VALIDASI METODE KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS DENSITOMETRI PADA PENETAPAN KADAR CAMPURAN DEKSAMETASON DAN
DEKSKLORFENIRAMIN MALEAT DALAM KAPLET
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Metri Setyadhiani Karunawati
NIM : 098114103
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA
i
VALIDASI METODE KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS DENSITOMETRI PADA PENETAPAN KADAR CAMPURAN DEKSAMETASON DAN
DEKSKLORFENIRAMIN MALEAT DALAM KAPLET Halaman judul
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Metri Setyadhiani Karunawati
NIM : 098114103
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA
ii
iii
iv
HALAMAN PERSEMBAHAN
z
Kupersembahkan karya ini untuk:
Kedua orangtuaku,
v
vi
vii
PRAKATA
Puji dan syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa atas segala berkat,
anugerah dan penyertaan yang telah diberikan-Nya, sehingga penulis dapat
menyelesaikan skripsi yang berjudul Validasi Metode Kromatografi Lapis Tipis
(KLT)-Densitometri pada Penetapan Kadar Campuran Deksametason dan
Deksklorfeniramin Maleat dalam Kaplet. Dimana skripsi ini disusun sebagai salah
satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm).
Penyusunan skripsi ini telah mendapatkan dukungan dari berbagai pihak
baik bimbingan, semangat, kritik, dan saran yang membangun. Oleh karena itu,
pada kesempatan ini penulis ingin menyampaikan ucapan terima kasih yang
sebesar-besarnya kepada:
1. Bapak Ipang Djunarko, M.Sc., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma.
2. Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt., selaku dosen pembimbing atas segala
bimbingan, perhatian, kesabaran, semangat, kritik, dan saran selama
penelitian dan penyusunan naskah.
3. Ibu Dra. M.M. Yetty Tjandrawati, M.Si., selaku dosen pendamping
pembimbing skripsi dan selaku dosen pembimbing akademik (DPA) atas
segala pendampingannya baik dari semester satu hingga penyusunan skripsi.
4. Jeffry Julianus, M.Si., selaku dosen penguji atas segala arahan, masukan,
kritik, dan saran yang telah diberikan kepada penulis.
5. Lucia Wiwid Wijayanti M.Si., selaku dosen penguji atas segala arahan,
viii
6. Ibu Rini Dwiastuti, M.Sc., Apt., selaku Kepala Laboratorium Fakultas
Farmasi Universitas Sanata Dharma atas ijin yang diberikan untuk melakukan
penelitian di laboratorium Kimia Analisis Instrumental.
7. Segenap dosen dan karyawan atas ilmu dan pengalaman yang diberikan,
sehingga berguna dalam penyusunan skripsi ini.
8. Pihak PT Konimex atas pemberian baku deksametason sebagai bahan
penelitian.
9. Pihak PT Ifars Pharmaceutical Laboratories atas pemberian baku
deksklorfeniramin maleat sebagai bahan penelitian.
10. Mas Bimo, Mas Parlan, Mas Kunto, selaku laboran yang telah banyak
membantu penulis selama penelitian di laboratorium.
11. Pak Otok, atas bantuannya dalam pengadaan bahan-bahan yang diperlukan
selama penelitian.
12. Shinta dan Sashya sebagai teman seperjuangan satu judul dalam penyelesaian
penelitian ini, atas kebersamaan, semangat, keceriaan, nasehat, dan
dukungannya selama penelitian di laboratorium dan kuliah.
13. Marimar, Novia, Chen2, Nindy, Is sumitro, Mike, Bahok, Anta, Adel, Lia
susanti untuk kebersamaan, keceriaan, semangat, dan dukungan selama
kuliah semester satu hingga saat ini
14. Mbah Rina, tante kekar, kutil, john, ci ana, berta, mayke, gendut, sefi, ita,
esty, eni, double dewi, geka, seruni, intan, deby, dan sesepuh amakusa
sebagai teman satu kost, atas segala kebersamaan, keceriaan, kenyamanan
ix
15. Ci lele, Ci sasa untuk kebersamaan, keceriaan dan semangat yang diberikan
selama ini.
16. Teman-teman kelas FST B 2009 dan teman-teman angkatan 2009 atas
semangat, kerja sama, dan kebersamaannya selama ini.
17. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu oleh penulis, terima
kasih atas segala bantuan yang telah diberikan selama ini, sehingga penulis
dapat menyelesaikan skrispi ini.
Penulis menyadari masih banyak kekurangan di dalam penulisan skripsi
ini. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun
untuk perkembangan selanjutnya.
x
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL ... i
PERSETUJUAN PEMBIMBING ... ii
PENGESAHAN SKRIPSI BERJUDUL ... iii
HALAMAN PERSEMBAHAN ... iv
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ... v
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS ... v
PRAKATA ... vi
DAFTAR ISI ... x
DAFTAR TABEL ... xiv
DAFTAR GAMBAR ... xv
DAFTAR LAMPIRAN ... xvii
INTISARI ... xviii
ABSTRACT ... xix
BAB I PENGANTAR ... 1
A. Latar Belakang ... 1
1. Permasalahan ... 3
2. Keaslian penelitian ... 3
xi
B. Tujuan ... 4
BAB II PENELAAHAN PUSTAKA ... 5
A. Deksametason ... 5
B. Deksklorfeniramin Maleat ... 6
C. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) ... 7
D. Fase Diam ... 7
E. Densitometri ... 9
F. Analisis Kualitatif ... 10
G. Validasi Metode ... 11
1. Akurasi. ... 11
2. Presisi. ... 12
3. Selektivitas ... 13
4. Linearitas ... 13
5. Range ... 13
H. Landasan Teori ... 14
I. Hipotesis ... 14
BAB III METODE PENELITIAN ... 15
A. Jenis dan Rancangan Penelitian ... 15
B. Variabel Penelitian ... 15
1. Variabel bebas ... 15
2. Variabel tergantung ... 15
xii
C. Definisi Operasional ... 16
D. Bahan Penelitian ... 16
E. Alat Penelitian ... 16
F. Tata Cara Penelitian ... 17
1. Pembuatan fase gerak ... 17
2. Pembuatan larutan baku ... 17
3. Penentuan panjang gelombang pengamatan ... 18
4. Pembuatan kurva baku ... 19
5. Penentuan recovery dan Koefisien Variasi (KV) baku campuran... 19
6. Penentuan recovery dan Koefisien Variasi (KV) dengan adisi baku ... 20
G. Analisis Hasil ... 22
1. Selektivitas ... 22
2. Linearitas ... 22
3. Akurasi ... 23
4. Akurasi adisi baku dalam matriks sampel ... 23
5. Presisi ... 23
6. Range ... 24
BAB IV PEMBAHASAN ... 25
A. Pembuatan Fase Gerak ... 25
B. Pembuatan Larutan Baku ... 26
C. Penetapan Panjang Gelombang Pengamatan ... 27
D. Analisis Kualitatif ... 29
xiii
F. Validasi Metode Analisis ... 37
1. Selektivitas ... 37
2. Linearitas ... 38
3. Akurasi ... 39
4. Presisi ... 41
5. Range ... 42
6. Penentuan akurasi dan presisi adisi baku dalam sampel ... 43
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ... 45
A. Kesimpulan ... 45
B. Saran ... 45
DAFTAR PUSTAKA ... 46
LAMPIRAN ... 49
xiv
DAFTAR TABEL
Tabel I. Parameter analisis dalam validasi metode analisis ... 11
Tabel II. Kriteria rentang recovery yang dapat diterima ... 12
Tabel III. Kriteria Penerimaan %RSD dari ketentuan Horwitz dan
ketentuan AOAC Peer Verified Methods (PVM) berdasarkan
kadar analit ... 12
Tabel IV. Data Penentuan Kurva Baku Deksametason ... 34
Tabel V. Data Penentuan Kurva Baku Deksklorfeniramin Maleat ... 35
Tabel VI. Data nilai resolusi baku campuran deksametason dan
deksklorfeniramin maleat ... 38
Tabel VII. Data nilai resolusi sampel ... 38
Tabel VIII. Data % recovery baku campuran deksametason dan
deksklorfeniramin maleat periode ke-1 dan 2 ... 40
Tabel IX. Data %KV baku campuran deksametason dan
deksklorfeniramin maleat periode ke-1 dan 2 ... 42
xv
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Struktur Deksametason ... 5
Gambar 2. Struktur Deksklorfeniramin Maleat ... 6
Gambar 3. Struktur Silika Gel ... 8
Gambar 4. Densitometer dan Autosampler ... 9
Gambar 5. Diagram skematis densitometer ... 10
Gambar 6. Perpotongan Spektra Deksametason (A) dan Deksklorfeniramin maleat (B) dalam pelarut etanol ... 28
Gambar 7. Bagian kromofor deksametason ... 29
Gambar 8. Bagian kromofor dan auksokrom deksklorfeniramin maleat ... 29
Gambar 9. Densitogram baku tunggal deksametason ... 30
Gambar 10. Densitogram baku tunggal deksklorfeniramin maleat ... 30
Gambar 11. Densitogram sampel tanpa penambahan baku ... 30
Gambar 12. Densitogram sampel dengan penambahan baku ... 31
