BAB III METODE PENELITIAN
F. Tata Cara Penelitian
Fase gerak yang digunakan adalah fase gerak yang telah didapat dari
hasil optimasi pada penelitian sebelumnya yaitu etil asetat, metanol, dan amonia
25% (25:4:1).
2. Pembuatan larutan baku
a. Pembuatan stok larutan baku deksametason 0,3 mg/mL. Baku
deksametason ditimbang seksama lebih kurang 37,5 mg, dimasukkan ke dalam
labu takar 10,0 mL dan dilarutkan dengan 5,0 mL etanol, sonifikasi selama 2
menit dan dilanjutkan pengojogan menggunakan vortex selama 2 menit, kemudian
encerkan dengan etanol hingga batas tanda. Setelah itu, larutan tersebut diambil 2
mL, dimasukan ke dalam labu takar 25,0 mL dan diencerkan dengan etanol
sampai batas tanda sehingga diperoleh larutan baku deksametason dengan
konsentrasi 0,3 mg/mL.
b. Pembuatan larutan baku tunggal deksametason. Larutan baku
deksametason 0,3 mg/mL dipipet 3 mL kemudian masing-masing dimasukkan ke
dalam labu takar 10,0 mL dan diencerkan dengan etanol sampai batas tanda,
sehingga diperoleh seri larutan baku deksametason dengan konsentrasi 0,09
mg/mL.
c. Pembuatan stok larutan baku deksklorfeniramin maleat 1 mg/mL.
Baku deksklorfeniramin maleat ditimbang seksama lebih kurang 50 mg,
dimasukkan ke dalam labu takar 10,0 mL dan dilarutkan dengan 5,0 mL etanol,
selama 2 menit, kemudian encerkan dengan etanol hingga batas tanda. Setelah itu,
larutan tersebut diambil 5 mL, dimasukan ke dalam labu takar 25,0 mL dan
diencerkan dengan etanol sampai batas tanda sehingga diperoleh larutan baku
deksklorfeniramin maleat dengan konsentrasi 1 mg/mL.
d. Pembuatan larutan baku tunggal deksklorfeniramin maleat. Larutan
baku deksklorfeniramin maleat 1 mg/mL dipipet 3 mL kemudian masing-masing
dimasukan ke dalam labu takar 10,0 mL dan diencerkan dengan etanol sampai
batas tanda, sehingga diperoleh seri larutan baku deksklorfeniramin maleat
dengan konsentrasi 0,3 mg/mL.
e. Pembuatan seri larutan baku campuran deksametason dan
deksklorfeniramin maleat. Larutan baku deksametason 0,3 mg/mL dan larutan
baku deksklorfeniramin maleat 1 mg/mL masing-masing dipipet 1; 2; 3; 4 dan 5
mL dan masing-masing dimasukan ke dalam labu takar 10,0 mL kemudian
diencerkan dengan etanol sampai tanda batas dan digojog, sehingga diperoleh seri
konsentrasi campuran deksametason : deksklorfeniramin maleat 0,03 : 0,1
mg/mL; 0,06 : 0,2 mg/mL; 0,09 : 0,3 mg/mL; 0,12 : 0,4 mg/mL dan 0,15 : 0,5
mg/mL.
3. Penentuan panjang gelombang pengamatan
Seri larutan baku campuran deksametason : deksklorfeniramin maleat
0,03 : 0,1 mg/mL; 0,09 : 0,3 mg/mL dan 0,15 : 0,5 mg/mL masing-masing
ditotolkan 1 µL dengan menggunakan linomat pada pelat silika gel dengan jarak
antar totolan 0,9 cm. Kemudian pelat dikembangkan didalam bejana kromatografi
dikeluarkan dan dikeringkan selama ± 5 menit dan diukur AUC tiap
masing-masing senyawa kemudian dilakukan pembacaan panjang gelombang 200-450 nm
sehingga diperoleh panjang gelombang overlapping spektra deksametason dan
deksklorfeniramin maleat.
4. Pembuatan kurva baku
Seri larutan baku campuran deksametason : deksklorfeniramin maleat
0,03 : 100 mg/mL; 0,06 : 0,2 mg/mL; 0,09 : 0,3 mg/mL; 0,12 : 0,4 mg/mL dan
0,15 : 0,5 mg/mL ditotolkan 1 µL dengan menggunakan linomat pada pelat silika
gel dengan jarak antar totolan 0,9 cm. Kemudian pelat dikembangkan di dalam
bejana kromatografi (Camag®) yang telah dijenuhkan. Pengembangan dilakukan
setinggi 5 cm. Pelat dikeluarkan dan dikeringkan selama ± 5 menit dan diukur
AUC tiap masing-masing senyawa (deksametason dan deksklorfeniramin maleat
akan memisah) menggunakan densitometer pada panjang gelombang pengamatan.
Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali. Dipilih persamaan kurva baku dengan nilai
r2 ≥ 0.997 untuk kurva baku deksametason dan kurva baku deksklorfeniramin
maleat.
