DAFTAR PUSTAKA
II. TINJAUAN PUSTAKA
2.2 Teknik Mikroinjeks
Beberapa teknik transgenesis dapat digunakan untuk mengintroduksikan fragmen DNA asing ke dalam embrio atau gamet spesies akuatik. Saat ini teknik yang umum digunakan adalah mikroinjeksi, elektroporasi, dan transfer gen dengan mediasi sperma (Tsai, 2003). Masing-masing teknik ini memiliki keuntungan dan kerugian bergantung pada spesies hewan yang digunakan untuk
studi transfer gen. Contohnya mikroinjeksi dan elektroporasi saat ini digunakan untuk transfer gen pada ikan yang bertelur, sedangkan teknik lainnya seperti transfer gen mediasi vektor retroviral digunakan pada ikan yang melahirkan anak (tanpa bertelur) (Sarmasik, 2002).
Mikroinjeksi merupakan teknik yang dipertimbangkan paling efektif dalam transfer gen pada vertebrata tingkat tinggi seperti tikus dan domba. Dalam teknik ini, transgen secara langsung dimikroinjeksikan ke dalam pronukleus telur- telur yang telah dibuahi (Sarmasik, 2002). Aplikasi mikroinjeksi pada ikan sendiri memiliki beberapa kelemahan seperti nukleus dari telur yang telah dibuahi sangat sulit diidentifikasi di bawah mikroskop karena nukleus telur kecil dan volume sitoplasma yang besar, korion telur yang sangat keras seperti telur pada ikan salmon yang menyebabkan telur sulit ditembus oleh jarum mikroinjeksi (Yoshizaki, 2001). Untuk mengatasi masalah-masalah ini, beberapa peneliti membuat ikan transgenik dengan cara penyuntikan gen dengan jumlah copy yang banyak ke dalam sitoplasma telur yang telah dibuahi sebagai alternatif penyuntikan ke inti telur (Alimuddin et al., 2003). Untuk mengatasi masalah korion telur yang keras, korion dapat dibuang dengan menggunakan proteinase dan selanjutnya telur dapat disuntik dengan mudah (Ueno et al., 1994 dalam
Alimuddin et al., 2003). Selain itu, perkembangan embrio yang cepat setelah pembuahan dan sel tunggal telur yang telah dibuahi dalam beberapa jam berubah menjadi embrio multiseluler. Ini mengimplikasikan bahwa jika injeksi transgen tidak dilakukan secepatnya dalam beberapa jam pertama, walaupun injeksi itu berhasil akan menghasilkan ikan dewasa yang mosaik untuk transgen (Rahman & Maclean, 1991). Umumnya transgen yang diinjeksikan pada tahap 1 sel dapat terintegrasi ke dalam genom semua sel. Akan tetapi integrasi ini seringkali hanya ada setelah beberapa kali pembelahan sel yang menghasilkan embrio yang tidak membawa transgen atau disebut mosaik (Beaumont & Hoare, 2003).
2.3 Promoter
Promoter merupakan sekuen DNA yang terletak upstream (terminal 5’)
dari titik awal transkripsi suatu gen (Toha, 2001) yang berperan dalam mengatur letak, waktu dan tingkat ekspresi gen yang akan muncul (Beaumont & Hoare,
2003). Menurut Glick dan Pasternak (2003), suatu promoter yang kuat merupakan promoter yang memiliki aktivitas yang tinggi terhadap RNA polimerase yang mengakibatkan daerah yang berbatasan downstream dicetak
secara teratur. Promoter inilah yang menjadi kekuatan gen untuk mengekspresikan ciri-cirinya pada tingkat yang sangat tinggi dan juga potensial dalam mempengaruhi gen yang lain dalam suatu organisme (Anderson, 2004).
Promoter pertama yang digunakan dalam bioteknologi ikan diisolasi dari genom virus (misalnya Rous Sarcoma Virus (RSV), Simian Virus (SV40) atau Cytomegalovirus (CMV)), mamalia (misalnya mouse metallothionein-1 (mMT- 1)), burung (misalnya promoter β-aktin dari ayam) atau katak Xenopus laevis (1α-
enhanced promoter). Tingkat ekspresi gen yang dihasilkan ternyata rendah sehingga pencarian promoter-promoter ikan yang lebih efektif tetap dilakukan secara intensif selama 15 tahun terakhir (Teufel et al., 2002).