Gambar 13. Pola Spektra baku tunggal deksametason ... 32
Gambar 14. Pola Spektra baku tunggal deksklorfeniramin maleat... 32
Gambar 15. Pola Spektra sampel tanpa penambahan baku ... 33
Gambar 16. Pola Spektra Sampel dengan penambahan baku ... 33
xvi
Gambar 18. Kurva hubungan konsentrasi dan AUC Deksklorfeniramin
maleat 3 replikasi ... 35
Gambar 19. Kurva hubungan konsentrasi dan AUC Deksametason ... 36
Gambar 20. Kurva hubungan konsentrasi dan AUC Deksklorfeniramin
xvii
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. COA (Certificate of Analysis) Deksametason ... 50
Lampiran 2. COA (Certificate Of Analysis) Deksklorfeniramin Maleat ... 51
Lampiran 3. Data penimbangan bahan ... 52
Lampiran 4. Spektra deksametason (0,03 ; 0,06 ; 0,09 mg/mL) dan
deksklorfeniramin maleat (0,1 ; 0,3 ; 0,5 mg/mL) ... 54
Lampiran 5. Penentuan kurva baku deksametason dan
deksklorfeniramin maleat ... 54
Lampiran 6. Contoh perhitungan nilai resolusi ... 60
Lampiran 7. Densitogram presisi dan akurasi baku campuran
deksametason : deksklorfeniramin maleat periode ke-1 ... 60
Lampiran 8. Presisi dan akurasi baku campuran deksametason :
deksklorfeniramin maleat periode ke-1... 63
Lampiran 9. Densitogram presisi dan akurasi baku campuran
deksametason : deksklorfeniramin maleat periode ke-2 ... 68
Lampiran 10. Presisi dan akurasi baku campuran deksametason :
deksklorfeniramin maleat periode ke-2... 71
Lampiran 11. Densitogram sampel tanpa penambahan ... 73
Lampiran12. Densitogram sampel dengan penambahan baku
deksametason : deksklorfeniramin maleat ... 76
Lampiran 13. Presisi akurasi adisi baku deksametason dalam sampel ... 79
Lampiran 14. Presisi akurasi adisi baku deksklorfeniramin maleat dalam
xviii
INTISARI
Penjaminan mutu suatu obat sangatlah penting, karena berkaitan dengan penggunaan obat secara tepat, lengkap dan obyektif. Salah satu penjaminan mutu obat yaitu kesesuaian antara klaim label dengan kadar obat sebenarnya. Untuk menetapkan kadar obat diperlukan suatu metode yang sudah tervalidasi. Tujuan penelitian ini adalah membuktikan metode KLT Densitometri yang akan digunakan untuk melakukan penetapan kadar campuran deksametason dan deksklorfeniramin maleat dalam kaplet memenuhi parameter-parameter validasi.
Metode yang digunakan yaitu Kromatografi Lapis Tipis (KLT)-densitometri dengan fase diam silika gel 60 F254 dan fase gerak etil asetat :
metanol : amonia 25% dengan perbandingan (25 : 4 : 1), dengan jarak pengembangan 5 cm dan panjang gelombang ( ) 262 nm.
Berdasarkan hasil penelitian yang dilakukan, metode ini memenuhi parameter selektivitas, linearitas, akurasi, presisi dan range. Nilai Rs > 1,5 menunjukan metode memenuhi parameter selektivitas. Lineritas deksametason memiliki nilai r2=0,999 dan 0,999 untuk linearitas deksklorfeniramin maleat. Akurasi dan presisi campuran deksametason dan deksklorfeniramin maleat pada konsentrasi rendah (30 : 100 ppm), sedang (90 : 300 ppm) dan tinggi (150 : 500 ppm) yang dilakukan selama 2 periode memenuhi persyaratan presisi inter-day, dimana semua konsentrasi memiliki % recovery dan % KV yang memenuhi parameter akurasi dan presisi.
xix
ABSTRACT
Quality assurance of a drug is important, for it is related to complete and objective drug usage. One of the drug quality assurance is correspondence between label claims and actual drug levels. To determine drug levels, a validated method is required. The aim of this study is to show that TLC-densitometry method meets the validation parameters and can be used to perform the assay mixture of dexamethasone and dexchlorpheramine maleate in kaplet.
The method that is used is Thin Layer Chromatography (TLC)-densitometry with silica gel 60 F254 as the stationary phase, ethyl acetate:
methanol: ammonia 25% (25: 4: 1) as the mobile phase, 5 cm development distance and UV detector at wavelength ( ) 262 nm.
Based on the results of research, this method meets the parameters selectivity, linearity, accuracy, precision and range. Rs value > 1.5 indicates that the method meets the selectivity parameter. Dexamethasone linearity has r2 value 0.999 and 0.999 for dexchlorpheniramin maleate linearity. Accuracy and precision of dexamethasone and deksklorfeniramine maleate mixture at low concentrations (30: 100 ppm), medium (90: 300 ppm) and high (150: 500 ppm) that were performed in 2 periods meet the requirements of inter-day precision, where all concentrations have % recovery and % KV that meets the accuracy and precision parameters.
1
BAB I PENGANTAR
A. Latar Belakang
Berdasarkan data dari World Allergy Organization (WAO) 2011
menunjukkan bahwa prevalensi alergi terus meningkat dengan angka 30-40
persen dari total populasi dunia. Data tersebut sejalan dengan data dari Center for
Disease Control and Prevention (CDC) yang mencatat bahwa angka kejadian
alergi meningkat tiga kali lipat sejak 1993 hingga 2006. Di Indonesia, beberapa
peneliti juga memperkirakan bahwa peningkatan kasus alergi mencapai 30 persen
per tahunnya (Pdpersi, 2012).
Campuran deksklorfeniramin maleat dan deksametason merupakan salah
satu obat yang telah beredar untuk mengatasi berbagai menifestasi reaksi alergi.
Dengan beredarnya suatu obat ke masyarakat luas, maka penjaminan mutu obat
sangatlah penting. Salah satu penilaian mutu obat adalah kesesuaian antara klaim
label, yang dalam hal ini kadar zat aktif obat yang tertera pada label, dengan kadar
sebenarnya. Hal ini berguna untuk memastikan bahwa informasi yang tercantum
pada label obat (etiket/brosur/kemasan) adalah informasi yang lengkap dan
obyektif, yang dapat menjamin penggunaan obat secara tepat, rasional dan aman.
Menurut Keputusan Kepala Badan Pengawasan Obat dan Makanan Republik
Indonesia nomor hk.04.1.23.11.11.09219 tahun 2011 tentang penerapan sistem
pada pengawasan post market salah satunya yaitu pengawasan promosi dan
penandaan/label obat dan makanan. Pengawasan ini meliputi pengambilan sampel
(sampling) dan pengujian terkait kesesuaian terhadap kadar obat dan monitoring
konsistensi informasi dalam label/penandaan obat (BPOM, 2011).
Untuk menguji kesesuaian kadar sebenarnya dengan klaim label,
diperlukan suatu metode untuk menetapkan kadar. Dalam sediaan yang akan diuji
terdapat dua senyawa yang akan ditetapkan kadarnya yaitu deksametason dan
deksklorfeniramin maleat. Kromatografi lapis tipis (KLT)-densitometri dapat
digunakan untuk menetapkan kadar deksametason dan deksklorfeniramin maleat,
dimana metode KLT-densitometri dapat memisahkan kedua senyawa dan dapat
digunakan untuk analisis kualitatif dan kuantitatif.
Metode KLT-densitometri dapat digunakan untuk analisis obat di
laboratorium farmasi, karena metodenya cepat, dapat digunakan untuk analisis
preparatif, kualitatif serta kuantitatif dan hanya memerlukan jumlah cuplikan yang
sedikit. Metode analisis KLT-densitometri ini dapat digunakan untuk analisis
preparatif, kualitatif dan kuantitatif, secara preparatif metode ini akan
memisahkan senyawa campuran, sedangkan secara kualitatif dapat digunakan
untuk menentukan nilai Rf (retardation factor), dimana nilai Rf tersebut dapat
digunakan sebagai pembanding nilai bercak pada baku dan bercak sampel. Selain
itu, secara kuantitatif metode ini dapat menentukan kadar masing-masing
komponen campuran, nilai resolusi, nilai CV dan recovery yang menggambarkan
Sebelum digunakan untuk penetapan kadar, metode yang dipilih harus
divalidasi terlebih dahulu. Parameter validasi berdasarkan prosedur analisis
kategori 1 meliputi selektivitas, linearitas, akurasi, presisi dan range. Validasi
dilakukan agar hasil yang didapat merupakan hasil yang valid atau dapat
dipercaya, karena validasi merupakan kebutuhan dasar untuk menjamin kualitas
dan reliabel hasil dalam aplikasi analitis (Ermer dan Miller, 2005).
