BAB III METODE PENELITIAN
E. Tata Cara Penelitian
1. Determinasi Persea americana Mill.
Determinasi kulit Persea americana Mill. dilakukan dengan cara mencocokan ciri-ciri makroskopis kulit Persea americana Mill. yang berasal dari depot es di Yogyakarta dengan literatur yang diperoleh (Agrilink, 2001).
2. Pengumpulan bahan
Bahan uji yang akan digunakan adalah serbuk kulit Persea americana Mill. yang berwarna kuning kecoklatan. Pengumpulan kulit Persea americana Mill. dikumpulkan pada bulan Juni – Juli 2014.
3. Pembuatan serbuk kulit Persea americana Mill.
Kulit Persea americana Mill. dibersihkan dari sisa-sisa daging buah yang menempel lalu di cuci hingga bersih. Setelah itu kulit di potong/ di robek
kecil-kecil dan diangin-anginkan sehingga kulit tidak nampak terlalu basah
lalu dioven pada suhu 50oC selama 24 jam. Setelah kering, kulit dibuat serbuk
dan diayak dengan ayakan no. 40 agar kandungan fitokimia yang terkandung
dalam kulit Persea americana Mill. lebih mudah terekstrak karena luas permukaan serbuk dengan pelarut semakin besar.
4. Penetapan kadar air serbuk kulit Persea americana Mill.
Proses penetapan kadar air serbuk kulit Persea americana Mill. dilakukan dengan menggunakan alat moisture balance. Serbuk ditimbang dan dicatat sebagai bobot sebelum dipanaskan. Lalu serbuk kulit Persea americana Mill. dipanaskan selama 15 menit pada suhu 105˚C. Kemudian
sebelum pemanasan dan sesudah pemanasan merupakan kadar air dari sampel
yang diteliti.
5. Pembuatan infusa kulit Persea americana Mill.
Penelitian ini mengacu pada penelitian Putri (2013) mengenai Efek
Hepatoprotektif Infusa biji Persea americana Mill. terhadap aktivitas ALT-AST serum pada tikus terinduksi karbon tetraklorida yang mana peneliti
tersebut menggunakan 8 gram serbuk dan 116 mL.
Dalam penelitian ini, infusa kulit Persea americana Mill dibuat dengan mengambil sebanyak 8 g serbuk kulit Persea americana Mill. dimasukkan ke dalam panci enamel lalu dibasahi terlebih dahulu dengan 16 mL aqudest lalu
di tambahkan lagi dengan 100,0 mL aquadest. Campuran ini kemudian
dipanaskan diatas heater pada suhu 90oC selama 15 menit. Waktu 15 menit
terhitung pada saat campuran mencapai suhu 90oC. lalu menyiapkan corong
yang telah diberi kain flannel. Kain flannel sebelum di tuang infusa kulit
Persea americana Mill. terlebih dahulu dijenuhkan dengan aquades panas. Setelah itu hasil infusa disaring, diperas dan ditampung dalam labu ukur 100
mL, jika kurang tambahkan aquades panas melalui kain flannel hingga tanda
batas. Infusa kulit Persea americana Mill. dibuat dengan konsentrasi 8%. 6. Pembuatan larutan karbon tetraklorida dengan konsentrasi 50%
Pembuatan larutan karbon tetraklorida konsentrasi 50% didasarkan pada
penelitian Janakat dan Al-Merie (2002) yang mana perbandingan volume
karbon tetraklorida dan olive oil (sebagai pelarut) adalah 1 : 1. Volume karbon tetraklorida dan olive oil dibuat sama pada saat akan dicampurkan.
7. Uji Pendahuluan
a. Penetapan dosis hepatotoksik karbon tetraklorida
Penetapan dosis hepatotoksik karbon tetraklorida didasarkan pda
penelitian Janakat dan Al-Merie (2002) yang menjelaskan bahwa dosis
karbon tetraklorida yang dapat menyebabkan terjadinya hepatotoksik
adalah 2 mL/kgBB. Dosis ini diketahui mampu merusak sel-sel hepar pada
tikus jantan galur Wistar yang ditunjukkan melalui peningkatan aktivitas
ALT-AST tetapi tidak menimbulkan kematian hewan uji. Menurut
penelitian Cao, et.al., (2014) aktivitas serum ALT-AST pada tikus yang terinduksi karbon tetraklorida akan meningkat 3 – 4 kali dari nilai normal. Penelitian Nurcahyanti (2013) menjelaskan peningkatan ALT-AST
sebesar 3 – 5 kali dari kondisi awal mampu menyebabkan terjadinya kerusakan sel pada hati tikus.
b. Penetapan dosis infusa kulit Persea americana Mill.
Berdasarkan penelitian Putri (2013) konsentrasi infusa serbuk biji
Persea americana Mill. yang digunakan sebesar 8g/100mL yang mana akan dilanjutkan pada penelitian ini dengan membuat konsentrasi infusa
kulit Persea americana Mill. sebesar 8%.
