BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.3 Teknik Pemisahan Senyawa Metabolit Sekunder Daun Bunga Matahari
Ekstraksi adalah suatu proses pemisahan substansi dari campurannya dengan menggunakan pelarut yang sesuai (Kristanti, dkk., 2006). Ekstraksi atau disebut dengan penyarian adalah proses pemisahan zat yang terdapat dalam sel, ditarik oleh cairan penyari (pelarut) sehingga zat aktif larut dalam cairan penyari. Pada umumnya penyarian akan bertambah bila permukaan serbuk sampel yang bersentuhan dengan penyari semakin luas (Baraja, 2008).
Maserasi (macerace = mengairi, melunakkan) adalah cara ekstraksi yang paling sederhana (Ansel,1989 dalam Baraja, 2008). Maserasi dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari (pelarut). Pelarut akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif. Zat aktif akan larut, karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel dengan yang di luar sel, maka larutan yang terpekat didesak ke luar. Peristiwa tersebut berulang sehingga terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar dan di dalam sel.
Pada penyarian dengan maserasi, perlu dilakukan pengadukan. Pengadukan diperlukan untuk meratakan konsentrasi larutan diluar butir serbuk simplisia, sehingga dengan pengadukan tersebut tetap terjaga adanya derajat perbedaan konsentrasi yang sekecil-kecilnya antara larutan di dalam sel dengan larutan di luar sel.
Pemilihan pelarut untuk proses maserasi akan memberikan efektifitas yang tinggi dengan memperhatikan kelarutan senyawa bahan alam dalam pelarut
tersebut. Secara umum pelarut-pelarut golongan alkohol merupakan pelarut yang paling banyak digunakan dalam proses isolasi senyawa organik bahan alam, karena dapat melarutkan seluruh senyawa metabolit sekunder (Lenny, 2006).
Ekstraksi beberapa senyawa metabolit sekunder dari tanaman daun bunga Matahari pada penelitian ini dilakukan dengan ekstraksi maserasi karena tekniknya yang sederhana. Secara umum ekstraksi senyawa metabolit sekunder dari seluruh bagian tumbuhan seperti bunga, buah, daun, kulit batang dan akar menggunakan metode maserasi (Lenny, 2006). Penekanan utama pada maserasi adalah tersedianya waktu kontak yang cukup antara pelarut dan jaringan yang diekstraksi (Guenther, 1987).
Sifat kelarutan zat didasarkan pada teori like dissolves like, zat yang bersifat polar akan larut dalam pelarut polar dan zat yang bersifat nonpolar akan larut dalam pelarut nonpolar (Khopkar, 2003). Pelarut yang sering digunakan dalam proses ekstraksi adalah aseton, etil klorida, etanol, heksana, isopropil alkohol dan metanol. Ekstraksi pada penelitian ini dilakukan secara berturut-turut mulai dari pelarut nonpolar, semi polar dan polar untuk mendapatkan kandungan kimia (golongan senyawa metabolit sekunder) yang dimiliki tanaman daun bunga Matahari berdasarkan tingkat kepolaran pelarut tersebut.
Pelarut yang digunakan pada penelitian ini yaitun-heksana, diklorometana dan metanol yang didasarkan pada pemilihan variasi pelarut yang sesuai. Pelarut-pelarut tersebut memiliki titik didih yang cukup rendah agar Pelarut-pelarut dapat mudah diuapkan tanpa menggunakan suhu yang tinggi, bersifat inert, dapat melarutan senyawaan yang sesuai dengan cukup cepat serta memiliki harga yang terjangkau
(Guenther, 2006). Kelarutan terhadap air dari pelarut-pelarut tersebut juga semakin tinggi dengan semakin tingginya tingkat kepolarannya. Titik didih masing-masing pelarut tersebut adalah n-heksana adalah 68,7 oC; diklorometana 40 oC dan metanol 65 oC (Sudarmadji, dkk., 2003). Menurut Ikpevan (2013), metanol dapat menarik senyawa saponin, tanin, flavonoid, dan glikosida.
Kepolaran suatu pelarut menunjukkan tingkat kelarutan pelarut air ataupun pelarut organik terhadap suatu bahan. Kepolaran ini timbul dari perbedaan dua kutub (pole) kelarutan. Kecenderungan suatu bahan yang lebih larut dalam air disebut memiliki sifat yang polar dan sebaliknya yang cenderung lebih larut dalam pelarut organik disebut nonpolar. Secara fisika, tingkat polaritas ini dapat ditunjukkan dengan lebih pasti melalui pengukuran konstanta dielektrik (D) suatu pelarut. Semakin besar konstanta dielektrikum suatu pelarut tersebut semakin polar seperti konstanta dielektrikum pada pelarut n-heksana 1,89; diklorometana 9,1 dan metanol 33 (Sudarmadji, dkk., 2003).