Promoter β-aktin dari berbagai spesies ikan telah dilaporkan sebagai promoter ubiquitous yang efisien dalam penelitian ikan transgenik. Promoter β- aktin dari ikan medaka telah diisolasi dan dengan menggunakan gen reporter lacZ menunjukkan ekspresi yang kuat pada ikan medaka, promoter β-aktin dari ikan zebra juga menunjukkan hal yang sama setelah diinjeksikan pada ikan zebra (Hwang et al., 2003). Kedua promoter di atas disebut sebagai promoter homolog yaitu promoter yang menggunakan konstruksi gen homolog spesies yaitu donor dan penerima berasal dari spesies yang sama, sedangkan promoter heterolog adalah promoter yang menggunakan konstruksi gen heterospesies yaitu donor dan penerima donor berasal dari spesies yang berbeda dengan ikan transgenik yang dihasilkan (Rajesh & Majumdar, 2006). Berdasarkan beberapa penelitian penggunaan promoter homolog menghasilkan ekspresi gen lebih baik dibandingkan dengan promoter heterolog. Seperti pada ikan zebra menggunakan promoter β-aktin dari ikan kakap merah menunjukkan tingkat kelangsungan hidup hanya 63% dibandingkan dengan penggunaan promoter ini pada spesies yang sama tingkat kelangsungan hidupnya mencapai 95% (Kato et al., 2007). Menurut
Palmiter et al. (1982) dalam Nam et al. (2008), bahwa suatu promoter yang
berasal dari spesies yang berbeda (heterolog) kemungkinan tidak mengenal RNA polimerase inang yang mengendalikan ekspresi gen. Selain itu, penggunaan
promoter heterolog secara potensial mengakibatkan regulasi ”feedback negative”. Namun, beberapa promoter β-aktin heterolog yang telah digunakan dalam penelitian transgenesis dapat menghasilkan ekspresi gen yang baik pada ikan uji seperti penelitian yang dilakukan oleh Yoshizaki (2001) dengan menggunakan β- aktin dari ikan medaka ternyata mampu mengekspresikan gen GFP yang kuat pada ikan rainbow trout.
Faktor-faktor transkripsi yang mempengaruhi aktivitas promoter β-aktin adalah boks TATA, boks CCAAT dan CC(A/T)6GG atau motif CArG. Motif CArG berperan dalam pengaturan ekspresi transgen (Takagi et al., 1994).
Menurut Liu et al. (1990), motif CArG berada pada 2 tempat, yang pertama ada di
antara boks CCAAT dan boks TATA, dan yang kedua berada pada intron 1. Motif CArG ysng terletak pada intron 1 berfungsi sebagai peningkat (enhancer) dalam
aktivitas transkripsi. Boks TATA merupakan elemen yang umum dijumpai pada sekuens promoter yang berperan sebagai tempat melekatnya (binding) RNA polimerase pada saat transkripsi RNA akan berlangsung (Glick & Pasternak, 2003). Secara in vitro penghapusan boks TATA membuat promoter tidak aktif dan pada in vivo aktivitasnya menurun (Quitschke et al., 1989). Selanjutnya dikatakan aktivitas promoter β-aktin tergantung pada keberadaan elemen CCAAT, dengan adanya elemen ini tingkat aktivitas tertinggi promoter β-aktin tercapai (Quitschket et al., 1989).
Pembuatan konstruksi gen memerlukan promoter dengan elemen CCAAT, boks TATA, motif CArG, ekson 1 dan intron 1 (Higashijima et al., 1997). Dalam proses transkripsi mula-mula pra-mRNA yang besar disintesis, disebut heterogenous nuclear RNA (hnRNA) yang di dalamnya terkandung bagian intron yaitu ruas-ruas gen yang akan hilang pada mRNA fungsional (mature) dan ekson
yaitu ruas-ruas gen yang ditranskripsikan ke dalam mRNA fungsional (mature) dan akan ditranslasi menjadi protein (Jusuf, 2001). Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Hwang et al. (2003), dari penderetan, ukuran dan variasi sekuen
antara ikan nila, ikan mas dan ikan medaka dalam intron, elemen promoter dan ekson ternyata promoter β-aktin antara ketiga ikan ini terdapat kemiripan nukleotida. Persentase homologi sekuen genom β-aktin ikan nila termasuk intron 1 adalah 54,7% dengan ikan medaka dan 48,9% dengan ikan mas. Namun, jika
dibandingkan dengan ekson 1 persentase homologi sekuen genom β-aktin ikan nila adalah 86,8% dengan ikan medaka dan 74,1% dengan ikan mas. Hal ini menunjukkan bahwa promoter β-aktin dari ikan nila memiliki homologi yang lebih tinggi pada ikan medaka dibandingkan dengan ikan mas.