BAB III METODOLOGI PENELITIAN
E. Tatacara Penelitian
Determinasi tanaman apel beludru dilakukan di Laboratorium
Farmakognosi-Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma dengan
acuan dari web USDA (2013) dan Morton (1987).
2. Pembuatan dan penyiapan bahan
a. Pengumpulan bahan
Tanaman apel beludru diperoleh dari kompleks Kampus III Universitas
Sanata Dharma, Paingan, Maguwoharjo, Sleman, Yogyakarta. Pengumpulan pada
musim penghujan bulan Januari tahun 2013. Pemanenan dilakukan pagi hari
pukul 07.00 saat tanaman sedang berbuah dengan bahan yang dipakai adalah daun
dewasa, yaitu daun yang berwarna hijau tua, berada pada ruas ketiga sampai
b. Sortasi basah
Bahan baku dipisahkan dari bahan-bahan pengganggu seperti tanah,
kerikil, rumput, bagian tanaman yang tidak dibutuhkan (ranting dan bunga),
bagian dari tanaman lain (tangkai, daun, bunga dan biji inang), bahan yang rusak
dan lain-lain.
c. Pencucian
Daun apel beludru dicuci dengan cara dialiri air sumur sambil
dibersihkan kotoran yang melekat pada daun. Pencucian ini dilakukan sebanyak
tiga kali.
d. Perajangan
Daun apel beludru dirajang dengan ukuran seragam, kurang lebih
panjang daun menjadi 1 cm.
e. Pengeringan
Daun apel beludru yang masih basah dikeringanginkan pada udara
terbuka dan terlindung dari sinar matahari. Cara pengeringan adalah bahan
dihamparkan di atas kertas koran diatur agar tidak terlalu menumpuk. Posisi daun
harus sering dibalik sehingga pengeringan dapat merata. Akhir pengeringan
ditandai dengan mudah dipatahkannya daun apel beludru.
f. Sortasi kering
Daun apel beludru yang sudah kering (ditandai dengan mudah hancur
ketika diremas) dipisahkan dari bahan-bahan pengganggu seperti tanah, kerikil,
g. Penyerbukan
Daun apel beludru dibuat menjadi serbuk dengan bantuan alat penyerbuk,
kemudian dilakukan pengayakan dengan ayakan nomor mesh 40.
h. Pengepakan dan penyimpanan
Serbuk daun apel beludru kemudian dibungkus dengan menggunakan
wadah kedap udara. Penyimpanan dilakukan di suhu ruangan.
3. Ekstraksi
Daun apel beludru yang telah menjadi serbuk ditimbang sebanyak 50,0 g
dan dimasukkan ke dalam bejana maserasi, ditambah pelarut pertama yaitu
metanol:air (9:1) sampai terendam sempurna, dan dicampur homogen. Campuran
dimaserasi pada suhu ruangan selama satu hari. Filtrat diperoleh melalui
penyaringan dengan corong Buchner dengan bantuan pompa vakum. Ampas
penyaringan dimaserasi dengan pelarut kedua, yaitu metanol:air (1:1) secukupnya
selama satu hari kemudian disaring. Filtrat hasil maserasi pelarut pertama dan
kedua digabungkan, lalu filtrat diuapkan pelarutnya hingga volumenya menjadi
sepertiga dari volume awal. Diperoleh ekstrak metanolik daun apel beludru.
4. Pembuatan fraksi etil asetat
Ekstrak metanolik daun apel beludru di ekstraksi cair-cair menggunakan
washbensin dengan perbandingan larutan ekstrak : washbensin (1:1 v/v),
kemudian didiamkan hingga terpisah sempurna. Fase air akan berada pada paling
Hasil fraksinasi diperoleh dua fraksi, yaitu fraksi washbensin dan fraksi
air. Selanjutnya, fraksi air diekstraksi cair-cair lagi menggunakan etil asetat
dengan perbandingan larutan fraksi air : etil asetat (1:1 v/v) sehingga didapatkan
fraksi air dan fraksi etil asetat. Setelah dipisahkan, fraksi etil asetat diuapkan
dengan vacum rotary evaporator dan dimasukkan dalam cawan porselin yang
sebelumnya telah ditimbang. Cawan berisi fraksi kental dimasukkan dalam oven
hingga 24 jam. Fraksi kering yang didapat digunakan untuk analisis lebih lanjut.
