Teknik spektroskopi adalah salah satu teknik analisis kimia–fisika yang mengamati tentang interaksi atom atau molekul dengan radiasi elektromagnetik. Ada dua macam instrumen pada teknik spektroskopi yaitu spektrometer dan spektrofotometer. Instrumen yang memakai monokromator celah tetap pada bidang fokus disebut sebagai spektrometer. Apabila spektrometer tersebut dilengkapi dengan detektor yang bersifat fotoelektrik maka disebut spektrofotometer (Muldja, 1995).
Radiasi elekromagnetik adalah energi yang dipancarkan menembus ruang dalam bentuk gelombang-gelombang. Tiap tipe radiasi elektromagnetik dicirikan oleh panjang gelombangnya yaitu jarak antara puncak panjang gelombang yang satu ke puncak panjang gelombang berikutnya. Panjang gelombang cahaya tampak berkisar antara 400 nm sampai 750 nm, panjang gelombang yang sedikit lebih pendek daripada panjang gelombang cahaya tampak jatuh pada daerah ultraviolet, sedangkan yang sedikit lebih panjang termasuk dalam daerah inframerah (Fessenden, 1982).
2.5.1 Spektrofotometri Ultra Violet
Serapan molekul di dalam derah ultra violet dan terlihat dari spektrum bergantung pada struktur ultra elektronik dari molekul. Penyerapan sejumlah energi, menghasilkan percepatan dari elektron dalam orbital tingkat dasar ke orbital yang berenergi lebih tinggi di dalam keadaan tereksitasi (Silverstein, 1986).
Dengan bertambahnya kepolaran pelarut, pada transisi elektron terjadi pergeseran panjang gelombang. Bentuk puncak bergeser ke panjang gelombang lebih pendek (pergeseran biru atau hipsokromik) disebabkan bertambahnya solvasi pasangan elektron sehingga berakibat energinya turun. Sedangkan pergeseran ke panjang gelombang lebih panjang (pergeseran merah atau batokromik) disebabkan gaya polarisasi antara pelarut
dan spesies, berakibat menurunnya selisih tingkat energi eksitasi dan tingkat tidak tereksitasi (Khopkar, 1990).
Spektrum flavonoida biasanya ditentukan dalam larutan dengan pelarut metanol (MeOH) atau etanol (EtOH). Spektrum khas terdiri atas dua maksimal pada rentang 240- 285 nm (pita II) dan 300-550 nm (pita I). Kedudukan yang tepat dan kekuatan nisbi maksimal tersebut memberikan informasi yang berharga mengenai sifat flavonoida dan pola oksigenasinya. Ciri khas spektrum tersebut ialah kekuatan nisbi yang rendah pada pita I dalam dihidroflavon, dihidroflavonol, dan isoflavon serta kedudukan pita I pada spektrum khalkon, auron dan antosianin yang terdapat pada panjang gelombang yang tinggi. Ciri spektrum golongan flavonoida utama dapat ditunjukkan sebagai berikut :
Tabel 2.5 Rentangan Serapan spektrum UV-Visible golongan flavonoida
Pita II (nm) Pita I (nm) Jenis flavonoida
250-280 310-350 Flavon
250-280 330-360 Flavonol (3-OH tersubstitusi)
250-280 350-385 Flavonol (3-OH bebas)
245-275 310-330 bahu Kira-kira 320 puncak
Isoflavon
Isoflavon (5-deoksi-6,7-dioksigenasi 275-295 300-330 bahu Flavanon dan dihidroflavonol 230-270
(kekuatan rendah) 340-390 Khalkon
230-270
(kekuatan rendah) 380-430 Auron
270-280 465-560 Antosianidin dan antosianin
2.5.2 Spektrofotometri Inframerah (FT-IR)
Kebanyakan komponen memiliki ikatan kovalen baik senyawa organik maupun senyawa anorganik, yang ditemukan menyerap frekuensi radiasi elektromagnetik pada daerah spektrum inframerah. Spektrum elektromagnetik daerah inframerah terletak pada panjang gelombang lebih panjang dibanding dengan daerah sinar tampak (400-800 nm) tetapi panjang gelombangnya lebih pendek dibanding dengan panjang gelombang radio (1 cm).
