METODE PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian
E. Tata Cara Penelitian 1. Verifikasi identitas minyak atsiri daun sirih hijau
a. Penentuan bobot jenis
Piknometer dicuci dengan air lalu dicuci lagi dengan etanol, setelah itu dikeringkan dan ditimbang untuk mendapatkan bobot piknometer kosong. Piknometer yang telah ditimbang, diisi air secara perlahan hingga penuh lalu ditutup, piknometer dimasukkan dalam baskom es pada suhu 23˚C lalu dikeluarkan dari baskom dan suhu dikembalikan menjadi 25˚C. Piknometer dilap hingga kering dan ditimbang untuk mendapatkan bobot piknometer yang ditambah bobot air. Volume air dihitung dengan cara bobot air dibagi kerapatan air. Bobot jenis minyak atsiri daun sirih hijau diukur dengan menggunakan piknometer yang telah dikalibrasi. Piknometer diisi minyak atsiri daun sirih hijau hijau hingga penuh lalu ditutup, piknometer dimasukkan dalam baskom es pada suhu 23˚C lalu dikeluarkan dari baskom dan suhu dikembalikan menjadi 25˚C. Piknometer dilap hingga kering dan ditimbang untuk mendapatkan minyak atsiri daun sirih hijau. Bobot minyak atsiri daun sirih hijau diperoleh dari bobot piknometer minyak atsiri daun sirih hijau dikurangi bobot piknometer kosong. Kerapatan minyak atsiri daun sirih hijau diperoleh dari bobot minyak atsiri daun sirih hijau dibagi volume air. Bobot jenis minyak atsiri daun sirih hijau
diperoleh dengan dilakukan perbandingan antara bobot minyak atsiri daun sirih hijau dengan kerapatan minyak atsiri daun sirih hijau. Replikasi pengujian dilakukan 3 kali (Depkes RI, 1995).
b. Penentuan indeks bias
Indeks bias minyak atsiri daun sirih hijau diukur menggunakan refraktometer. Minyak atsiri daun sirih hijau diteteskan pada prisma utama lalu prisma ditutup dan arahkan refraktometer ke cahaya terang sehingga dapat terlihat jelas nilai indeks biasnya. Suhu refraktometer diatur 20˚C dengan cara air dialirkan melalui refraktometer. Suhu harus dijaga dengan toleransi ± 0,2. Nilai indeks bias ditunjukkan oleh skala dimana terdapat garis batas yang memisahkan sisi terang dan gelap pada bagian atas dan bawah. Replikasi pengujian dilakukan 3 kali (Depkes RI, 1995).
2. Uji daya antibakteri minyak atsiri daun sirih hijau a. Pembuatan suspensi Escherichia coli
Sebanyak satu ose koloni bakteri Escherichia coli diambil dari stok bakteri, bakteri dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi media Muller Hinton Broth (MHB) steril dan diinkubasi. Kekeruhan suspensi bakteri Escherichia coli disesuaikan dengan standar 0,5 Mac Farland (Gupte, 2006).
b. Pembuatan kontrol media
Media Muller Hinton Agar (MHA) steril dituang ke dalam cawan petri dan ditunggu hingga memadat. Setelah memadat, cawan petri
diinkubasi. Setelah inkubasi, cawan kontrol diamati dan dibandingkan dengan perlakuan.
c. Pembuatan kontrol pertumbuhan bakteri
Suspensi bakteri dituang dalam cawan petri. Media MHA steril ditambahkan, cawan petri digoyang sehingga pertumbuhan bakteri dapat merata. Cawan petri diinkubasi. Selanjutnya, pertumbuhan bakteri uji diamati melalui kekeruhan media dan dibandingkan dengan perlakuan. d. Uji daya antibakteri gel terhadap Escherichia coli
Suspensi bakteri dituang dalam cawan petri. Media MHA steril ditambahkan, cawan petri digoyang sehingga pertumbuhan bakteri merata. Media dibiarkan memadat lalu diletakkan paper disk berukuran 6 mm yang sebelumnya telah dicelupkan dalam formula gel atau basis. Sebanyak 6 paper disk dalam satu cawan petri mengandung minyak atsiri daun sirih hijau dengan konsentrasi 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, dan kontrol pelarut. Sebanyak 5 paper disk dalam satu cawan petri lainnya mengandung minyak atsiri daun sirih hijau dengan konsentrasi 6%, 7%, 8%, 9%, 10%. Cawan petri diinkubasi. Selanjutnya, diameter zona hambat diukur. Replikasi pengujian dilakukan tiga kali (Kusmiyati, 2006).
3. Formulasi gel hand sanitizer minyak atsiri daun sirih hijau a. Formula gel hand sanitizer minyak atsiri daun sirih hijau
Formula yang digunakan dalam penelitian ini mengacu pada penelitian Sari and Isadiartuti (2006), seperti tersaji pada tabel II berikut.