1. Permasalahan
Apakah metode KLT-densitometri untuk penetapan kadar deksametason
dan deksklorfeniramin maleat dalam campuran memenuhi parameter-parameter
validasi kategori 1 yang meliputi selektivitas, linearitas, akurasi, presisi, dan
range?
2. Keaslian penelitian
Beberapa penetapan kadar deksametason dan deksklorfeniramin maleat
dalam campuran yang pernah dilakukan yaitu penetapan kadar deksklorfeniramin
maleat dan deksametason dalam tablet dengan metode Kromatografi Cair Kinerja
Tinggi (KCKT) sudah pernah dilakukan oleh Syarif (2009). Penetapan kadar
deksametason secara tunggal dengan metode Kromatografi Lapis Tipis dan
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) telah dilakukan oleh Huetos dan
Ramos (1999). Penetapan kadar deksametason dalam ointment dengan metode
kromatografi lapis tipis densitometri oleh Krzek, Maslanka dan Lipner (2005).
Penelitian yang dilakukan oleh penulis adalah melakukan validasi metode
maleat dalam kaplet yang belum pernah dilakukan pada penelitian sebelumnya,
dimana KLT-densitometri memiliki metode yang cepat, dapat digunakan untuk
analisis preparatif, kualitatif serta kuantitatif dan hanya memerlukan jumlah
cuplikan yang sedikit.
3. Manfaat penelitian
a. Manfaat metodologis. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan
sumbangan ilmiah tentang penggunaan metode KLT-densitometri pada penetapan
kadar deksametason dan deksklorfeniramin maleat dalam kaplet.
b. Manfaat praktis. Hasil penelitian diharapkan dapat memberikan
informasi mengenai selektivitas, linearitas, akurasi, presisi, dan range metode
KLT-densitometri untuk penetapan kadar campuran deksametason dan
deksklorfeniramin maleat dalam sampel kaplet X®.
B. Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk membuktikan bahwa metode
KLT-densitometri telah memenuhi parameter-parameter validasi kategori 1 yaitu
selektivitas, linearitas, akurasi, presisi, dan range, sehingga dapat digunakan
untuk penetapan kadar campuran deksametason dan deksklorfeniramin maleat
5
BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
A. Deksametason
Deksametason memiliki pemerian yaitu serbuk hablur, putih sampai
praktis putih, tidak berbau, stabil di udara, melebur pada suhu lebih kurang 250oC
disertai peruraian. Kelarutan deksametason yaitu: praktis tidak larut dalam air,
agak sukar larut dalam aseton, dalam etanol, dalam dioksan dan dalam metanol,
sukar larut dalam kloroform, sangat sukar larut dalam eter (Direktorat Jenderal
Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995).
Gambar 1. Struktur Deksametason
Deksametason merupakan salah satu kortikosteroid sintetis.
Kemampuannya dalam menanggulangi peradangan dan alergi kurang lebih
sepuluh kali lebih hebat dari pada yang dimiliki prednison (Katzung, 1998).
Penggunaan deksametason antara lain pada terapi artritis reumatoid,
sistemik lupus eritematosus, rinitis alergika, asma, leukemia, limpoma, anemia
hemolitik atau autoimun, selain itu deksametason dapat digunakan untuk
deksametason antara lain terjadinya insomnia, osteoporosis, retensi cairan tubuh,
glaukoma dan lain-lain (Suherman, 2007).
B. Deksklorfeniramin Maleat
Pemerian pada deksklorfeniramin maleat yaitu serbuk hablur, putih, tidak
berbau sedangkan kelarutannya diketahui mudah larut dalam air, larut dalam
etanol dan dalam kloroform, sukar larut dalam benzen dan dalam eter (Direktorat
Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995).
Gambar 2. Struktur Deksklorfeniramin Maleat
Mekanisme kerja dari deksklorfeniramin maleat yaitu memblokir
reseptor-H1 dan bersaing dengan histamin pada reseptornya di otot polos dinding
pembuluh dan dengan demikian menghindarkan timbulnya reaksi alergi. Khasiat
lainnya menyempitkan bronchi, saluran cerna, kandung kemih dan rahim (Tjay
dan Rahardja, 2002).
Deksklorfeniramin maleat merupakan obat yang menentang kerja
histamin pada H1 reseptor histamin berguna dalam menekan alergi yang
C. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Prinsip kromatogarfi lapis tipis yaitu memisahkan komponen-komponen
campuran atas dasar perbedaan adsorpsi atau partisi oleh fase diam di bawah
gerakan pelarut pengembang (Mulja dan Suharman, 1995). Fase gerak yang
digunakan harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT
merupakan teknik yang sensitif. Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian
rupa, sehingga nilai Rf terletak antara 0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan
(Gandjar dan Rohman, 2007).
Selama pemisahan dalam sistem kromatografi terjadi proses sorpsi dan
desorpi. Sorpsi merupakan proses pemindahan solut dari fase gerak ke fase diam,
sementara itu proses sebaliknya (pemindahan solut dari fase diam ke fase gerak)
disebut dengan desorpsi. Ada 4 jenis mekanisme sorpsi dasar dan umumnya 2
atau lebih mekanisme ini terlibat dalam satu jenis kromatografi. Keempat jenis
tersebut yaitu adsorpsi, partisi, pertukaran ion, dan eksklusi ukuran. Pada sistem
kromatografi lapis tipis mekanisme yang terjadi yaitu adsorpsi (Gandjar dan
Rohman, 2007).
D. Fase Diam
Sejauh ini silika gel merupakan fase diam KLT paling penting dimana
pembuatannya menggunakan presipitasi asam dari larutan natrium silika
(Na2SiO3). Karakteristik sorpsi dari silika gel yaitu terletak pada permukaan
gugus silanol (SiOH) yang mana bersifat asam lemah. Silika gel dapat mengikat
dengan pemanasan 120oC, sedangkan pada suhu di atas 200oC air dapat hilang
secara irreversible dan ketika dipanaskan lebih dari 1000oC akan menghilangkan
aktivitas karena gugus silanol menghilang. Untuk itu disarankan pemanasan silika
gel tidak lebih dari 180oC (Spangenberg, 2010).
Gambar 3. Struktur Silika Gel (Habtemariam, 2013)
Lapisan Silika gel sering diresapi berbagai senyawa kimia dengan cara
dicelupkan, disemprot atau ditambahkan dalam fase gerak namun yang sering
dilakukan yaitu dengan ditambahkan pada fase gerak. Gugus silanol yang terletak
pada permukaan silika merupakan gugus yang reaktif yang mampu bereaksi
dengan reagen organosilane sehingga terjadi modifikasi yang mampu memperluas
cakupan aplikasi. Polimer organik yang digunakan sebagai pengikat (binder)
dapat menstabilkan lapisan. Untuk meningkatkan stabilitas, gugus NH2, CN dan
diol diikatkan ke matrik silika gel melalui gugus n-propyl (-CH2-CH2-CH2-)
E. Densitometri
Teknik kuantitasi dapat didasarkan atas pengukuran intensitas sinar yang
diserap (absorbsi), intensitas sinar yang dipantulkan (reflektansi), atau intensitas
sinar yang difluoresensikan (fluoresensi). Disini biasanya dipilih sinar pada
panjang gelombang yang diserap atau dipantulkan paling banyak oleh noda yang
diteliti. Banyaknya sinar yang direfleksikan akan ditangkap paling banyak oleh
suatu alat yang disebut reflection photomultiplier yang akan diteruskan ke
pencatat atau rekorder untuk diubah menjadi suatu puncak atau kromatogram
(Mintarsih, 1990).
Gambar 4. Densitometer dan Autosampler (Wall, 2005)
Monokromator digunakan untuk memilih panjang gelombang yang
cocok, sistem untuk memfokuskan sinar pada lempeng, pengganda foton, dan
rekorder. Densitometer dapat bekerja secara serapan atau fluoresensi, dalam
sistem serapan terdapat dua model yaitu pantulan dan transmisi. Cara pantulan
dapat digunakan untuk sinar tampak maupun ultraviolet sedangkan transmisi
Gambar 5. Diagram skematis densitometer (Scott, 2009)
F. Analisis Kualitatif
Analisis kualitatif dapat dilakukan melalui 3 pendekatan :
1) Perbandingan antara retensi solut yang tidak diketahui dengan retensi baku
yang sesuai pada kondisi yang sama.
2) Dengan cara spiking, dilakukan dengan menambah sampel yang mengandung
senyawa tertentu yang akan diselidiki dengan senyawa baku pada kondisi
kromatogram yang sama, maka akan terjadi perbedaan tinggi atau luas peak
antara sampel dengan sampel yang telah ditambah baku.
3) Menggabungkan alat kromatografi dengan spektrometer massa
Identifikasi dengan hanya menggunakan data retensi pada satu kondisi
kromatografi tidak selalu menghasilkan data yang reliabel (Gandjar dan Rohman,
G. Validasi Metode
Tujuan utama validasi metode adalah menjamin bahwa metode analisis
yang digunakan dapat memberikan hasil analisis yang baik (Adamovics, 1997).