Peringkat dosis yang digunakan didasarkan pada pengobatan yang
biasa digunakan pada masyarakat, yaitu sekitar ± 2 sendok makan atau
setara dengan 4 gram serbuk kulit Persea americana Mill. yang direbus dengan 250 ml air. Maka dosis perlakuan yang digunakan adalah 4 g/70
kgBB manusia. Konversi dosis tikus (manusia 70 kg ke tikus 200g) =
0,018.
Dosis untuk 200 g tikus = 0,018 x 4g = 0,72 g/200 g BB = 360 mg/kg BB.
Konsentrasi maksimal infusa kulit Persea americana Mill. yang dibuat adalah 8 g/100 ml, dengan asumsi berat badan maksimal hewan uji adalah
250 g dan volume pemberian maksimal infusa secara p.o = 5 ml.
Berdasarkan perhitungan :
D x 250 g = 8 g/ 100ml x 5 ml
D = 1600 mg/kg BB, dosis ini merupakan dosis tinggi perlakuan. Untuk
mendapatkan dosis tengah perlakuan, terlebih dahulu dihitung faktor
kelipatan dari dosis rendah dan dosis tinggi yang sudah diperoleh.
Perhitungan faktor kelipatan sebagai berikut :
n = jumlah peringkat dosis yang digunakan. Penelitian ini menggunakan 3
peringkat dosis maka n = 3, sehingga perhitungannya sebagai berikut.
= 2,1 (Faktor Kelipatan)
Berdasarkan faktor kelipatan yang diperoleh maka dosis tengah dan dosis
rendah perlakuan ditentukan sebagai berikut :
D = 1600 mg/ kg BB : 2,1 = 761,9 mg/ kg BB (dosis tengah)
c. Penetapan waktu pencuplikan darah
Pada penelitian Janakat dan Al-Merie (2002) dan Nurcahyanti
(2013) menjelaskan bahwa waktu optimum kenaikan serum ALT-AST
terjadi pada waktu 24 jam. Pada penelitian ini dilakukan orientasi dengan
3 cuplikan, yaitu jam 0, 24, dan 48 jam setelah pemejanan karbon
tetraklorida. Hal ini dilakukan untuk melihat profil kenaikan serum ALT.
Dalam orientasi menggunakan tiga kelompok perlakuan waktu dan
disetiap kelompok menggunakan lima ekor tikus. Pengambilan darah
dilakukan melalui sinus orbitalis mata. Lima ekor tikus ini diambil darahnya masing-masing pada jam ke 0, 24, dan 48 jam setelah pemejanan
karbon tetrakorida untuk diukur aktivitas serum ALT.
8. Pengelompokan dan perlakuan hewan uji
Sejumlah tiga puluh ekor tikus dibagi secara acak ke dalam enam
kelompok perlakuan yang masing-masing perlakuan sejumlah lima ekor tikus.
Kelompok I (kontrol hepatotoksin) diberi campuran karbon tetraklorida dan
olive oil (sebagai pelarut) dengan perbandingan 1 : 1 dengan dosis 2 mL/kgBB secara intraperitonial. Kelompok II (Kontrol negatif olive oil) diberi olive oil
sebanyak 2 mL/kgBB secara intraperitonial. Kelompok III (Kontrol Infusa) diberi infusa kulit Persea americana Mill. dosis 1600 mg/kg BB secara per oral selama 6 hari berturut-turut. Kelompok IV (dosis 362,8 mg/kg BB) diberi
infusa kulit Persea americana Mill. secara per oral. Kelompok V (dosis 761,9 mg/kg BB) diberi infusa kulit Persea americana Mill. secara per oral. Kelompok VI (dosis 1600 mg/kg BB) diberi infusa kulit Persea americana
Mill. secara per oral. Semua perlakuan dilakukan sekali sehari selama enam
hari berturut-turut.
Pada hari ke tujuh kelompok perlakuan IV-VI diberi larutan karbon
tetraklorida dosis 2 mL/kg BB secara per oral. Dua puluh empat jam paska di
induksi karbon tetraklorida tikus diambil darahnya melalui sinus orbitalis pada mata, dan diukur aktivitas ALT-AST pada serum.
9. Pembuatan serum
Darah diambil melalui bagian sinus orbitalis mata tikus dan di tampung
dalam tabung Eppendorf. Darah didiamkan selama kurang lebih 15 menit dan disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 15 menit. Kemudian
diambil bagian supernatannya (serum).
10.Pengukuran aktivitas ALT serum pada orientasi
Alat yang digunakan untuk mengukur aktivitas ALT serum adalah
Microlab 200 Merck®. Sebelum melakukan pengukuran sampel, alat di flushing
dengan menggunakan aqua bidestilata selama ± 30 menit.
Analisis fotometri ALT dilakukan dengan cara : 100 µl serum dicampur
dengan 1000 µl reagen I lalu di vortex selama 5 detik, didiamkan selama 2
menit, setelah itu dicampur dengan 250 µl reagen II, kemudian di vortex
selama 5 detik dan dibaca serapan setelah 1 menit. Aktivitas ALT serum
dinyatakan dalam U/L.
Pengukuran aktivitas ALT serum saat orientasi dilakukan di
Yogyakarta dan pengukuran aktivitas ALT-AST serum saat penelitian
dilakukan di Laboratorium Parahita Yogyakarta.