Menurut Widianti (2012), proses ekstraksi harus dilakukan dengan menggunakan pelarut yang sesuai pelarut polar digunakan unuk mengekstrak komponen polar pula, dan sebaliknya. Selain itu, rasio pelarut dan sampel yang hendak diekstrak, suhu yang digunakan selama proses ekstraksi juga turut menentukan hasil yang didapatkan selama proses ekstraksi.
Metode maserasi digunakan untuk mengekstraksi contoh yang relatif mudah rusak oleh panas. Metode ini dilakukan dengan merendam contoh dalam suatu pelarut baik tunggal maupun campuran dengan waktu tertentu yang umumnya 1-2 hari perendaman tanpa diberikan pemanasan. Kelebihan metode ini
di antaranya relatif sederhana, yaitu tidak memerlukan alat-alat yang rumit, relatif mudah, murah, dapat menghindari kerusakan dan hilangnya senyawa-senyawa aktif yang bersifat volatil. Kelemahan metode ini membutuhkan waktu relatif lama dan penggunaan pelarut yang tidak efektif dan efisien (Meloan, 1999).
Metode ekstraksi yang digunakan pada penelitian Rohimah (2008) adalah maserasi. Adapun mekanisme dari metode maserasi, yakni adanya proses difusi pelarut ke dalam dinding sel tumbuhan untuk mengekstrak senyawa-senyawa yang ada dalam tumbuhan tersebut dan biasanya digunakan untuk sampel yang belum diketahui sifat dan pencirian senyawanya.
Pada penelitian ini menggunakan metode maserasi bertingkat. Metode tersebut merupakan metode ekstraksi bertahap dengan menggunakan pelarut yang berbeda. Metode maserasi bertingkat lebih banyak digunakan dalam mengekstraksi senyawa antimikroba disebabkan lebih efisien karena dalam prosesnya akan didapatkan lebih dari satu jenis senyawa antimikroba tergantung jenis pelarut yang digunakan (Mawaddah, 2008).
2.3.2 Kromatogafi Lapis Tipis (KLT)
Kromatografi adalah suatu nama yang diberikan untuk teknik pemisahan tertentu. Pada dasarnya semua cara kromatografi menggunakan dua fase yaitu fase diam dan fase gerak. Pemisahan-pemisahan ini bergantung pada gerakan relatife dari dua fase ini (Sastrohamidjojo, 2007). Salah satu cara pemisahan adalah Kromatografi Lapis Tipis. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan salah satu kromatografi yang berdasarkan proses adsorpsi. Lapisan yang dipisahkan terdiri
atas fase diam dan fase gerak. Fase diam yang dapat digunakan adalah silika atau alumina yang dilapiskan pada lempeng kaca atau alumunium. Jika fase diam berupa silika gel maka bersifat asam, jika fase alumina maka bersifat basa. Fase gerak atau larutan pengembang biasanya digunakan pelarut organik atau bisa juga campuran pelarut organik-anorganik (Gritter, 1991).
Kromotografi lapis tipis digunakan untuk tujuan analitik dan preparatif. KLT analitik digunakan untuk menganalisa senyawa organik dalam jumlah kecil dan menentukan pelarut yang tepat untuk pemisahan dengan KLT preparatif. KLT preparatif digunakan untuk memisahkan campuran senyawa dari sampel dalam jumlah besar berdasarkan fraksinya. Senyawa yang terpisah kemudian dikeruk dan dikumpulkan tiap-tiap lapisan untuk analisa dengan spektrofotometer UV-Visible, IR atau kolorimeter dengan reagen kromogenik (Khopkar, 2003).