Prosedur analisis terbagi menjadi 4 kategori, dimana masing-masing kategori
membutuhkan parameter analisis yang berbeda-beda seperti terlihat pada Tabel I.
Kategori I merupakan prosedur analisis untuk kuantifikasi komponen utama zat
obat atau bahan aktif dalam produk jadi farmasi. Kategori II merupakan prosedur
analisis untuk penentuan impurities dalam bahan obat atau senyawa degradasi
dalam produk jadi farmasi, prosedur ini meliputi tes kuantitatif dan tes batas.
Kategori III merupakan prosedur analisis untuk menentukan karakteristik kinerja
(disolusi, pelepasan obat). Kategori IV yaitu uji identifikasi (United States
[image:31.595.103.527.285.636.2]Pharmacopeial Convention, 2007).
Tabel I. Parameter analisis yang dibutuhkan dalam validasi metode analisis (United States Pharmacopeial Convention, 2007)
Karakteristik Kategori I
Kategori II Kategori III
Kategori IV Kuantitatif Batas Uji
Akurasi Yes Yes * * No Presisi Yes Yes No Yes No Selektivitas Yes Yes Yes * Yes Batas Deteksi No No Yes * No Batas Kuantifikasi No Yes No * No Linearitas Yes Yes No * No
Range Yes Yes * * No
*Mungkin dibutuhkan
1. Akurasi.
Akurasi merupakan kedekatan antara nilai terukur (nilai rata-rata hasil
dinyatakan sebagai persen perolehan kembali/recovery (Gandjar dan Rohman,
[image:32.595.97.517.168.553.2]2007).
Tabel II. Kriteria rentang recovery yang dapat diterima (Horwitz
cit.,Gonzales and Herador, 2007)
Konsentrasi analit
(%)
Fraksi
Analit Unit
Akurasi (%)
100 1 100% 98-102
≥10 10-1 10% 98-102
≥1 10-2 1% 97-103
≥0,1 10-3 0,1% 95-105 0,01 10-4 100 ppm 90-107 0,001 10-5 10 ppm 80-110 0,0001 10-6 1 ppm 80-110 0,00001 10-7 100 ppb 80-110 0,000001 10-8 10 ppb 60-115 0,0000001 10-9 1 ppb 40-120
2. Presisi.
Presisi atau keseksamaan adalah ukuran yang menunjukkan derajat
kesesuaian antara hasil uji individual yang diukur melalui penyebaran hasil
individual dari rata-rata, jika prosedur diterapkan secara berulang pada
[image:32.595.122.506.576.740.2]sampel-sampel yang diambil dari campuran yang homogen (Snyder dkk., 1997).
Tabel III. Kriteria Penerimaan %RSD dari ketentuan Horwitz dan ketentuan AOAC Peer Verified Methods (PVM) berdasarkan kadar analit
[image:32.595.124.505.580.741.2]3. Selektivitas
Selektivitas suatu metode adalah kemampuan suatu metode untuk dapat
mengukur zat tertentu secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain
yang mungkin ada dalam matrik sampel (Harmita, 2004). Selektivitas ditentukan
melalui perhitungan nilai Rs. Nilai Rs = 1,5 disebut baseline resolution, yaitu
pemisahan sempurna dari dua puncak dengan ukuran yang sama (Pecsok dkk.,
1976).
4. Linearitas
Linearitas prosedur analisis merupakan kemampuan mendapatkan hasil
respon (absorbansi dan AUC) yang secara langsung proporsional dengan
konsentrasi analit di dalam sampel. Respon yang dapat dikuantifikasikan adalah
peak area, peak heights atau ratio of peak area dari analit ke peak eksternal
standar. Pada linearitas digunakan setidaknya lima tingkat konsentrasi, seperti
direkomendasikan oleh ICH. Dalam keadaan normal, linearitas dicapai bila
koefisian determinasi r2 ≥ 0,997 (Chan, Lam, Lee dan Zhang, 2004).
5. Range
Range dalam metode analisis adalah interval antara konsentrasi paling
atas dan konsentrasi paling bawah analit yang sudah memenuhi prosedur analisis
yang meliputi akurasi, presisi, dan linearitas (The British Pharmacopoeia
H. Landasan Teori
Deksametason dan deksklorfeniramin maleat merupakan dua zat aktif
yang terdapat pada obat anti alergi, kedua zat aktif ini memiliki sifat kepolaran
yang berbeda sehingga dengan mengunakan sistem kromatografi lapis tipis kedua
senyawa ini dapat dipisahkan. Jika dilihat dari sifat fisikokimia deksametason
lebih bersifat non polar dibandingkan dengan deksklorfeniramin maleat yang
cenderung lebih larut pada air dan sukar larut pada benzen.
Metode yang digunakan yaitu KLT densitometri dimana metode ini dapat
memisahkan antara dua senyawa dan dapat untuk melakukan analisis kuantitatif.
Pemisahan terjadi karena adanya perbedaan afinitas dan interaksi senyawa
terhadap fase diam dan fase gerak. Bercak yang muncul setelah dilakukan elusi
dapat dianalisis kuantitatif menggunakan densitometer, sehingga dapat diperoleh
nilai Rf dan AUC.
Suatu metode yang akan digunakan untuk menetapkan kadar suatu obat
harus memiliki parameter validitas yang baik agar data yang diperoleh dapat
dipercaya. Parameter validasi untuk prosedur analisis kategori 1 meliputi
selektivitas, linearitas, akurasi, presisi, dan range. Suatu metode analisis dikatakan
memiliki validitas yang baik apabila memenuhi parameter-parameter validasi
tersebut.
I. Hipotesis
Metode KLT-densitometri untuk penetapan kadar campuran
deksametason dan deksklorfeniramin maleat memenuhi parameter-parameter
15
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Jenis penelitian yang dilakukan bersifat non-eksperimental dengan
rancangan penelitian deskriptif. Non-eksperimental karena tidak terdapat
manipulasi dan perlakuan terhadap subjek uji, sedangkan deskriptif karena
peneliti hanya mendeskripsikan keadaan yang ada.
B. Variabel Penelitian 1. Variabel bebas
Variabel bebas pada penelitian ini yaitu sistem KLT yang telah
dioptimasi, yaitu jenis dan komposisi fase gerak.
2. Variabel tergantung
Variabel tergantung pada penelitian ini yaitu parameter-parameter
validasi meliputi selektivitas, linearitas, akurasi, presisi, dan range.
3. Variabel pengacau terkendali
Variabel pengacau terkendali pada penelitian ini yaitu digunakan pelarut
pro analisis yang memiliki kemurnian tinggi, bahan baku yang digunakan yaitu
bahan baku yang memiliki Certificate of Analysis (CoA), dan penjenuhan bejana
kromatografi menggunakan kertas saring sebagai indikator kejenuhan bejana
C. Definisi Operasional
1. Sistem KLT yang digunakan yaitu fase normal dengan fase diam silika gel 60
F254 dan fase gerak kombinasi etil asetat : metanol : amonia 25% (25 : 4 : 1).
2. Kadar deksametason dan deksklorfeniramin maleat dinyatakan dalam satuan
mg/mL dalam pelarut etanol.
3. Parameter validasi yang digunakan adalah selektivitas, linearitas, akurasi,
presisi dan range.
D. Bahan Penelitian
Bahan-bahan yang digunakan adalah baku deksametason (Tianjin
Tianyao Pharmaceuticals CO., LTD), baku deksklorfeniramin maleat (Siegfried
Ltd 4800 Zofingen Switzerland), lempeng KLT silika gel 60 F254 20x20cm (E.
Merck), etanol p.a (E. Merck), etil asetat p.a (E. Merck), amonia p.a (E. Merck),
metanol p.a (E. Merck), dan obat kaplet X® yang berisi campuran deksametason
dan deksklorfeniramin maleat.
E. Alat Penelitian
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah seperangkat alat
densitometer (Camag TLC Scanner 3 CAT. No. 027.6485 SER. No.160602),
autosampler (Linomat 5 No.170610), neraca analitik (OHAOUS Carat Series PAJ
1003, max 60/120 g, min 0,0001 g, d = 0,01/0,1 mg), neraca analitik (Scaltec SBC
22 max 60/210 g; min 0,001 g; d = 0,01/0,1mg), bejana kromatografi (Camag),
F. Tata Cara Penelitian 1. Pembuatan fase gerak
Fase gerak yang digunakan adalah fase gerak yang telah didapat dari
hasil optimasi pada penelitian sebelumnya yaitu etil asetat, metanol, dan amonia
25% (25:4:1).