5. Penentuan recovery dan Koefisien Variasi (KV) baku campuran
Seri larutan baku campuran deksametason : deksklorfeniramin maleat
0,03 : 0,1 mg/mL; 0,09 : 0,3 mg/mL dan 0,15 : 0,5 mg/mL ditotolkan sebanyak 1
µL dengan menggunakan linomat pada pelat silika gel dengan jarak antar totolan
0,9 cm. Kemudian pelat dikembangkan dalam bejana kromatografi yang telah
dijenuhkan oleh fase gerak. Pengembangan dilakukan setinggi 5 cm. Pelat
menggunakan densitometer pada panjang gelombang pengamatan. Nilai AUC
yang didapat dimasukkan ke dalam persamaan kurva baku yang telah dibuat
sebelumnya, sehingga didapatkan jumlah deksametason dan deksklorfeniramin
maleat yang kemudian dapat digunakan untuk menghitung %recovery dan %KV.
Penelitian dilakukan selama 2 periode, dimana tiap periode dilakukan paling lama
4 hari dan di replikasi sebanyak 3 kali.
6. Penentuan recovery dan Koefisien Variasi (KV) dengan adisi baku dalam sampel
a. Preparasi sampel kaplet. 20 kaplet yang setara dengan 0,5 mg
deksametason dan 2 mg deksklorfeniramin maleat digerus dalam mortir hingga
homogen.
b. Pembuatan larutan stok baku adisi. Timbang dengan seksama lebih
kurang 10 mg baku deksametason dan 40 mg baku deksklorfeniramin maleat
masukan ke dalam labu takar 10,0 mL dan larutkan dengan 5,0 mL etanol,
sonifikasi larutan selama 2 menit dan dilanjutkan penggojogan menggunakan
vortex selama 2 menit, kemudian encerkan dengan etanol hingga batas tanda dan
vortex, sehingga diperoleh larutan stok baku campuran deksametason konsentrasi
1 mg/mL atau setara dengan 1000 ppm dan deksklorfeniramin maleat konsentrasi
4 mg/mL atau setara dengan 4000 ppm.
c. Pembuatan larutan intermediet baku adisi (LA). Pipet 1,0 mL larutan
stok baku campuran deksametason (1 mg/mL) : deksklorfeniramin maleat (4
mg/mL), masukan ke dalam labu takar 10,0 mL dan diencerkan dengan etanol
peroleh larutan intermediet baku campuran deksametason dengan konsentrasi 0,1
mg/mL atau setara dengan 100 ppm dan deksklorfeniramin maleat konsentrasi 0,4
mg/mL atau setara dengan 400 ppm.
d. Pembuatan larutan sampel tanpa penambahan baku deksametason dan
deksklorfeniramin maleat (LB). Timbang dengan seksama lebih kurang 90 mg
sampel yang telah dihomogenkan, masukkan ke dalam labu takar 10,0 mL dan
larutkan dengan 5,0 mL etanol, sonifikasi larutan selama 2 menit dilanjutkan
dengan penggojogan menggunakan vortex selama 15 menit, kemudian larutan
diencerkan dengan etanol hingga batas tanda, gojog dengan vortex dan saring
menggunakan kertas saring. Replikasi dilakukan sebanyak 9 kali.
e. Pembuatan larutan sampel dengan penambahan baku deksametason
dan deksklorfeniramin maleat (LC). Timbang dengan seksama lebih kurang 90 mg
sampel yang telah dihomogenkan, masukkan ke dalam labu takar 10,0 mL dan
tambahkan dengan 1,0 ; 2,0 dan 3,0 mL larutan baku intermediet adisi (LA) pada
masing-masing labu takar, sonifikasi larutan selama 2 menit dilanjutkan dengan
penggojogan menggunakan vortex selama 15 menit, kemudian larutan diencerkan
dengan etanol hingga batas tanda, gojog dengan vortex dan saring menggunakan
kertas saring, sehingga didapat konsentrasi baku campuran deksametason dan
deksklorfeniramin maleat yang ditambahkan yaitu 0,01 : 0,04 mg/mL; 0,02 : 0,08
mg/mL dan 0,03 : 0,12 mg/mL. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali pada tiap
konsentrasi.
f. Pengembangan dan pengukuran. LB, dan LC ditotolkan sebanyak 1 µL
kemudian pelat dikembangkan dalam bejana kromatografi yang telah jenuh oleh
fase gerak. Pengembangan dilakukan setinggi 5 cm. Pelat dikeluarkan dan
dikeringkan selama ± 5 menit dan scanning menggunakan densitometer pada
panjang gelombang pengamatan. Nilai AUC yang didapat dimasukkan ke dalam
persamaan kurva baku yang telah dibuat sebelumnya, sehingga didapatkan jumlah
deksametason dan deksklorfeniramin maleat yang ditambahkan, sehingga dapat
digunakan untuk menghitung %recovery dan %KV.
G. Analisis Hasil