Pancaran inframerah yang kerapatannya kurang dari 100 cm -1 (panjang gelombang lebih daripada 100 µm) diserap oleh sebuah molekul organik dan diubah menjadi energi putaran molekul. Pancaran inframerah antara 10000 – 10 cm-1 diserap oleh sebuah molekul organik dan diubah menjadi energi vibrasi molekul. Spektrum vibrasi tampak bukan sebagai garis-garis melainkan berupa pita-pita. Hal tersebut disebabkan perubahan energi vibrasi tunggal selalu disertai sejumlah perubahan energi rotasi. Panjang gelombang daerah vibrasi inframerah pada 4000 cm-1 dan 666 cm-1 (2,5 – 1,5µm) (Silverstein, 1986).
Informasi Spektroskopi Inframerah menunjukkan tipe – tipe dari adanya gugus fungsi dalam satu molekul dan Resonansi Magnetik Inti yang memberikan informasi tentang bilangan dari setiap tipe dari atom hidrogen dan juga memberikan informasi yang menyatakan tentang lingkungan dari setiap tipe dari atom hidrogen. Kombinasinya dan data yang ada kadang – kadang menentukan struktur yang lengkap dari molekul yang tidak diketahui. (Pavia, 1979).
Vibrasi molekul dapat dibagi dalam dua golongan , yaitu :
1. Vibrasi regang
Di sini terjadi terus menerus perubahan jarak antara dua atom di didalam suatu molekul. Vibrasi regang ini ada dua macam yaitu vibrasi regang simetris dan tak simetri.
2.Vibrasi lentur
Di sini terjadi perubahan sudut antara dua ikatan kimia. Ada empat macam vibrasi lentur yaitu vibrasi lentur dalam bidang yang dapat berupa vibrasi scissoring atau vibrasi rocking dan vibrasi keluar bidang yang dapat berupa waging atau berupa twisting (Noerdin, 1985).
Banyaknya cuplikan yang diperlukan sangat bergantung pada spektrofotometer yang digunakan. Bila spektrofotometer jenis lama diperlukan 5-25 mg cuplikan untuk menghasilkan spektrum yang dapat diterima. Spektrofotometer yang lebih mutakhir yang dilengkapi dengan Transform-Fourier mampu manghasilkan spektrum sangat baik sdengan hanya 0,1 mg cuplikan (Markham, 1988).
2.5.3 Spektrometri Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR)
Spektrometri Resonansi Magnetik Inti (Nuclear Magnetic Resonance, NMR) merupakan alat yang berguna pada penentuan struktur molekul organik. Teknik ini memberikan informasi mengenai berbagai jenis atom hidrogen dalam molekul. Struktur NMR memberikan informasi mengenai lingkungan kimia atom hidrogen, jumlah atom hidrogen dalam setiap lingkungan dan struktur gugusan yang berdekatan dengan setiap atom hidrogen (Cresswell, 1982).
Pergeseran kimia adalah pengukuran medan dalam keadaan bebas. Semua proton- proton dalam satu molekul yang ada dalam lingkungan kimia yang serupa kadang-kadang menunjukkan pergeseran kimia yang sama. Setiap senyawa memberikan penaikan menjadi puncak absorbsi tunggal dalam spektrum NMR. Di dalam medan magnet, perputaran elektron-elektron valensi dari proton menghasilkan medan magnet yang melawan medan magnet yang digunakan. Hingga setiap proton dalam molekul dilindungi dari medan magnet yang digunakan dan bahwa besarnya perlindungan ini tergantung pada kerapatan elektron yang mengelilinginya. Makin besar kerapatan elektron yang
mengelilingi inti, maka makin besar pula medan yang dihasilkan yang melawan medan yang digunakan (Bernasconi,1995).
Senyawa yang paling lazim dan paling berguna dipakai sebagai acuan adalah tetrametilsilana (TMS). Beberapa keuntungan dari pemakaian standar internal TMS yaitu :
1. TMS mempunyai 12 proton yang setara sehingga akan memberikan spektrum puncak tunggal yang kuat.
CH3
CH3 Si CH3
CH3
2. TMS merupakan cairan yang mudah menguap, dapat ditambahkan kedalam larutan sampel dalam pelarut CDCl3 atau CCl4 (Silverstein, 1986).
Pada spektrometri RMI integrasi sangat penting. Harga integrasi menunjukkan daerah atau luas puncak dari tiap – tiap proton . Sedangkan luas daerah atau luas puncak tersebut sesuai dengan jumlah proton. Dengan demikian perbandingan tiap integrasi proton sama dengan perbandingan jumlah proton dalam molekul (Muldja,1995).
BAB 3