larutan baku sefadroksil.
Ditimbang seksama 228,8 mg baku sefadroksil (BM 381,40) kemudian dilarutkan dengan akuades dan diencerkan dalam labu ukur 100 mL, konsentrasi yang diperoleh adalah 0,006 M.
g. Pembuatan larutan blangko
Sebanyak 2,0 mL akuades dimasukkan ke dalam labu ukur 25 mL, ditambahkan larutan pereaksi dengan volume dan pH yang sama dengan volume dan pH yang digunakan untuk penetapan kadar sefadroksil. Diencerkan dengan akuades sampai tanda (Patel et al., 1992).
2. Optimasi penetapan kadar sefadroksil
Suatu metode analisis apabila diaplikasikan pada dua senyawa atau lebih yang memiliki gugus penanggung jawab reaksi yang sama belum tentu memberikan hasil yang serupa, apalagi jika kondisi percobaan yang digunakan berbeda. Oleh
karena itu untuk memperoleh hasil percobaan yang optimal,.maka perlu dilakukan suatu proses optimasi.
Pada penelitian ini dilakukan optimasi berbagai kondisi percobaan meliputi
operating time, pH pereaksi, volume pereaksi, dan panjang gelombang serapan maksimum hasil reaksi antara sefadroksil dengan asetilaseton dan formalin.
a. Penentuan operating time.
Sebanyak 2,0 mL larutan baku sefadroksil 0,006 M dimasukkan ke dalam labu ukur 25 mL, ditambahkan larutan pereaksi pH 4 dengan volume 4 mL. Didiamkan selama rentang waktu tertentu pada suhu 350C. Diencerkan dengan akuades sampai tanda. Diukur serapan larutan pada panjang gelombang 400 nm, sampai diperoleh serapan yang stabil pada rentang waktu tertentu (operating time), dilakukan juga penetapan blangko (Patel et al., 1992).
b. Penentuan nilai pH yang menghasilkan serapan maksimum.
Nilai pH larutan pereaksi dibuat bervariasi, yaitu pH 3, 4, 5, 6, dan 7. Untuk masing-masing nilai pH dipipet sebanyak 4 mL, dimasukkan ke dalam labu ukur 25 mL, ditambahkan 2,0 mL larutan baku sefadroksil 0,006 M, didiamkan selama operating time pada suhu 350C kemudian diencerkan dengan akuades sampai tanda. Diukur serapan larutan pada panjang gelombang 400 nm, dilakukan juga penetapan blangko. Nilai pH optimum adalah pH larutan pereaksi yang menghasilkan serapan maksimum dan stabil (Patel et al., 1992). c. Penentuan volume larutan pereaksi yang menghasilkan serapan maksimum.
Dari larutan pereaksi dengan pH optimum dipipet masing-masing 1; 2; 3; 4; 5; 6; dan 7 mL, dimasukkan ke dalam labu ukur 25 mL, ditambahkan 2,0 mL
30
larutan baku sefadroksil 0,006 M, didiamkan selama operating time pada suhu 350C, dan diencerkan dengan akuades sampai tanda. Diukur serapan larutan pada panjang gelombang 400 nm, dilakukan juga penetapan blangko. Volume optimum adalah volume larutan pereaksi yang menghasilkan serapan maksimum dan stabil (Patel et al., 1992).
d. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum.
Sebanyak 1,0; 1,4; dan 1,8 mL larutan baku sefadroksil 0,006 M masing-masing dimasukkan ke dalam labu ukur 25 mL, ditambahkan larutan pereaksi dengan volume dan pH hasil optimasi. Diamkan selama operating time. Diencerkan dengan akuades sampai tanda. Serapan kemudian dibaca pada panjang gelombang 300-500 nm, dilakukan juga penetapan blangko. Panjang gelombang serapan maksimum adalah panjang gelombang yang memberikan serapan maksimum (Patel et al., 1992).
3. Pembuatan kurva baku
Larutan baku sefadroksil 0,006 M dipipet sebanyak 0,8; 1,0; 1,2; 1,4; dan 1,6 mL, masing- masing dimasukkan ke dalam labu ukur 25 mL, ditambahkan pereaksi dengan pH dan volume hasil optimasi. Didiamkan selama operating time
pada suhu 350C, diencerkan dengan akuades sampai tanda. Diukur serapannya pada panjang gelombang serapan maksimum, dilakukan juga penetapan blangko. Dibuat kurva hubungan konsentrasi baku sefadroksil vs serapan yang dihasilkan dan ditentukan persamaan regresi linier (y = bx + a) serta nilai koefisien korelasinya (r) (Patel et al., 1992).