Lapisan tipis seperti pada plat silika gel F254yang digunakan dalam suatu penelitian mengandung indikator flourosensi yang ditambahkan untuk membantu penampakan bercak warna pada lapisan yang telah dikembangkan. Indikator fluorosensi adalah senyawa yang memancarkan sinar, seperti dengan lampu UV. Jadi, lapisan yang mengandung indikator fluorosensi akan bersinar jika disinari pada panjang gelombang yang tepat. Jika senyawa pada bercak yang akan ditampakkan mengandung ikatan rangkap terkonjugasi atau cincin aromatik berbagai jenis, sinar UV akan mengeksitasi tidak dapat mencapai indikator fluorosensi dan tidak ada cahaya yang dipancarkan. Hasilnya ialah bercak gelap dengan latar belakang yang bersinar. Cara ini sangat peka dan tidak merusak senyawa yang ditampakkan. Indikator fluorosensi yang paling berguna ialah
sulfide anorganik yang memancarkan cahaya jika disinari pada 254 nm. Indikator fluorosensi terdapat dalam penyerap niaga dan lapisan siap pakai sekitar 1 % dan tampaknya tidak berperan dalam proses kromatografi. Ada juga indikator fluorosensi organik yang memancarkan cahaya jika disinari pada 360 nm, tetapi kurang begitu disenangi karena indikator ini senyawa organik dan kadang-kadang bergerak dalam sistem kromatografi. Beberapa senyawa organik bersinar atau berfluorosensi sendiri pada 254 nm atau 360 nm dan dapat tampak dengan mudah (Gritter, 1991).
Hasil yang diperoleh diidentifikasikan di bawah lampu UV (254 dan 366 nm) ditandai dengan ada atau tidaknya fluorosensi. Jika tidak tampak dengan cara di atas, maka dilakukan secara kimia yaitu penyemprotan dengan pereaksi yang sesuai (Auterhoff, 1987).
Sudjadi (1988) pada UV 254 nm, lempeng akan berfluorosensi sedangkan sampel akan tampak berwarna gelap. Penampakan noda pada lampu UV 254 nm adalah karena adanya daya interaksi antara sinar UV dengan indikator fluorosensi yang terdapat pada lempeng. Fluorosensi cahaya yang tampak merupakan emisi cahaya yang dipancarkan oleh komponen tersebut ketika elektron yang tereksitasi dari tingkat energi dasar ke tingkat energi yang lebih tinggi kemudian ke keadaan semula sambil melepaskan energi.
Jika senyawa pada bercak yang akan ditampakkan mengandung ikatan rangkap terkonjugasi atau cincin aromatik jenis apa saja, sinar UV yang mengeksitasi tidak dapat mencapai indikator fluorosensi, dan tidak ada cahaya
yang dipancarkan. Hasilnya ialah bercak gelap dengan latar belakang yang bersinar (Gritter, 1991).
Pada UV 366 nm noda akan berfluorosensi dan lempeng akan berwarna gelap. Penampakan noda pada lampu UV 366 nm adalah karena adanya daya interaksi antara sinar UV dengan gugus kromofor yang terikat oleh aukdokrom yang ada pada noda tersebut. Fluorosensi cahaya yang tampak merupakan emisi cahaya yang dipancarkan oleh komponen tersebut ketika elektron yang tereksitasi dari tingkat energi dasar ke tingkat energi yang lebih tinggi kemudian kembali ke keadaan semula sambil melepaskan energi. Sehingga noda yang tampak pada lampu UV 366 nm terlihat terang karena silika gel yang digunakan tidak berfluorosensi pada sinar UV 366 nm (Sudjadi, 1988).
Bercak pemisahan pada KLT umumnya merupakan bercak yang tidak berwarna. Untuk penentuan dapat dilakukan secara kimia, fisika maupun biologi. Cara kimia yang biasa dilakukan adalah dengan mereaksikan bercak dengan suatu pereaksi melalui cara penyemprotan sehingga bercak menjadi jelas. Untuk penyemprotan lempeng KLT dengan reagen kromogenik yang akan bereaksi secara kimia dengan seluruh solut yang mengandung gugus fungsional tertentu sehingga bercak menjadi berwarna. Kadang-kadang lempeng dipanaskan terlebih dahulu untuk mempercepat reaksi pembentukan warna dan intensitas warna bercak. Sebagai contoh digunakan pereaksi Dragendorf dan Wagner untuk golongan alkaloid. Liebernen-Burchard untuk golongan triterpenoid/steroid, FeCl3 untuk golongan tanin dan lain sebagainya (Gandjar, 2007).
Identifikasi dari senyawa-senyawa yang terpisah pada lapisan tipis menggunakan harga Rf. Harga Rf didefinisikan sebagai berikut:
Harga Rf
=
... (2.1)
KLT juga merupakan suatu cara yang umum dilakukan menggunakan kromatografi kolom. Jadi secara ringkas KLT terutama berguna untuk tujuan (Kristanti dkk., 2006) :
a. Mencari pelarut yang sesuai untuk kromatografi kolom b. Analisis fraksi-fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom c. Memonitor jalannya suatu reaksi kimia
d. Identifikasi senyawa (uji kemurnian)
2.4 Senyawa Aktif Metabolit Sekunder dalam Tanaman