III. BAHAN DAN METODE
3.1. Tempat dan Waktu
Penelitian dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Tanaman, Departemen Budidaya Pertanian, Fakultas Pertanian IPB, Indonesian Centre for Biodiversity and Biotechnology (ICBB), Bogor dan PT. Saraswanti Indo Genetech (SIG), Bogor. Penelitian dimulai dari bulan Februari 2005 sampai Desember 2006.
3.2. Bahan dan Alat
Bahan tanaman yang digunakan untuk transformasi dan regenerasi adalah kalus tebu kultivar CB 6979, dan PA 183 yang berasal dari eksplan bagian daun muda yang masih menggulung dari pucuk tebu berumur 4 sampai 6 bulan. Plasmid rekombinan yang digunakan adalah pBIN1-ECS yang membawa gen fitase dan marka seleksi kanamisin melalui Agrobacterium tumefaciens GV 2260. Media untuk pertumbuhan kultur A. tumefaciens adalah media LB (komposisi media disajikan pada lampiran 1). Bahan untuk media tanam antara lain media induksi kalus dan media regenerasi (komposisi media disajikan pada lampiran 2). Bahan untuk isolasi DNA tanaman antara lain 250 mM NaOH, 250 mM HCl, dan buffer sample (500 mM Tris-HCl, 0.25 % (v/v) Triton X-100.
Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain pinset, lampu spritus, pisau, alat-alat gelas, laminar air flow cabinet, otoklaf, botol media, rak kultur, lemari es, kertas aluminium, inkubator, spektrofotometer, sentrifus, tabung eppendorf, mikro filter, pipet mikro dan tip, mortal dan penumbuk, water bath,
perangkat elektroforesis, sarung tangan dan alat PCR.
3.3. Metode Penelitian
Penelitian ini terdiri dari dua bagian yaitu : 1) optimasi media regenerasi tanaman tebu, dan 2) transformasi tanaman tebu dengan gen fitase.
3.3.1. Kultur jaringan tanaman tebu 3.3.1.1. Sterilisasi dan Penanaman Eksplan
Sterilisasi dilakukan pada eksplan yang digunakan adalah bagian daun muda yang masih menggulung dari pucuk tebu berumur 4 bulan serta mempunyai
jaringan yang sehat. Pucuk tebu tersebut dipotong sepanjang 20 cm tepat di atas meristem. Sterilisasi dengan cara pencelupan ke dalam alkohol 70% dan dibakar di atas nyala api spiritus. Sterilisasi diulang sampai 3 kali sambil membuka dan membuang lapisan daun pucuk hingga diperoleh daun muda yang masing menggulung dan dipotong berukuran 2 – 3 mm sebanyak 10 potong.
Penanaman eksplan dilakukan dengan menggunakan pinset pada media MS-I (Lampiran 2) dalam kondisi gelap, masing-masing botol kultur diisi 5 potong eksplan, kemudian ditutup dengan kertas aluminium. Semua pekerjaan sterilisasi dan penanaman eksplan dilakukan dalam kabinet air flow. Botol-botol kultur yang telah ditanami eksplan selanjutnya disimpan dalam ruang inkubasi selama 1 bulan sampai diperoleh kalus yang mempunyai struktur kompak dan mampu berproliferasi. Setelah satu bulan kalus disubkultur pada media MS-I. 3.3.1.2. Regenerasi Tanaman Tebu
Pada tahap regenerasi kalus menjadi planlet disusun dengan menggunakan Rancangan Acak Lengkap. Penelitian ini dibagi menjadi dua tahap yaitu tahap : 1) regenerasi kalus pada media optimasi regenerasi; 2) regenerasi kalus transforman pada media optimasi regenerasi.
Tahap regenerasi kalus pada media optimasi regenerasi dilakukan menggunakan Rancangan Acak Lengkap Faktorial 3 x 3 dengan 5 ulangan. Yang terdiri dari faktor A adalah konsentrasi BAP yang terdiri dari 3 taraf, yaitu :
A1. 0.50 mg/L A2. 0.75 mg/L A3. 1.00 mg/L
Faktor B adalah konsentrasi kinetin yang terdiri dari 3 taraf, yaitu : B1. 0.0 mg/L
B2. 0.2 mg/L B3. 0.4 mg/L
Pada tahap ini terdapat 9 kombinasi dengan 5 ulangan untuk masing-masing kombinasi, sehingga terdapat 45 satuan percobaan. Botol-botol kultur yang telah ditanami eksplan selanjutnya diinkubasi dalam ruang kultur selama 5 minggu. Pengamatan dilakukan terhadap jumlah tunas dan daun.