2. Pembuatan larutan baku
a. Pembuatan stok larutan baku deksametason 0,3 mg/mL. Baku
deksametason ditimbang seksama lebih kurang 37,5 mg, dimasukkan ke dalam
labu takar 10,0 mL dan dilarutkan dengan 5,0 mL etanol, sonifikasi selama 2
menit dan dilanjutkan pengojogan menggunakan vortex selama 2 menit, kemudian
encerkan dengan etanol hingga batas tanda. Setelah itu, larutan tersebut diambil 2
mL, dimasukan ke dalam labu takar 25,0 mL dan diencerkan dengan etanol
sampai batas tanda sehingga diperoleh larutan baku deksametason dengan
konsentrasi 0,3 mg/mL.
b. Pembuatan larutan baku tunggal deksametason. Larutan baku
deksametason 0,3 mg/mL dipipet 3 mL kemudian masing-masing dimasukkan ke
dalam labu takar 10,0 mL dan diencerkan dengan etanol sampai batas tanda,
sehingga diperoleh seri larutan baku deksametason dengan konsentrasi 0,09
mg/mL.
c. Pembuatan stok larutan baku deksklorfeniramin maleat 1 mg/mL.
Baku deksklorfeniramin maleat ditimbang seksama lebih kurang 50 mg,
dimasukkan ke dalam labu takar 10,0 mL dan dilarutkan dengan 5,0 mL etanol,
selama 2 menit, kemudian encerkan dengan etanol hingga batas tanda. Setelah itu,
larutan tersebut diambil 5 mL, dimasukan ke dalam labu takar 25,0 mL dan
diencerkan dengan etanol sampai batas tanda sehingga diperoleh larutan baku
deksklorfeniramin maleat dengan konsentrasi 1 mg/mL.
d. Pembuatan larutan baku tunggal deksklorfeniramin maleat. Larutan
baku deksklorfeniramin maleat 1 mg/mL dipipet 3 mL kemudian masing-masing
dimasukan ke dalam labu takar 10,0 mL dan diencerkan dengan etanol sampai
batas tanda, sehingga diperoleh seri larutan baku deksklorfeniramin maleat
dengan konsentrasi 0,3 mg/mL.
e. Pembuatan seri larutan baku campuran deksametason dan
deksklorfeniramin maleat. Larutan baku deksametason 0,3 mg/mL dan larutan
baku deksklorfeniramin maleat 1 mg/mL masing-masing dipipet 1; 2; 3; 4 dan 5
mL dan masing-masing dimasukan ke dalam labu takar 10,0 mL kemudian
diencerkan dengan etanol sampai tanda batas dan digojog, sehingga diperoleh seri
konsentrasi campuran deksametason : deksklorfeniramin maleat 0,03 : 0,1
mg/mL; 0,06 : 0,2 mg/mL; 0,09 : 0,3 mg/mL; 0,12 : 0,4 mg/mL dan 0,15 : 0,5
mg/mL.
3. Penentuan panjang gelombang pengamatan
Seri larutan baku campuran deksametason : deksklorfeniramin maleat
0,03 : 0,1 mg/mL; 0,09 : 0,3 mg/mL dan 0,15 : 0,5 mg/mL masing-masing
ditotolkan 1 µL dengan menggunakan linomat pada pelat silika gel dengan jarak
antar totolan 0,9 cm. Kemudian pelat dikembangkan didalam bejana kromatografi
dikeluarkan dan dikeringkan selama ± 5 menit dan diukur AUC tiap
masing-masing senyawa kemudian dilakukan pembacaan panjang gelombang 200-450 nm
sehingga diperoleh panjang gelombang overlapping spektra deksametason dan
deksklorfeniramin maleat.
4. Pembuatan kurva baku
Seri larutan baku campuran deksametason : deksklorfeniramin maleat
0,03 : 100 mg/mL; 0,06 : 0,2 mg/mL; 0,09 : 0,3 mg/mL; 0,12 : 0,4 mg/mL dan
0,15 : 0,5 mg/mL ditotolkan 1 µL dengan menggunakan linomat pada pelat silika
gel dengan jarak antar totolan 0,9 cm. Kemudian pelat dikembangkan di dalam
bejana kromatografi (Camag®) yang telah dijenuhkan. Pengembangan dilakukan
setinggi 5 cm. Pelat dikeluarkan dan dikeringkan selama ± 5 menit dan diukur
AUC tiap masing-masing senyawa (deksametason dan deksklorfeniramin maleat
akan memisah) menggunakan densitometer pada panjang gelombang pengamatan.
Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali. Dipilih persamaan kurva baku dengan nilai
r2 ≥ 0.997 untuk kurva baku deksametason dan kurva baku deksklorfeniramin
maleat.
5. Penentuan recovery dan Koefisien Variasi (KV) baku campuran
Seri larutan baku campuran deksametason : deksklorfeniramin maleat
0,03 : 0,1 mg/mL; 0,09 : 0,3 mg/mL dan 0,15 : 0,5 mg/mL ditotolkan sebanyak 1
µL dengan menggunakan linomat pada pelat silika gel dengan jarak antar totolan
0,9 cm. Kemudian pelat dikembangkan dalam bejana kromatografi yang telah
dijenuhkan oleh fase gerak. Pengembangan dilakukan setinggi 5 cm. Pelat
menggunakan densitometer pada panjang gelombang pengamatan. Nilai AUC
yang didapat dimasukkan ke dalam persamaan kurva baku yang telah dibuat
sebelumnya, sehingga didapatkan jumlah deksametason dan deksklorfeniramin
maleat yang kemudian dapat digunakan untuk menghitung %recovery dan %KV.
Penelitian dilakukan selama 2 periode, dimana tiap periode dilakukan paling lama
4 hari dan di replikasi sebanyak 3 kali.
6. Penentuan recovery dan Koefisien Variasi (KV) dengan adisi baku dalam sampel
a. Preparasi sampel kaplet. 20 kaplet yang setara dengan 0,5 mg
deksametason dan 2 mg deksklorfeniramin maleat digerus dalam mortir hingga
homogen.
b. Pembuatan larutan stok baku adisi. Timbang dengan seksama lebih
kurang 10 mg baku deksametason dan 40 mg baku deksklorfeniramin maleat
masukan ke dalam labu takar 10,0 mL dan larutkan dengan 5,0 mL etanol,
sonifikasi larutan selama 2 menit dan dilanjutkan penggojogan menggunakan
vortex selama 2 menit, kemudian encerkan dengan etanol hingga batas tanda dan
vortex, sehingga diperoleh larutan stok baku campuran deksametason konsentrasi
1 mg/mL atau setara dengan 1000 ppm dan deksklorfeniramin maleat konsentrasi
4 mg/mL atau setara dengan 4000 ppm.
c. Pembuatan larutan intermediet baku adisi (LA). Pipet 1,0 mL larutan
stok baku campuran deksametason (1 mg/mL) : deksklorfeniramin maleat (4
mg/mL), masukan ke dalam labu takar 10,0 mL dan diencerkan dengan etanol
peroleh larutan intermediet baku campuran deksametason dengan konsentrasi 0,1
mg/mL atau setara dengan 100 ppm dan deksklorfeniramin maleat konsentrasi 0,4
mg/mL atau setara dengan 400 ppm.
d. Pembuatan larutan sampel tanpa penambahan baku deksametason dan
deksklorfeniramin maleat (LB). Timbang dengan seksama lebih kurang 90 mg
sampel yang telah dihomogenkan, masukkan ke dalam labu takar 10,0 mL dan
larutkan dengan 5,0 mL etanol, sonifikasi larutan selama 2 menit dilanjutkan
dengan penggojogan menggunakan vortex selama 15 menit, kemudian larutan
diencerkan dengan etanol hingga batas tanda, gojog dengan vortex dan saring
menggunakan kertas saring. Replikasi dilakukan sebanyak 9 kali.
e. Pembuatan larutan sampel dengan penambahan baku deksametason
dan deksklorfeniramin maleat (LC). Timbang dengan seksama lebih kurang 90 mg
sampel yang telah dihomogenkan, masukkan ke dalam labu takar 10,0 mL dan
tambahkan dengan 1,0 ; 2,0 dan 3,0 mL larutan baku intermediet adisi (LA) pada
masing-masing labu takar, sonifikasi larutan selama 2 menit dilanjutkan dengan
penggojogan menggunakan vortex selama 15 menit, kemudian larutan diencerkan
dengan etanol hingga batas tanda, gojog dengan vortex dan saring menggunakan
kertas saring, sehingga didapat konsentrasi baku campuran deksametason dan
deksklorfeniramin maleat yang ditambahkan yaitu 0,01 : 0,04 mg/mL; 0,02 : 0,08
mg/mL dan 0,03 : 0,12 mg/mL. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali pada tiap
konsentrasi.
f. Pengembangan dan pengukuran. LB, dan LC ditotolkan sebanyak 1 µL
kemudian pelat dikembangkan dalam bejana kromatografi yang telah jenuh oleh
fase gerak. Pengembangan dilakukan setinggi 5 cm. Pelat dikeluarkan dan
dikeringkan selama ± 5 menit dan scanning menggunakan densitometer pada
panjang gelombang pengamatan. Nilai AUC yang didapat dimasukkan ke dalam
persamaan kurva baku yang telah dibuat sebelumnya, sehingga didapatkan jumlah
deksametason dan deksklorfeniramin maleat yang ditambahkan, sehingga dapat
digunakan untuk menghitung %recovery dan %KV.
G. Analisis Hasil 1. Selektivitas
Kriteria selektivitas yang baik ditunjukkan dengan nilai resolusi > 1,5.