4. Aplikasi metode spektrofotometri visibel untuk penetapan kadar sefadroksil menggunakan pereaksi asetilaseton dan formalin pada sediaan kapsul sefadroksil 500 mg (dengan merk X)
a. Pengambilan sampel.
Sampel yang digunakan terdiri dari 1 merk kapsul yang beredar di pasaran (merk X) dan mengandung 500 mg sefadroksil. Kapsul sefadroksil yang dipilih adalah kapsul dengan nomor batch yang sama.
b. Penentuan bobot rata-rata kapsul.
Ditimbang 20 kapsul satu per satu. Keluarkan isi kapsul, timbang bagian cangkang kapsul, kemudian hitung bobot isi kapsul dan bobot rata-rata kapsul.
c. Penetapan kadar sefadroksil dalam kapsul.
Ditimbang seksama sejumlah serbuk dari 20 kapsul yang sudah dihomogenkan yang setara dengan 114,4 mg sefadroksil. Dimasukkan ke dalam labu ukur 50 mL, kemudian dilarutkan dan diencerkan dengan akuades sampai tanda. Dipipet 1,0 mL, dimasukkan ke dalam labu ukur 25 mL, ditambahkan pereaksi dengan pH dan volume hasil optimasi. Didiamkan selama operating time pada suhu 350C, diencerkan dengan akuades sampai tanda. Diukur serapannya pada panjang gelombang serapan maksimum, dilakukan juga penetapan blangko Ditentukan besarnya kadar sampel sefadroksil dengan memasukkan nilai serapan yang dihasilkan pada persamaan regresi linear kurva baku y = bx + a (Patel et al.,1992).
32
5. Validasi metode spektrofotometri visibel untuk penetapan kadar sefadroksil menggunakan pereaksi asetilaseton dan formalin
a. Penentuan akurasi baku.
Dari persamaan linear kurva baku (y = bx + a), dapat ditentukan besarnya konsentrasi baku sefadroksil terukur (x) dengan memasukkan nilai serapan sebagai y. Membandingkan nilai konsentrasi baku sefadroksil terukur tersebut dengan konsentasi baku sefadroksil teoritis untuk mendapatkan nilai % recovery baku.
b. Penentuan akurasi sampel.
Ditimbang seksama sampel sefadroksil yang setara dengan 114,4 mg baku sefadroksil, masukan ke dalam labu ukur 100 mL, tambahkan 114,4 mg baku sefadroksil. Kemudian dilarutkan dan diencerkan dengan akuades sampai tanda. Dipipet 1,0 mL, dimasukkan ke dalam labu ukur 25 mL, ditambahkan pereaksi dengan pH dan volume hasil optimasi. Didiamkan selama operating time pada suhu 350 C, diencerkan dengan akuades sampai tanda. Diukur serapannya pada panjang gelombang serapan maksimum, dilakukan juga penetapan blangko. Ditentukan besarnya kadar terukur (x) dengan memasukkan nilai serapan yang dihasilkan (y) pada persamaan regresi linear kurva baku (y = bx + a). Membandingkan nilai kadar terukur tersebut dengan kadar teoritis untuk mendapatkan nilai % recovery sampel. c. Penentuan presisi.
Dari nilai kadar pada penetapan kadar sefadroksil pada sediaan kapsul ditentukan nilai CV untuk masing-masing replikasi. Ditentukan nilai CV rata-rata dari keseluruhan replikasi.
d. Penentuan spesifisitas.
Dilakukan scanning panjang gelombang serapan maksimum baku sefadroksil dan panjang gelombang serapan maksimum senyawa hasil reaksi antara sefadroskil dengan asetilaseton dan formalin. Dilakukan pengamatan terhadap spektrum yang dihasilkan, dan dibandingkan.
e. Penentuan linearitas
Linearitas dapat ditentukan melalui nilai r dan nilai koefisien variasi fungsi (Vx0). Nilai r dapat diperoleh dengan memasukkan data konsentrasi sefadroksil dan serapan dari data penentuan kurva baku ke dalam program regresi linear pada kalkulator. Nilai r ini selanjutnya dibandingkan dengan nilai r tabel pada taraf kepercayaan tertentu. Selain itu, dengan menggunakan data penentuan kurva baku dapat ditentukan juga nilai koefisien variasi fungsi (Vx0).