Tabel II. Formula gel hand sanitizer
Bahan Komposisi
Minyak atsiri daun sirih hijau
Karbopol 940 TEA
Gliserin
Corigen odoris (melon) Natrium metabisulfit Aquadest 25% b/v 0,5% b/v 0,5% b/v 1% b/v 8 tetes 0,2% b/v ad 200 ml
(Sari and Isadiartuti, 2006). Dilakukan modifikasi dan optimasi terhadap formula di atas sehingga dihasilkan formula sebagai berikut :
Tabel III. Modifikasi formula gel hand sanitizer minyak atsiri daun sirih hijau
Bahan Komposisi
F1 Fa Fb Fab
Minyak atsiri daun sirih hijau (g) Karbopol 940 (g) Sorbitol (g) TEA (g) Natrium metabisulfit (g) Aquadest (mL) 10 1 2 2 0,4 200 10 4 2 2 0,4 200 10 1 10 2 0,4 200 10 4 10 2 0,4 200 Keterangan :
F1 : formula dengan karbopol 940 level rendah dan sorbitol level rendah Fa : formula dengan karbopol 940 level tinggi dan sorbitol level rendah Fb : formula dengan karbopol 940 level rendah dan sorbitol level tinggi Fab : formula dengan karbopol 940 level tinggi dan sorbitol level tinggi
b. Pembuatan gel
Karbopol 940 dikembangkan dengan aquadest pada suhu kamar selama 24 jam dengan cara menaburkan karbopol 940 diatas aquadest 200 mL. Natrium metabisulfit yang telah dilarutkan dalam air dan sorbitol dimasukkan ke dalam campuran dan dilakukan pengadukan
dengan menggunakan mixer pada skala 1 selama 1 menit. TEA ditambahkan hingga terbentuk gel dengan diaduk menggunakan mixer dengan skala 1 selama 1 menit, pH yang terbentuk disesuaikan dengan pH kulit manusia. Minyak atsiri daun sirih hijau ditambahkan ke dalam campuran dengan diaduk menggunakan mixer dengan skala 1 selama 1 menit.
4. Uji sifat fisik dan stabilitas gel a. Uji organoleptis
Uji organoleptis dilakukan dengan diamati bau, warna, konsistensi dan homogenitas gel pada 48 jam setelah pembuatan.
b. Uji pH
Uji pH dilakukan dengan bantuan indikator pH dengan dimasukkan ke dalam sediaan gel dan dibandingkan dengan standar. c. Uji daya sebar
Uji daya sebar sediaan gel dilakukan 48 jam setelah pembuatan. Uji daya sebar dilakukan dengan cara 0,5 gram gel ditimbang lalu gel diletakkan ditengah lempeng kaca bulat berskala. Di atas gel diletakkan kaca bulat lainnya dan pemberat sehingga berat kaca bulat dan pemberat 125 gram, didiamkan selama 1 menit, dan dicatat diameter sebarnya (Garg et al, 2002). Uji daya sebar dilakukan dua kali, yaitu dua hari setelah pembuatan gel dan setelah gel disimpan selama 30 hari pada suhu kamar.
d. Uji viskositas
Uji viskositas dilakukan dengan menggunakan alat Viscotester Rion seri VT 04 dengan cara gel dimasukkan ke dalam wadah viscotester hingga hampir penuh. Rotor dibenamkan ke dalam sediaan hingga batas tertentu. Alat viscotester dihidupkan, rotor berputar, jarum penunjuk skala akan bergerak dan menunjukkan besaran nilai viskositas. Nilai viskositas diketahui dengan membaca angka pada skala yang sesuai dengan rotor yang digunakan. Sediaan gel dianggap memiliki stabilitas yang baik jika memiliki persentase pergeseran viskositas kurang dari 10% (Zatz et al, 1996). Uji viskositas dilakukan dua kali, yaitu dua hari setelah pembuatan gel dan setelah gel disimpan selama 30 hari pada suhu kamar (Voight, 1994).
5. Uji daya antibakteri gel hand sanitizer minyak atsiri daun sirih hijau a. Pembuatan suspensi Escherichia coli
Sebanyak satu ose koloni bakteri Escherichia coli diambil dari stok bakteri, bakteri dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi media Muller Hinton Broth (MHB) steril dan diinkubasi. Kekeruhan suspensi bakteri Escherichia coli disesuaikan dengan standar 0,5 Mac Farland (Gupte, 2006).
b. Pembuatan kontrol media
Media Muller Hinton Agar (MHA) steril dituang ke dalam cawan petri dan ditunggu hingga memadat. Setelah memadat, cawan petri
diinkubasi. Setelah inkubasi, cawan kontrol diamati dan dibandingkan dengan perlakuan.
c. Pembuatan kontrol pertumbuhan bakteri
Suspensi bakteri dituang dalam cawan petri. Media MHA steril ditambahkan, cawan petri digoyang sehingga pertumbuhan bakteri dapat merata. Cawan petri diinkubasi. Selanjutnya, pertumbuhan bakteri uji diamati melalui kekeruhan media dan dibandingkan dengan perlakuan. d. Uji daya antibakteri gel terhadap Escherichia coli
Suspensi bakteri dituang dalam cawan petri. Media MHA steril ditambahkan, cawan petri digoyang sehingga pertumbuhan bakteri merata. Media dibiarkan memadat lalu diletakkan paper disk berukuran 6 mm yang sebelumnya telah dicelupkan dalam formula gel (perlakuan) atau basis (kontrol negatif). Sebanyak 5 paper disk diletakkan dalam cawan petri. Setiap paper disk mengandung gel formula F1, formula Fa, formula Fb, formula Fab, dan basis. Cawan petri diinkubasi. Selanjutnya, diameter zona hambat diukur dan dibandingkan dengan kontrol positif. Kontrol positif yang digunakan adalah minyak daun sirih hijau dengan konsentrasi 5% yang sebelumnya telah dilakukan uji aktivitas antibakteri. Replikasi pengujian dilakukan tiga kali (Kusmiyati, 2006).