Resolusi dapat dihitung dengan cara berikut:
(Watson, 2009)
Keterangan :
Rf1 dan Rf2 = nilai Rf dari peak 1 dan 2
w1 dan w2 = lebar peak 1 dan 2
2. Linearitas
Jumlah baku deksametason dan deksklorfeniramin maleat (mg/mL)
masing-masing diplotkan dengan AUC yang diperoleh, sehingga didapatkan
persamaan kurva baku y = bx + a dan nilai koefisien korelasi (r). Suatu metode
dapat dikatakan memiliki linearitas yang baik jika r2 > 0,997 (Chan, Lam, Lee dan
3. Akurasi
Akurasi metode analisis dinyatakan dengan recovery yang dapat dihitung
dengan cara berikut:
(Harmita, 2004).
Metode dapat dikatakan memenuhi parameter akurasi jika memiliki persen
perolehan kembali 80-110 % untuk konsentrasi 10 ppm dan 90-107% untuk
konsentrasi 100 ppm.
(Horwitz cit.,Gonzales and Herador, 2007).
4. Akurasi adisi baku dalam matriks sampel
Nilai recovery adisi baku dalam matriks sampel dapat dihitung dengan
cara berikut:
(Harmita, 2004).
5. Presisi
Presisi metode analisis dinyatakan dengan KV (koefisien variasi) yang
dapat dihitung dengan cara berikut:
(Harmita, 2004).
Kriteria penerimaan untuk parameter presisi yaitu jika metode memiliki
%KV tidak lebih dari 11,3% untuk konsentrasi 10 ppm dan 8% untuk konsentrasi
6. Range
Range merupakan interval jumlah analit yang memenuhi persyaratan
25
BAB IV PEMBAHASAN
A. Pembuatan Fase Gerak
Komposisi fase gerak yang digunakan dalam penelitian ini yaitu etil asetat
: metanol : amonia 25% (25 : 4 : 1). Fase gerak ini didapat dari hasil optimasi dari
penelitian sebelumnya (Ratnaningtyas, 2013), dimana pada penelitian sebelumnya
fase gerak dengan komposisi etil asetat, metanol, dan amonia mampu memisahkan
senyawa deksametason dan deksklorfeniramin secara optimal.
Pembuatan fase gerak dilakukan dengan mencampur etil asetat, metanol
dan amonia dengan komposisi 25:4:1. Penggunaan etil asetat pada komposisi fase
gerak yaitu untuk menurunkan kepolaran komposisi fase gerak. Amonia
digunakan untuk melindungi senyawa deksklorfeniramin maleat yang merupakan
garam basa dari sifat asam lemah gugus silanol dalam silika gel, amonia bersifat
basa, memiliki pka 9,25. Amonia dapat berikatan dengan fase diam (masking),
sehingga deksklorfeniramin maleat tidak berikatan kuat dengan fase diam dan
mampu terelusi. Metanol digunakan agar etil asetat dan amonia yang memiliki
perbedaan kepolaran dapat bercampur, selain itu metanol juga menyumbang
B. Pembuatan Larutan Baku
Larutan baku yang dibuat dalam penelitian ini yaitu larutan baku tunggal
deksametason, larutan baku tunggal deksklorfeniramin maleat dan larutan baku
campuran deksametason dan deksklorfeniramin maleat. Larutan baku tunggal
deksametason dibuat dengan melarutkan baku deksametason dengan etanol,
begitu pula dalam pembuatan larutan baku deksklorfeniramin maleat yaitu dengan
melarutkan baku deksklorfeniramin maleat dengan etanol. Pembuatan larutan
baku campuran deksametason dan deksklorfeniramin maleat dilakukan dengan
cara membuat larutan baku tunggal masing-masing baku terlebih dahulu
kemudian diambil masing-masing sesuai konsentrasi yang diharapkan dan
dicampur dalam bentuk larutan ditambahkan pelarut hingga batas, sehingga di
dapat konsentrasi baku campuran deksametason dan deksklorfeniramin maleat
0,03 : 0,1 mg/mL; 0,06 : 0,2 mg/mL; 0,09 : 0,3 mg/mL; 0,12 : 0,4 mg/mL dan
0,15 : 0,5 mg/mL.
Pemilihan konsentrasi ini berdasarkan kadar obat dalam kaplet yang akan
ditetapkan yaitu deksametason:deksklorfeniramin maleat (1 : 4) dan berdasarkan
hasil optimasi. Konsentrasi yang terlalu kecil dapat menghasilkan respon yang
kecil pula dan respon ini dapat terganggu oleh adanya noise yang dihasilkan oleh
alat sehingga dapat mengganggu pengamatan, untuk itu perlu adanya optimasi
pemilihan konsentrasi agar konsentrasi yang digunakan dapat terbaca baik pada
instrumen.
Pemilihan pelarut etanol dilakukan berdasarkan sifat kelarutan senyawa
IV tahun 1995, deksklorfeniramin maleat larut dalam etanol dan deksametason
agak sukar larut dalam etanol, dimana pernyataan agak sukar larut berarti 30-100
mL pelarut mampu melarutkan 1 gram senyawa. Untuk itu, dapat diketahui bahwa
kedua senyawa mampu terlarut di dalam pelarut etanol.
Secara keseluruhan, pembuatan larutan baku campuran deksametason dan
deksklorfeniramin maleat dijaga agar terhindar dari cahaya dan dilakukan secara
cepat dan tepat agar proses penotolan dapat segera dilakukan. Hal ini dilakukan
untuk menjaga kestabilan senyawa di dalam pelarut.
C. Penetapan Panjang Gelombang Pengamatan
Penetapan panjang gelombang pengamatan diperlukan untuk mengetahui
panjang gelombang optimal pada pengukuran bersama antara deksametason dan
deksklorfeniramin maleat, sehingga perubahan kecil kadar mampu meningkatkan
respon. Hal ini diperlukan agar pada saat pengukuran mampu dikuantifikasikan
dan untuk meminimalkan kesalahan. Larutan yang digunakan merupakan larutan
baku campuran deksametason dan deksklorfeniramin maleat dengan konsentrasi
0,03 : 0,1 mg/mL (rendah), 0,09 : 0,3 mg/mL (sedang) ; 0,15 : 0,5 mg/mL (tinggi).
Pemilihan 3 konsentrasi ini digunakan untuk memastikan bahwa spektrum yang
dihasilkan dari tiap konsentrasi memiliki pola spektrum yang sama sehingga
mampu mewakili seluruh konsentrasi kurva baku.
Hasil scanning menunjukan panjang gelombang pengamatan
deksametason dan deksklorfeniramin maleat yaitu 245 nm untuk deksametason
dan 261 nm untuk deksklorfeniramin maleat. Untuk analisis multikomponen
tindihkan spektra masing-masing senyawa dan memilih perpotongan kedua
spektra. Pembacaan serapan dilakukan pada 200 nm–450 nm menggunakan
detektor UV pada densitometer. Pada gambar 6 menunjukan kedua spektra saling
tumpang tindih, dimana perpotongan dari kedua spektra yaitu pada panjang
gelombang 262 nm. Untuk itu, panjang gelombang pengamatan yang digunakan
[image:48.595.101.512.244.553.2]selanjutnya yaitu 262 nm.
Gambar 6. Perpotongan Spektra Deksametason (A) dan Deksklorfeniramin maleat (B) dalam pelarut etanol
Detektor UV digunakan pada pembacaan panjang gelombang dikarenakan
senyawa yang diuji yaitu deksametason dan deksklorfeniramin maleat memiliki
kromofor dan auksokrom. Kromofor merupakan gugus tak jenuh kovalen yang
dapat menyerap radiasi dalam daerah-daerah ultraviolet dan visibel, sedangkan
auksokrom adalah heteroatom yang terikat pada kromofor dan dapat mengubah
panjang gelombang dan intensitas serapan maksimum. Dengan adanya kromofor
dan auksokrom pada deksametason dan deksklorfeniramin maleat maka senyawa
ini dapat di uji menggunakan detektor UV.
A
Gambar 7. Bagian kromofor deksametason (warna merah: kromofor)
Gambar 8. Bagian kromofor dan auksokrom deksklorfeniramin maleat (warna merah: kromofor, warna biru: auksokrom)
D. Analisis Kualitatif
Analisis kualitatif deksametason dan deksklorfeniramin maleat yang
digunakan dalam penelitian ini yaitu dengan cara spiking. Menurut Gandjar dan
Rohman, 2007 salah satu pendekatan untuk analisis kualitatif yaitu dengan
menggunakan cara spiking. Spiking yang dilakukan yaitu dengan menambahkan
sejumlah baku dari senyawa yang diselidiki kedalam sampel yang mengandung
senyawa yang diselidiki tersebut lalu dibandingkan tinggi puncak/luas puncak
dengan sampel tanpa penambahan baku.
