BAB III. METODE PENELITIAN
G. Teknik Pengumpulan Data
Penelitian ini terdiri dari beberapan tahapan penelitian yang meliputi, tahap persiapan, tahap pelaksanaan yang terdiri dari pembuatan ekstrak bawang lanang (A. sativum L.), pembuatan media uji Nutrient Agar (NA), sterilisasi alat dan media, penyiapan mikroorganisme uji, uji kemurniaan mikroorganisme uji dan tahap perlakuan yang terdiri dari uji aktivitas antibakteri, uji Kadar Hambat Minimum (KHM) dan uji Kadar
Bunuh Minimum (KBM). Berikut ini tahapan yang dilakukan dalam penelitian:
1. Tahap Persiapan
Pada tahap ini peneliti mendata alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian. Sampel bawang lanang dibeli di Pasar Beringharjo Yogyakarta sesuai dengan kebutuhan dalam penelitian. Populasi mikroorganisme uji yang didapatkan dari Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada dilakukan kultur ulang terlebih dahulu untuk memperbanyak populasi mikroorganisme uji. Langkah kerja yang dilakukan ialah dengan menyiapkan terlebih dahulu media NA miring di tabung reaksi lalu menggoreskan secara zig-zag mikroorganisme uji lalu dinkubasi selama 24 jam.
2. Tahap Pelaksanaan
a. Pembuatan Ekstrak Bawang Lanang (A. sativum L.)
Bawang lanang yang telah dibeli dari Pasar Beringharjo terlebih dahulu dikupas bagian kulitnya lalu dicuci bersih di bawah air mengalir hingga benar-benar bersih. Bawang yang baik ialah dilihat dari warnanya yang putih bersih mengkilat tanpa adanya noda-noda hitam pada bawang. Selanjutnya bawang tersebut ditimbang sebanyak 100 gram. Bawang yang telah ditimbang selanjutnya disterilkan secara
kimia. Sterilisasi dilakukan dengan melarutkan 10 ml Natrium hipoklorit dalam 3 liter akuades. Bawang tersebut direndam selama 15 menit lalu dibilas dengan menggunakan akuades steril.
Ekstrak diperoleh dengan cara mengambil bawang yang telah disterilisasi tadi, lalu dimasukkan dalam blender serta menambah 100 ml pelarut etanol konsentrasi 99.9%. Proses blender harus cukup lama agar bawang tersebut benar-benar hancur secara sempurna. Kemudian, bubur bawang disaring sebanyak 3 kali penyaringan. Pertama, disaring menggunakan alat saring biasa dengan tujuan untuk mengeluarkan ampas-ampas bubur bawang. Kedua, hasil saringan pertama disaring menggunakan kain saring agar bubur halus yang masih bercampur dengan ekstrak bawang keluar. Ketiga, disaring menggunakan kertas saring hingga didapatkan ekstrak bawang lanang (A. sativum L.) 100%.
Setelah didapatkan ekstrak dengan konsentrasi 100%, ekstrak diencerkan lagi untuk mendapatkan ekstrak dengan konsentrasi 15%, 30%, 45%, 60%, 75% dan 90% dengan menambahkan pelarut etanol. Hasil pengenceran ekstrak dapat digunakan dalam uji aktivitas antibakteri. Berbagai konsentrasi ekstrak pada tiap perlakuan dapat dilihat pada gambar berikut:
Gambar 3.1.Perlakuan dengan konsentrasi ekstrak bawang lanang (Allium sativum L.) 15%, 30%, 45%, 60%, 75%, dan 90% dengan masing perlakuan terdapat 3 kali pengulangan pada tiap cawan petri terhadap bakteri uji yaitu bakteri gram positif S. aureus
Gambar 3.2. Perlakuan dengan konsentrasi ekstrak bawang lanang (Allium sativum L.) 15%, 30%, 45%, 60%, 75%, dan 90% dengan masing
15% 15% 15% 30% 30% 30% 45% 45% 45% 60% 60% 60% 75% 75% 75% 90% 90% 90% 15% 15% 15% 30% 30% 30% 45% 45% 45% 60% 60% 60% 75% 75% 75% 90% 90% 90%
perlakuan terdapat 3 kali pengulangan pada tiap cawan petri terhadap bakteri uji yaitu bakteri gram negatif E. coli.