5. Pembuatan larutan pembanding, DPPH dan uji
a. Pembuatan larutan baku asam galat
Sebanyak 10,0 mg asam galat ditimbang, lalu ditambahkan 10,0 mL
akuades : metanol p.a (1:1) sehingga diperoleh konsentrasi larutan asam galat
sebesar 1000,0 µg/mL. Diambil sebanyak 0,5; 0,75; 1,0; 1,25 dan 1,5 mL
larutan tersebut, kemudian ditambahkan akuades : metanol p.a (1:1) sampai
10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan baku asam galat 50; 75; 100;
125; dan 150 µg/mL.
b. Pembuatan larutan DPPH
Sebanyak 0,0158 g DPPH dilarutkan dengan metanol p.a sampai 100 mL
sehingga diperoleh larutan DPPH dengan konsentrasi 0,4 mM. Larutan tersebut
ditutup dengan alumunium foil dan harus selalu dibuat baru.
c. Pembuatan larutan stok dan intermediet kuersetin
Sebanyak 10,0 mg kuersetin dilarutkan dengan metanol p.a sampai 10,0
1,0 mL larutan stok kuersetin dan ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL,
sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi sebesar 100,0 μg/mL. d. Pembuatan larutan pembanding
Diambil sebanyak 0,5; 0,75; 1,0; 1,25; 1,5 mL larutan kuersetin
konsentrasi 100,0 μg/mL, kemudian ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan standar kuersetin sebesar 5,0; 7,5; 10,0;
12,5; dan 15,0 μg/mL. e. Pembuatan larutan uji
1). Larutan uji untuk penentuan kandungan fenolik total
Sebanyak 10,0 mg fraksi etil asetat ditimbang, lalu ditambahkan 10,0
mL metanol p.a sehingga diperoleh konsentrasi sebesar 1000,0 µg/mL.
Kemudian larutan tersebut diambil 1,0 mL dan ditambahkan 10,0 mL metanol
p.a sehingga diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 100,0 µg/mL.
2). Larutan uji untuk aktivitas antioksidan
Sejumlah 10,0 mg fraksi etil asetat ditimbang dan ditambahkan metanol
p.a sampai 10,0 mL sebagai larutan stok. Kemudian dibuat larutan intermediet
dengan mengambil 1,0 mL stok larutan uji dan ditambahkan metanol p.a sampai
10,0 mL, sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi sebesar 100,0 μg/mL. Diambil sebanyak 0,75; 1,0; 1,25; 1,5; 1,75 mL larutan tersebut, kemudian
ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan
6. Uji pendahuluan
a. Uji keberadaan senyawa fenolik
Larutan uji dengan konsentrasi 200,0 μg/mL dan larutan pembanding asam galat 150,0 μg/mL diambil sebanyak 0,5 mL kemudian ditambahkan 2,5 mL pereaksi fenol Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan akuades (1:10 v/v)
ke dalam tabung reaksi lalu didiamkan selama 10 menit. Larutan natrium karbonat
1 M ditambahkan sebanyak 2,0 mL, kemudian amati warna larutan tersebut.
Bandingkan dengan warna larutan yang berisi air:metanol (1:1) + pereaksi, fraksi
etil asetat dan asam galat tanpa diberi pereaksi.
b. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan
Larutan DPPH diambil sebanyak 1,0 mL dimasukan ke dalam
masing-masing tiga tabung reaksi. Larutan DPPH ditambahkan masing-masing-masing-masing dengan
1,0 mL metanol p.a, larutan pembanding kuersetin 37,5 μg/mL, dan larutan uji 200,0 μg/mL. Selanjutnya, larutan tersebut ditambahkan dengan 3,0 mL metanol p.a. Larutan tersebut kemudian digojok dengan vortex selama 30 detik. Setelah 30
menit, diamati warna pada larutan tersebut. Bandingkan juga dengan warna
larutan fraksi etil asetat dan kuersetin tanpa ditambahkan DPPH.
7. Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total
a. Penentuan operating time (OT)
Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 100; dan 150 μg/mL ditambahkan dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan
karbonat 1 M. Setelah itu dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel
pada panjang gelombang 750 nm selama 30 menit. Dilakukan demikian juga
untuk larutan uji 100 μg/mL dengan waktu pengamatan selama 60 menit. b. Penentuan panjang gelombang maksimum
Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 100; dan 150 μg/mL ditambahkan dengan 5,0 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan
air (1:10 v/v). Larutan selanjutnya ditambahkan dengan 4,0 mL natrium karbonat
1 M. Diamkan selama operating time, dibaca panjang gelombang pada absorbansi
maksimum dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 600-800
nm.
8. Penetapan kandungan fenolik total
a. Pembuatan kurva baku asam galat
Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 75; 100; 125; dan 150 μg/mL ditambah dengan 5,0 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan
akuades (1:10 v/v). Larutan selanjutnya ditambah dengan 4,0 mL natrium
karbonat 1 M. Setelah operating time, absorbansinya dibaca pada panjang
gelombang maksimum terhadap blanko yang terdiri atas akuades : metanol p.a
(1:1), reagen Folin-Ciocalteu dan larutan natrium karbonat 1M. Pengerjaan
dilakukan tiga kali.
b. Estimasi kandungan fenolik total larutan uji
Diambil 0,5 mL larutan uji 100 μg/mL, lalu dilanjutkan sebagaimana perlakuan pada pembuatan kurva baku asam galat. Kandungan fenolik total
dinyatakan sebagai mg ekuivalen asam galat per g fraksi etil asetat. Dilakukan tiga
kali replikasi.
9. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan
a. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum
Pada tiga labu ukur 10 mL, dimasukkan masing-masing 0,5; 1,0; 1,5
mL larutan DPPH. Larutan tersebut ditambahkan dengan metanol p.a hingga
tanda batas sehingga konsentrasi DPPH menjadi 0,020; 0,040; dan 0,060.
Larutan tersebut kemudian digojok dengan vortex selama 30 detik. Diamkan
selama operating time, lalu dilakukan scanning panjang gelombang serapan
maksimum dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 400-600
nm.
b. Penentuan operating time (OT)
Sebanyak 2,0 mL larutan DPPH dimasukan kedalam masing-masing
tiga labu ukur 10 mL, ditambahkan masing-masing dengan 2,0 mL larutan
pembanding kuersetin 5,0; 10,0 dan 15,0 μg/mL. Selanjutnya larutan tersebut ditambahkan dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut
kemudian digojok dengan vortex selama 30 detik. Setelah itu dibaca
absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 516
nm selama 1 jam. Dilakukan demikian juga untuk larutan uji 7,5; 12,5; 17,5
10. Uji aktivitas antioksidan
a. Pengukuran absorbansi larutan DPPH (kontrol)
Pada labu ukur 10 mL, dimasukkan sebanyak 2,0 mL larutan DPPH.
Ditambahkan metanol p.a hingga tanda batas. Kemudian larutan tersebut dibaca
absorbansinya pada saat OT dan panjang gelombang maksimum. Pengerjaan
dilakukan sebanyak tiga kali. Larutan ini digunakan sebagai kontrol untuk
menguji larutan pembanding dan uji.
b. Pengukuran absorbansi larutan pembanding dan uji
Larutan DPPH sebanyak 2,0 mL dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL
kemudian ditambah dengan 2,0 mL larutan pembanding dan uji pada berbagai seri
konsentrasi yang telah dibuat. Selanjutnya larutan tersebut ditambah dengan
metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut kemudian digojok dengan vortex
selama 30 detik dan didiamkan selama OT. Larutan dibaca absorbansinya dengan
spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum hasil optimasi.
Pengujian dilakukan dengan tiga kali replikasi.
c. Estimasi aktivitas antioksidan
Hasil dari prosedur 10a dan 10b, dihitung nilai %IC dan IC50 untuk
kuersetin dan fraksi etil asetat.