Pada penelitian ini digunakan konsentrasi baku adisi deksametason dan
deksklorfeniramin maleat (0,01 : 0,04 mg/mL) dilakukan replikasi sebanyak 3
kali. Baku adisi yang ditambahkan merupakan larutan baku campuran
deksametason dan deksklorfeniramin maleat, untuk itu dilakukan pengujian
[image:49.595.102.511.226.606.2]dilakukannya analisis kualitatif dengan cara spiking. Hal ini dilakukan untuk
[image:50.595.104.494.177.679.2]mengetahui letak Rf deksametason dan deksklorfeniramin maleat.
Gambar 9. Densitogram baku tunggal deksametason
Gambar 10. Densitogram baku tunggal deksklorfeniramin maleat
Gambar 12. Densitogram sampel dengan penambahan baku replikasi 1
Pada gambar 11 dan 12 terlihat adanya peningkatan AUC (Area Under
Cover) deksametason dan deksklorfeniramin maleat. Pada sampel tanpa
penambahan baku AUC deksametason 383,2 dan setelah penambahan baku
deksametason dengan konsentrasi 0,01 mg/mL, AUC deksametason meningkat
menjadi 482,5. Begitupula dengan deksklorfeniramin maleat, pada sampel tanpa
penambahan baku AUC deksklorfeniramin maleat 685,0 dan setelah penambahan
baku dengan konsentrasi 0,04 mg/mL, AUC deksklorfeniramin maleat meningkat
menjadi 860,9.
Pada penelitian ini juga dilakukan pembacaan panjang gelombang, dengan
melihat pola spektra dari masing-masing senyawa dapat dipastikan kebenaran
Gambar 13. Pola Spektra baku tunggal deksametason dalam pelarut etanol pada konsentrasi 0,09mg/mL atau setara 90 ppm
Gambar 14. Pola Spektra baku tunggal deksklorfeniramin maleat dalam pelarut etanol pada konsentrasi 0,3 mg/mL atau setara 300 ppm
Pada sampel tanpa penambahan baku dan sampel dengan penambahan
baku (gambar 15 dan 16) terlihat memiliki pola spektra yang sama dengan pola
spektra dari senyawa deksametason dan deksklorfeniramin maleat tunggal
(gambar 13 dan 14).
Adanya peningkatan AUC pada sampel dengan penambahan baku dan
pola spektra yang sama antara baku tunggal dengan sampel maka dapat
disimpulkan bahwa didalam sampel terdapat senyawa deksametason dan
Gambar 15. Pola Spektra sampel tanpa penambahan baku replikasi 1
Gambar 16. Pola Spektra Sampel dengan penambahan baku replikasi 1
E. Penetapan kurva baku
Penetapan kurva baku bertujuan untuk memperoleh persamaan garis yang
kemudian dapat digunakan untuk analisis kuantitatif suatu senyawa. Pada
penelitian ini digunakan 5 konsentrasi larutan baku campuran deksametason dan
deksklorfeniramin maleat dan dilakukan replikasi sebanyak 3 kali.
Persamaan kurva baku menunjukan hubungan yang linear antara
konsentrasi dengan respon pengukuran dalam hal ini dinyatakan sebagai Area
determinasi r2 ≥ 0,997 (Chan, Lam, Lee dan Zhang, 2004) dapat diterima dan
menunjukan korelasi antara konsentrasi dan AUC yang akurat. Untuk itu, pada
pemilihan persamaan kurva baku dipilih koefisien determinasi (r2) yang
[image:54.595.101.507.245.618.2]mendekati 1.
Tabel IV. Data Penentuan Kurva Baku Deksametason
Gambar 17. Kurva hubungan konsentrasi dan AUC pada replikasi 1, 2 dan 3 Deksametason
Pada data tabel IV dan V dapat dilihat bahwa deksametason dan
deksklorfeniramin maleat pada semua replikasi memenuhi kriteria koefisien
determinasi r2 ≥ 0,997 (Chan, Lam, Lee dan Zhang, 2004). Untuk pemilihan
persamaan kurva baku yang akan digunakan yaitu menggunakan persamaan kurva Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3
Konsentrasi AUC Konsentrasi AUC Konsentrasi AUC 0,02952 411,1 0,028944 305,1 0,029008 305,4 0,05904 667,2 0,057888 591,9 0,058016 614,6 0,08856 995,6 0,086832 907,1 0,087024 871,3 0,11808 1205 0,115776 1206,3 0,116032 1187 0,1476 1482,6 0,14472 1549,5 0,14504 1420,4
a = 148,06 a = 18,98 a = 39,02 b = 9081,3 b = 10721 b = 9660,8
r2 = 0,997 r2 = 0,999 r2 = 0,998
baku replikasi 2, karena pada replikasi 2 terlihat nilai (r2) yang paling mendekati 1
jika dibandingkan dengan replikasi 1 dan 3. Nilai (r2) yang mendekati 1
menunjukan bahwa dengan adanya perubahan konsentrasi akan memberikan
[image:55.595.99.513.236.629.2]perubahan nilai AUC secara proporsional.
Tabel V. Data Penentuan Kurva Baku Deksklorfeniramin Maleat
Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Konsentrasi AUC Konsentrasi AUC Konsentrasi AUC
0,1015 791,5 0,09934 565,4 0,10144 616,6 0,203 1276,5 0,19868 1042,9 0,20288 1173,8 0,3045 1839,5 0,29802 1520,3 0,30432 1660,9 0,406 2260,9 0,39736 1920,6 0,40576 2143,3 0,5075 2677,6 0,4967 2445,7 0,5072 2545,7
a = 342,22 a = 107,49 a = 179,75 b = 4686,3 b = 4669,1 b = 4759,2 r2 = 0,997 r2 = 0,999 r2 = 0,997
Gambar 18. Kurva hubungan konsentrasi dan AUC pada replikasi 1, 2 dan 3 Deksklorfeniramin maleat
Kurva hubungan konsentrasi dan AUC pada replikasi 1, 2 dan 3
deksametason dan deksklorfeniramin maleat memiliki kemiringan yang mirip
antar replikasinya, hal ini menunjukan bahwa persamaan kurva baku yang
diperoleh memiliki keterulangan yang baik dan perolehan persamaan ini bukan
merupakan suatu kebetulan.
Persamaan kurva baku deksametason yang digunakan untuk analisis
kuantitaif yaitu y=10721x-18,98 dan untuk deksklorfeniramin maleat
y=4669,1x+107,49. Pada gambar 19 dan 20 menunjukan bahwa peningkatan
konsentrasi akan memberikan peningkatan respon pengukuran dalam hal ini nilai
[image:56.595.100.499.269.615.2]AUC.
Gambar 19. Kurva hubungan konsentrasi dan AUC Deksametason
Gambar 20. Kurva hubungan konsentrasi dan AUC Deksklorfeniramin maleat
F. Validasi Metode Analisis
Validasi metode analisis digunakan untuk menunjukkan bahwa metode
analisis yang akan digunakan layak dan diharapkan dapat memperoleh hasil
analisis yang dapat dipercaya. Suatu metode analisis dapat dikatakan valid jika
memenuhi parameter-parameter validasi yang ditentukan. Pada penelitian ini
digunakan larutan baku campuran deksametason dan deksklorfeniramin maleat
dengan konsentrasi rendah (0,03 ; 0,1 mg/mL), sedang (0,09 ; 0,3 mg/mL) dan
tinggi (0,15 ; 0,5 mg/mL). Parameter validasi metode analisis yang digunakan
yaitu selektivitas, linearitas, akurasi, presisi, dan range.
1. Selektivitas
Parameter selektivitas digunakan untuk menunjukan bahwa metode yang
digunakan dapat membedakan senyawa yang akan diuji dengan komponen
senyawa lainnya secara selektif. Untuk itu penentuan parameter selektivitas dapat
diamati dari pemisahan peak deksametason dan deksklorfeniramin maleat yang
dinyatakan sebagai nilai resolusi (Rs). Parameter selektifitas yang baik yaitu
memiliki nilai resolusi > 1,5. Nilai Rs = 1,5 disebut baseline resolution, yaitu
pemisahan sempurna dari dua puncak dengan ukuran yang sama (Pecsok dkk.,
1976). Pada penelitian ini digunakan sampel dan baku campuran deksametason
dan deksklorfeniramin maleat yang direplikasi sebanyak 3 kali.
Tabel VI. Data nilai resolusi baku campuran deksametason dan deksklorfeniramin maleat
Replikasi Rf Deksametason Rf Deksklorfeniramin
Maleat
Nilai Resolusi (Rs)
1 0,68 0,48 3,08
2 0,64 0,47 1,89
[image:58.595.102.517.270.594.2]3 0,66 0,45 2,63
Tabel VII. Data nilai resolusi sampel
Replikasi Rf Deksametason Rf Deksklorfeniramin
Maleat
Nilai Resolusi (Rs)
1 0,62 0,43 2,92
2 0,60 0,48 1,85
3 0,65 0,40 3,33
Hasil yang diperoleh menunjukan bahwa nilai Rf yang didapat tidaklah
konstan, namun dari semua replikasi dapat terlihat bahwa nilai resolusi yang
didapat > 1,5. Hal ini menunjukan bahwa metode dapat memisahkan kedua
senyawa yang berbeda dalam suatu campuran. Rentang Rf deksametason dan
deksklorfeniramin maleat yang didapat yaitu 0,60-0,68 untuk deksametason dan
0,40-0,48 untuk deksklorfeniramin maleat, dimana rentang ini memenuhi
parameter selektivitas.