b. Pembuatan Media Uji Nutrient Agar (NA)
NA sebanyak 10 gram dilarutkan ke dalam 500 ml akuades lalu dipanaskan dan dihomogenkan dengan menggunakan alat pemanas dan magnetik stirer. Media NA harus benar-benar homogen terlihat dari warna kuning bening yang menunjukkan bahwa NA telah bercampur secara baik dengan akuades. NA sebanyak 50 ml dipisahkan untuk membuat agar miring pada tabung reaksi dengan masing-masing tabung berisi 10 ml NA yang akan digunakan untuk perbanyakan bakteri/ mikroorganisme uji. Sisanya dimasukkan dalam erlenmeyer sebagai stok untuk membuat media NA di cawan petri yang akan digunakan sebagai media tumbuhnya bakteri.
c. Sterilisasi Alat dan Media
Alat dan bahan yang akan digunakan dalam penelitian disterilisasi untuk menghindari terjadinya kontaminasi dalam praktikum. Pertama, alat-alat yang akan digunakan dalam penelitian didetoks terlebih lalu dikeringkan. Selanjutnya alat yang telah didetoks bersama dengan bahan media disterilisasi dalam autoklaf dengan tekanan 121°C selama 15 menit. Alat-alat yang disterilkan dengan
menggunakan autoklaf ialah alat yang biasanya terbuat dari kaca seperti tabung reaksi, cawan petri, erlenmeyer. Alat lainnya seperti pinset, kaca benda cukup dengan dipijarkan di atas bunsen. Sedangkan batang bengkok di celupkan kedalam alkohol sehingga saat akan digunakan cukup dilewatkan diatas bunsen.
d. Penyiapan Mikroorganisme Uji
Mikroorganisme uji yang akan digunakan dalam penelitian disiapkan dalam tabung reaksi dan cawan petri. Pertama, untuk tabung reaksi disiapkan mikroorganime untuk memperbanyak populasi mikroorganisme. Diambil kultur murni bakteri S. aureus dan E. coli secara aseptis menggunakan jarum ose lalu digoreskan secara zig-zag dalam agar miring NA lalu diinkubasi selama 24 jam.
Mikroorganisme uji yang akan digunakan dalam uji aktivitas antibakteri dilakukan pengenceran bertingkat terlebih dahulu yang bertujuan untuk mengurangi jumlah populasi bakteri. Satu ose bakteri diambil dari tabung reaksi yang berisi bakteri lalu kultur murni tersebut dimasukkan dalam tabung reaksi lain yang telah berisi 10 ml akuades steril. Selanjutnya, suspensi bakteri tersebut dihomogenkan dengan menggunakan vortex kurang lebih selama 1 menit hingga suspensi bakteri tersebut hingga benar-benar homogen. Untuk pengenceran selanjutnya diambil 1 ml suspensi bakteri dari tabung
reaksi awal dan ditambahkan akuades steril 9 ml dan demikian seterusnya hingga pengenceran mencapai hingga pengenceran kelima (10-5). Kemudian diambil 0,1 ml suspensi bakteri dengan menggunakan pipet volume dan diletakkan suspensi bakteri tersebut di atas media agar NA padat dalam cawan petri. Dengan menggunakan batang bengkok/ trigalski disapukan atau diratakan suspensi bakteri secara merata di atas media.
e. Uji Kemurnian Mikroorganisme Uji
Mikroorganisme uji yang digunakan dalam penelitian ini ialah bakteri S. aureus dan E. coli. Uji kemurnian mikroorganisme tersebut dengan beberapa cara yaitu:
1) Pengamatan morfologi koloni
Koloni bakteri diamati dari hasil teknik streak plate. Streak plate ialah cara untuk menginokulasi bakteri dengan cara digoreskan pada kuadran yang telah dibuat. Kuadran yang digunakan ialah 4 kuadran dan diharapkan pada kuadran 4 akan didapatkan koloni bakteri terpisah sehingga bisa diamati bentuk dan warna dari koloni bakteri tersebut. Empat kuadran yang digunakan dalam penelitian seperti pada gambar di bawah ini:
2) Pengamatan Morfologi Sel
Mikroorganisme uji yang akan diamati morfologi selnya dilakukan dengan metode pengecatan negatif. Langkah kerja dalam pengecatan negatif ialah kaca benda terlebih dahulu dibersihkan dengan menggunakan alkohol lalu dikeringanginkan. Selanjutnya mengambil satu ose koloni bakteri dan diletakkan di atas permukaan kaca benda lalu ditetesi dengan tinta cina dan dihomogenkan dengan menggunakan tusuk gigi. Selanjutnya setelah bakteri dan tinta cina telah homogen, diambil kaca benda lainnya yang terlebih dahulu juga telah dibersihkan dengan alkohol. Kaca benda tersebut diletakkan di ujung kaca benda yang ada bakterinya hingga membentuk sudut 45° lalu ditarik hingga bakterinya rata dan tipis. Pengamatan dilakukan di bawah
I II
mikroskop hingga perbesaran 100 x 10 dengan menambahkan minyak emersi secukupnya agar sel bakteri bisa terlihat lebih jelas.
