BAB II PENELAAHAN PUSTAKA
D. Tata Cara Penelitian
Determinasi daun sirih merah segar dilakukan di Bagian Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta dan dipastikan juga kebenarannya menggunakan acuan baku ( Backer dan Van den Brink, 1965).
2. Pengumpulan daun sirih merah
Bahan yang digunakan berupa daun sirih merah, diambil dari tanaman sirih merah yang tumbuh di Ngangkrik, Sleman, Yogyakarta.
3. Pembuatan fraksi etanol daun sirih merah a. Pembuatan serbuk
Daun sirih merah yang telah dikumpulkan selanjutnya dicuci dengan air mengalir untuk menghilangkan kotoran-kotoran yang melekat, kemudian ditiriskan sampai sisa-sisa air menghilang. Daun kemudian dikeringkan dalam oven dengan suhu 50˚C. Setelah kering, daun diserbuk dengan mesin penyerbuk sampai halus.
b. Pembuatan fraksi etanol daun sirih merah
Serbuk simplisia 100 g ditimbang lalu masukan dalam percolator yang telah diberi kertas saring. Serbuk dalam perkolator direndam dengan 400 ml heksana. Setelah 24 jam hasil rendaman dialirkan dan ditampung dalam labu ukur, dikarekan hasil rendaman masih berwarna hijau pekat maka pelarut heksana ditambahkan hingga
hasil rendaman jernih sebanyak 350 ml. Hasil rendaman diangin-anginkan an didapatkan ekstrak heksana daun sirih merah.
Sisa rendaman serbuk dikeringkan dalam almari pengering dan selajutnya digunakan untuk membuat fraksi etanol daun sirih merah. Serbuk yang telah kering, dimasukan dalam perkolator kembali yang telah diberi kertas penyaring. Serbuk direndam dalam etanol 96% sebanyak 700 ml, setelah 24 jam hasil rendaman dialirkan hingga hasil rendaman jernih. Sisa etanol dihilangkan dengan evaporator dan didapat fraksi kental etanol daun sirih merah. Kandungan senyawa dalam fraksi etanol daun sirih merah diidentifikasi.
4. Identifikasi fraksi etanol daun sirih merah dengan KLT
a. Identiifikasi minyak atsiri (cineol, caryophylen, cavicol, carvacrol)
Fraksi etanol dilarutkan dalam etanol lalu di vortex. Fraksi etanol serta pembanding cineol, caryophylen, cavicol, carvacrol ditotolkan pada silika GF 254, kemudian dimasukkan dalam chamber yang telah jenuh dengan toluene : etil asetat (93 : 3). Elusi ditunggu hingga batas (8,5 cm) kemudian dikeluarkan dari chamber dan ditunggu hingga kering. Disemprot vanillin-sulphuric acid dan dipanaskan untuk identifikasi bercak kemudian dilihat di bawah sinar UV 254 dan 365 nm.
b. Identifikasi flavonoid
Fraksi etanol dilarutkan dalam etanol lalu di vortex. Fraksi etanol dan pembanding rutin ditotolkan pada selulosa, kemudian masukan dalam chamber yang telah jenuh dengan etil asetat : asam asetat : asam
formiat : air (100 : 11 : 11 : 27). Elusi ditunggu hingga batas (8,5 cm) kemudian dikeluarkan dari chamber dan ditungu hingga kering. Uap amonia untuk identifikasi bercak.
c. Identifikasi kinin
Fraksi etanol dilarutkan dalam etanol dan tambahkan ammoniak 10% lalu di vortex dan tambahkan kloroform. Fase kloroform (bagian bawah) dan pembanding kinin ditotolkan pada silika GF254, kemudian masukan dalam chamber yang telah jenuh dengan etil asetat : methanol : air (100 : 13,5 : 10) dan methanol : amoniak (100 : 1,5). Elusi ditunggu hingga batas (8,5 cm) kemudian dikeluarkan dari chamber dan ditungu hingga kering. Disemprot reagen Dragendroff untuk identifikasi bercak.
d. Identifikasi tannin
Fraksi etanol larutkan dalam etanol lalu di vortex. Fraksi etanol dengan pembanding tannin disemprotkan pada siika GF254, masukan dalam chamber yang telah jenuh dengan butanol : asam asetat : air (4 : 1 : 5). Elusi ditunggu hingga batas (8,5 cm) kemudian dikeluarkan dari chamber dan ditungu hingga kering. Disemprot reagen FeCl3 untuk identifikasi bercak.
5. Preparasi sel SiHa a. Propagasi sel SiHa
Sel diambil dari tangki nitrogen cair, kemudian segera dicairkan dalam penangas air 37oC, kemudian ampul disemprot dengan
etanol 70%. Ampul dibuka dan sel SiHa dipindahkan dalam tabung conical steril yang berisi medium RPMI 1640. Suspensi sel disentrifugasi selama 5 menit, supernatan dibuang, diganti dengan medium RPMI yang baru, kemudian disuspensikan perlahan. Suspensi sel lalu disentrifugasi kembali selama 5 menit kemudian dicuci ulang sekali lagi. Supernatan dibuang, lalu endapan sel ditambahkan 1 ml medium penumbuh yang mengandung 10% FBS. Resuspensikan secara perlahan sampai homogen, kemudian sel ditumbuhkan dalam tissue culture flask kecil dan diinkubasikan dalam inkubator dengan suhu 37oC dengan aliran 5% CO2. Setelah 24 jam, medium penumbuh diganti dan sel ditumbuhkan hingga konfluen dan jumlahnya cukup untuk penelitian lebih lanjut (Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979; Sambrook et al, 1989).