2. Linearitas
Linearitas merupakan kemampuan suatu metode memiliki hubungan yang
dilihat dari nilai koefisien determinasi (r2) kurva baku. Metode dapat dikatakan
memiliki nilai lineraitas yang baik jika koefisien determinasi r2 ≥ 0,997 (Chan,
Lam, Lee dan Zhang, 2004). Dalam penelitian ini didapat nilai r2 deksametason
0,999 dan deksklorfeniramin maleat 0,999. Keduanya memenuhi parameter
linearitas.
3. Akurasi
Suatu metode dikatakan akurat jika kadar yang terukur memiliki
kedekatan dengan kadar sebenarnya, dalam hal ini dinyatakan sebagai % recovery
atau persen perolehan kembali. Untuk mengetahui akurasi dapat digunakan
larutan baku atau dengan spiked placebo (metode standar adisi). Akurasi dengan
larutan baku digunakan untuk mengetahui akurasi instrumen sedangkan akurasi
dengan spiked placebo (metode standar adisi) digunakan untuk mengetahui
akurasi metode analisis. Larutan baku yang digunakan yaitu larutan baku
campuran deksametason dan deksklorfeniramin maleat dengan konsentrasi rendah
(0,03 ; 0,1 mg/mL), sedang (0,09 ; 0,3 mg/mL) dan tinggi (0,15 ; 0,5 mg/mL),
dilakukan selama 2 periode, dimana masing-masing periode dilakukan selama 4
hari dan di replikasi sebanyak 3 kali. Pengukuran selama 2 periode bertujuan
untuk menjamin keterulangan akurasi penelitian pada periode yang berbeda.
Menurut USP tahun 2007, penetapan akurasi dilakukan dengan menggunakan
minimal 3 konsentrasi dengan 3 kali replikasi, pemilihan konsentrasi pada
penelitian ini yaitu untuk mengcover konsentrasi analit yang akan diuji.
Konsentrasi rendah campuran deksametason dan deksklorfeniramin maleat
sedang 0,09 ; 0,3 mg/mL setara dengan 90 ; 300 ppm dan untuk konsentrasi tinggi
0,15 ; 0,5 mg/mL atau setara dengan 150 ; 500 ppm. Menurut USP tahun 2007
kriteria penerimaan untuk konsentrasi 1000 ppm yaitu 95-105% 100 ppm yaitu
90-107% dan untuk 10 ppm 80-110% untuk itu dapat diasumsikan konsentrasi 30
ppm memiliki persyaratan % recovery 82,2-109,2%, konsentrasi 90 ppm memiliki
persyaratan % recovery 88,8-107,3%, konsentrasi 150 ppm memiliki persyaratan
% recovery 90,3-106,9%, konsentrasi 300 ppm 91,12-106,2% dan 500 ppm
memiliki kriteria penerimaan 92,24 – 106,2%.
Pada penelitian ini didapat % recovery konsentrasi rendah, sedang dan
tinggi larutan baku campuran deksametason dan deksklorfeniramin maleat pada 2
periode dan dilakukan sebanyak 3 kali replikasi seluruhnya memenuhi kriteria
[image:60.595.104.530.254.736.2]penerimaan (lihat tabel VIII).
Tabel VIII. Data % recovery baku campuran deksametason dan deksklorfeniramin maleat periode ke-1 dan 2
Periode Analit Level Kons. analit (ppm) % recovery KP* (%) replikasi 1 replikasi 2 replikasi 3
1 Deksametason
rendah
30 108,19 104,11 103,89 82,2 - 109,2 Deksklorfeniramin
maleat 100 102,50 106,05 100,02 90 - 107 Deksametason
sedang
90 102,16 101,51 96,49 88,8 - 107,3 Deksklorfeniramin
maleat 300 101,81 100,99 97,45 91,12 - 106,2 Deksametason
tinggi
150 96,13 102,87 94,10 90,3 - 106,9 Deksklorfeniramin
maleat 500 96,11 104,12 94,16 92,24 - 106,2
2 Deksametason
rendah
30 101,61 107,00 90,01 82,2 - 109,2 Deksklorfeniramin
maleat 100 97,30 100,99 96,97 90 - 107 Deksametason
sedang
90 99,09 90,85 98,86 88,8 - 107,3 Deksklorfeniramin
maleat 300 99,77 103,54 94,46 91,12 - 106,2 Deksametason
tinggi
150 92,49 95,94 101,74 90,3 - 106,9 Deksklorfeniramin
4. Presisi
Parameter presisi digunakan untuk melihat kedekatan hasil-hasil
pengukuran dalam kondisi yang sama, dalam hal ini dinyatakan sebagai %KV.
Pada penelitian ini digunakan larutan baku campuran deksametason dan
deksklorfeniramin maleat pada konsentrasi rendah (0,03 ; 0,1 mg/mL), sedang
(0,09 ; 0,3 mg/mL) dan tinggi (0,15 ; 0,5 mg/mL). penelitian dilakukan dalam 2
periode, masing-masing periode direplikasi sebanyak 3 kali. Dilakukannya
penelitian selama 2 periode untuk mengetahui presisi antara (inter dayprecision),
dimana setiap periode berjangka waktu maksimal 4 hari pengukuran. Presisi
antara merupakan variabilitas jangka panjang suatu proses pengukuran dan
ditentukan dengan membandingkan hasil-hasil suatu metode yang dikerjakan
dalam satu laboratorium selama beberapa minggu (International Conference on
Harmonisation, 1995).
Konsentrasi yang digunakan pada penelitian ini yaitu konsentrasi rendah
campuran deksametason dan deksklorfeniramin maleat (0,03; 0,1 mg/mL atau
setara dengan 30 ; 100 ppm), konsentrasi sedang (0,09 ; 0,3 mg/mL setara dengan
90 ; 300 ppm) dan konsentrasi tinggi (0,15 ; 0,5 mg/mL atau setara dengan 150 ;
500 ppm). Menurut Horwitz (cit., Gonzales and Herrador, 2007), pada konsentrasi
1000 ppm %KV yang dapat diterima yaitu sebesar 5,7%, konsentrasi 100 ppm
sebesar 8%. Dalam penelitian ini % KV konsentrasi rendah, sedang dan tinggi
larutan baku campuran deksametason dan deksklorfeniramin maleat pada 2
menunjukkan bahwa seluruh konsentrasi memenuhi kriteria penerimaan %KV
[image:62.595.97.529.186.531.2]seperti terlihat pada tabel IX.
Tabel IX. Data %KV baku campuran deksametason dan deksklorfeniramin maleat periode ke-1 dan 2
Periode Analit Level Konsentrasi analit
(ppm) % KV
KP* (%)
1 Deksametason
rendah
30 4,92 9,58 Deksklorfeniramin maleat 100 4,15 8
Deksametason
sedang
90 3,46 8,12 Deksklorfeniramin maleat 300 0,68 6,78
Deksametason
tinggi
150 1,32 7,53 Deksklorfeniramin maleat 500 4,66 6,28
2 Deksametason
rendah
30 7,75 9,58 Deksklorfeniramin maleat 100 1,68 8
Deksametason
sedang
90 6,19 8,12 Deksklorfeniramin maleat 300 4,46 6,78
Deksametason
tinggi
150 1,62 7,53 Deksklorfeniramin maleat 500 3,05 6,28
*KP = Kriteria penerimaan %KV menurut Horwitz (cit., Gonzales and Herrador, 2007).
5. Range
Range merupakan interval konsentrasi analit dari konsentrasi rendah
hingga konsentrasi atas dalam kurva baku yang memenuhi kriteria akurasi, presisi
dan linearitas. Pada penelitian ini digunakan larutan baku campuran deksametason
dan deksklorfeniramin maleat konsentrasi rendah (0,03 ; 0,1 mg/mL atau setara
dengan 30 ; 100 ppm), konsentrasi sedang (0,09 ; 0,3 mg/mL setara dengan 90 ;
300 ppm) dan untuk konsentrasi tinggi (0,15 ; 0,5 mg/mL atau setara dengan 150 ;
500 ppm). Hasil yang diperoleh menyatakan bahwa konsentrasi deksametason
0,03 ; 0,09 dan 0,15 mg/mL memenuhi parameter presisi, akurasi dan linearitas,
sehingga diperoleh range deksametason pada konsentrasi 0,03-0,15 mg/mL dan
memenuhi parameter presisi, akurasi dan linearitas, sehingga diperoleh range
untuk deksklorfeniramin maleat pada konsentrasi 0,1-0,5 mg/mL.
6. Penentuan akurasi dan presisi adisi baku dalam sampel
Akurasi dan presisi metode analisis dapat ditentukan dengan menambahkan
sejumlah baku yang telah diketahui jumlahnya ke dalam sampel dan ditetapka