3) Pengecatan Gram
Langkah kerja dalam pengecatan gram ialah awalnya bersihkan kaca benda menggunakan alkohol lalu dikeringanginkan. Kemudian letakkan satu ose koloni bakteri di atas permukaan kaca benda dan difiksasi dengan menambahkan larutan akuades steril. Fiksasi dilakukan di atas bunsen hingga kering. Tujuan fiksasi ialah agar koloni bakteri dapat menempel pada kaca benda sehingga pada saat dicuci bakteri tidak hanyut bersama air. Setelah kering bakteri tersebut, ditetesi dengan larutan kristal violet secukupnya hingga menutupi bagian bakteri selama 60 detik. Setelah 60 detik, dicuci di bawah air mengalir lalu diberi iodin yang berfungsi untuk mengikat warna dasar ungu pada bakteri selama 60 detik. Selanjutnya ditetesi alkohol yang berfungsi untuk dekolorisasi dan terakhir memberikan safranin yang berfungsi memberi warna merah.
Di antara bermacam-macam bakteri yang dicat, ada yang dapat menahan zat warna ungu (kristal violet) dalam tubuhnya meskipun telah didekolorisasi dengan alkohol. Dengan demikian tubuh bakteri itu tetap berwarna ungu meskipun disertai dengan pengecatan oleh zat warna kontras, warna ungu itu tetap
dipertahankan. Bakteri yang memberi reaksi semacam ini dinamakan bakteri gram positif. Sebaliknya, bakteri yang tidak dapat menahan zat warna setelah dekolorisasi dengan alkohol akan kembali menjadi tidak berwarna dan bila diberikan pengecatan dengan zat warna safranin akan berwarna sesuai warna safranin yaitu warna merah dan disebut bakteri gram negatif (Irianto, 2006).
3. Tahap Perlakuan
a. Uji Aktivitas Antibakteri
Penelitian ini menggunakan cakram kertas/ paper disk untuk menghambat aktivitas dari bakteri. Cakram kertas dengan diameter 0,5 cm awalnya diambil secara aseptis menggunakan pinset lalu direndam dalam masing-masing konsentrasi ekstrak bawang yaitu konsentrasi 15%, 30%, 45%, 60%, 75% dan 90% yang masing-masing terdiri atas 3 kali ulangan. Digunakan pula akuades steril sebagai kontrol negatif dan kloramfenikol sebagai kontrol positif. Lama perendaman selama 30 menit dimaksudkan agar esktrak bawang dapat terserap secara baik dan benar pada cakram kertas.
Ekstrak yang digunakan dikatakan efektif apabila terlihat daerah yang dihambat oleh ekstrak tersebut. Daerah hambat akan terlihat lebih bening daripada daerah sekitarnya. Daerah hambat diukur menggunakan jangka sorong. Daerah hambat diukur dengan
meletakkan jangka sorong dari batas luar cakram kertas hingga batas terpanjang dan batas terpendek daerah hambat yang terbentuk sehingga diperoleh jari-jari daerah hambat terpanjang dan jari-jari daerah hambat terpendek. Setelah didapatkan jari-jari daerah hambat terpanjang dan terpendek pada masing-masing kuadran, lalu nilainya dirata-rata dan dihitung diameternya sehingga akan didapatkan nilai diameter zona hambat pada masing-masing konsentrasi ekstrak bawang lanang.
b. Uji Kadar Hambat Minimal (KHM)
Berdasarkan hasil pengujian yang telah dilakukan sebelumnya, akan didapat konsentrasi minimal antibakteri. Konsentrasi minimal tersebut digunakan untuk menguji nilai Kadar Hambat Minimal (KHM).
Cara mengujinya dengan menggunakan suspensi bakteri yang telah diencerkan dengan pengenceran bertingkat lalu diambil sebanyak 1 ml dituang ke dalam cawan petri steril dan ditambahkan ekstrak sampel yang digunakan lalu dituang media NA yang masih panas sekitar suhu 45°C ke dalam cawan petri tersebut dan diinkubasi selama 24 jam. Penentuan nilai KHM dilihat dari konsentrasi terendah yang tidak ditumbuhi bakteri.
c. Uji Kadar Bunuh Minimal (KBM)
Setelah dilakukan pengujian pada KHM, selanjutnya menguji Kadar Bunuh Minimal (KBM) dengan cara menggoreskan hasil yang ditetapkan sebagai KHM dengan menggunakan cutton bud steril lalu diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35°C dan media yang tetap terlihat jernih setelah diinkubasi ditetapkan sebagai Kadar Bunuh Minimal (KBM).