b. Panen sel SiHa
Setelah jumlah sel cukup (kurang lebih setelah berumur 7 hari), media diganti dengan RPMI 1640 baru sebanyak 5 ml kemudian sel dilepaskan dari dinding flask dengan tripsin dan diresuspensikan menggunakan pipet Pasteur. Sel dipindahkan dalam tabung conical steril dan ditambahkan medium RPMI sampai volume 10 ml dan disentrifugasi 3000 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang dan pelet sel diresuspensikan perlahan dengan 1 ml medium. Sel kemudian dihitung menggunakan haemocytometer. Suspensi sel ditambah sejumlah medium sehingga memperoleh konsentrasi sel sebesar 2,0x104 sel/100 μl dan siap
dipakai untuk penelitian lebih lanjut (Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979; Sambrook et al, 1989).
6. Pembuatan larutan uji
Fraksi kental ditimbang sebanyak 50 mg, dilarutkan dengan pelarut 200 μl DMSO dan diaduk hingga homogen selanjutnya ditambahkan 800 μl RPMI 1640 untuk mendapatkan sediaan fraksi induk dengan konsentrasi 50 μg/ml.
7. Uji sitotoksisitas fraksi etanol daun sirih merah a. Metode MTT
Untuk uji sitotoksisitas, sebanyak 100 μl suspensi sel SiHa dengan kepadatan 2x104/100 μl dimasukkan ke dalam sumuran 96 well plate yang telah berisi 100 μl fraksi etanol daun sirih merah dengan kadar 2000 μg/ml pada sumuran A1, A2, dan A3 pada baris 1, kemudian pada sumuran B1, B2, dan B3 di baris 2 ditambahkan 100 μl fraksi etanol daun sirih merah pada sumuran yang telah berisi 100 μl suspensi sel SiHa dengan kadar 1000 μg/ml demikian seterusnya hingga diperoleh seri kadar yang terendah yang digunakan dalam penelitian yaitu 0,122 μg/ml. Oleh karena itu terdapat 15 seri kadar. Untuk kontrol digunakan 100 μl suspensi sel SiHa dalam media penumbuh. Selanjutnya 96-well plate diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC, dalam inkubator dengan aliran 5% CO2.
Pada akhir inkubasi, ke dalam masing-masing sumuran ditambahkan 10 μl MTT 5 μg/ml dalam media RPMI 1640, lalu diinkubasikan + 4 jam pada suhu 37oC, dalam inkubator dengan aliran CO2
5%. Sel hidup akan bereaksi dengan MTT dan membentuk warna ungu. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 100 μl reagen stopper pada setiap sumuran dan inkubasi semalam pada suhu kamar. Serapan setiap sumuran dibaca deangan ELISA reader pada panjang gelombang 550 nm. Besarnya serapan berbanding lurus dengan jumlah sel yang hidup.
b. Metode Direct Counting
Seratus μl suspensi sel SiHa dengan kepadatan 2,0x104 sel/ 100 μl dimasukkan ke dalam sumuran pada 96-well plate, ditambah fraksi etanol sirih merah dengan kadar masing-masing sebesar 350 μg/ml, 300 μg/ml, 250 μg/ml, 200 μg/ml, 150 μg/ml, 100 μg/ml, 75 μg/ml. Untuk kontrol digunakan 100 μl suspensi sel SiHa dalam media penumbuh. Selanjutnya plate diinkubasi dalam inkubator dengan aliran 5% CO2 selama 24 jam pada suhu 37oC. Pada akhir masa inkubasi tiap sumuran dibuang 200 μl dan kemudian ditambahkan 100 μl Tripsin dan 100 μl
Trypan blue, diresuspensi lagi untuk homogenisasi diambil 10 μl untuk pengamatan. Ditempatkan dalam haemocytometer, sel siap dihitung dengan counter dibawah mikroskop. Pada uji sitotoksisitas terhadap sel Vero, perlakuan dilakukan sama dengan langkah di atas.
8. Analisis hasil
Uji sitotoksisitas dilakukan dengan menggunakan metode MTT. Pada metode MTT ini, serapan akan terbaca serta menunjukkan jumlah sel yang hidup dan hasil akhir uji sitotosisitas yaitu persentase kematian sel yang dihitung menggunakan rumus berikut:
% 100 % x A B A sel kematian
Keterangan : A = Rata-rata absorbansi kontrol B = Rata-rata absorbansi perlakuan
Selain itu, uji sitotoksisitas dapat dilakukan dengan menggunakan metode perhitungan langsung (direct counting).
% kematian sel ∑ sel hidup ∑ sel mati ∑ sel hidup
∑ sel hidup ∑ sel mati 100% Untuk menghitung harga LC50 dilakukan perhitungan secara statistik menggunakan analisis probit (Mursyidi, 1985). Analisis probit merupakan salah satu analisis regresi untuk mengetahui hubungan konsentrasi-respon (persen kematian sel) agar diperoleh persamaan garis lurus sehingga dapat digunakan untuk menentukan LC50, sedangkan untuk menganalisis signifikansi antara perlakuan dan kontrol dilakukan pengolahan data dengan statistik Z-test.
21