Model rancangannya adalah : Yijk = µ + αi + βj + (αβ)ij + εijk µ : Nilai rataan umum
αi : Pengaruh kosentrasi BAP pada media optimasi regenerasi ke-i (i = 0.50 ; 0.75 ; 1.00)
βj : Pengaruh konsentrasi kinetin pada media optimasi regenerasi ke-j (j = 0 ; 0.2 ; 0.4)
(αβ)ij : Pengaruh interaksi antara konsentrasi BAP pada media optimasi regenerasi ke-i dan konsentrasi kinetin pada media optimasi regenerasi ke-j
εijk : Pengaruh galat percobaan konsentrasi BAP pada media optimasi regenerasi ke-i dan konsentrasi kinetin pada media regenerasi ke-j dan ulangan ke-k
Yijkl : Nilai pengamatan
Setelah tunas tumbuh dipindahkan ke media cair dan bagian basalnya dipotong untuk induksi akar. Tahap induksi perakaran dilakukan menggunakan Rancangan Acak Lengkap Faktorial 2 x 4 dengan 5 ulangan, yang terdiri dari faktor A adalah kultivar tebu yaitu :
A1. CB 6879 A2. PA 183
Faktor B media perakaran yang terdiri dari 4 taraf, yaitu : B1. 0.25 mg/L IBA dan 0.20 mg/L IAA
B2. 0.25 mg/L IBA dan 0.50 mg/L IAA B3. 0.50 mg/L IBA dan 0.20 mg/L IAA B4. 0.50 mg/L IBA dan 0.50 mg/L IAA
Pada tahap ini terdapat 8 kombinasi dengan 5 ulangan, masing-masing perlakuan diulang 5 kali. Botol-botol kultur yang telah ditanami eksplan diinkubasi selama 5 minggu dalam ruang kultur. Pengamatan dilakukan terhadap jumlah akar yang tumbuh, panjang akar.
Model rancangannya adalah : Yijk = µ + αi + βj + (αβ)ij + εijk µ : Nilai rataan umum
αi : Pengaruh kultivar tebu ke-i (i = 1, 2)
βj : Pengaruh IBA dan IAA pada media induksi perakaran ke-j (j = 0.25:0.20 ; 0.25:0.50 ; 0.50:0.20 ; 0.50:0.50)
(αβ)ij : Pengaruh interaksi antara kultivar tebu ke-i dengan IBA dan IAA pada media induksi perakaran ke-j
εijk : Pengaruh galat percobaan kultivar tebu ke-i dan IBA dan IAA pada media induksi perakaran ke-j, ulangan ke-k
Yij : Nilai pengamatan
Media optimasi regenerasi yang diperoleh dari regenerasi kalus ini dipakai pada tahap regenerasi kalus transforman.
3.3.2. Transformasi Kalus Tebu dengan Gen Fitase (Santosa et al, 2004 yang dimodifikasi)
3.3.2.1. Penyiapan Kalus untuk Transformasi
Kalus yang embriogenik dipotong dengan ukuran 2-3 mm. Sekitar 20 kalus direndam dalam 15 mL media MScd dan diinkubasi dalam kondisi gelap 28°C sambil digoyang selama satu minggu pada 60 rpm. Tujuh jam sebelum ko- kultivasi dengan Agrobacterium, kalus ditambahkan dengan 75µL antioksidan. 3.3.2.2. Penyiapan A.tumefaciens GV2260 pBIN1-ECS untuk Transformasi
Satu koloni Agrobacterium dari media padat ditumbuhkan pada 5 mL media LB yang mengandung kanamisin 50 mg/L dan rifampisin 50 mg/L, pada suhu 28°C dan digoyang pada 150 rpm, selanjutnya diukur OD578 = 0.5 lalu dibagi ke dalam 2 mL eppendorf dan disentrifus 2000 x g selama 10 menit. Pelet dicuci dengan media cair MScd lalu disentrifus lagi dan ditambahkan MScdao kemudian diukur lagi nilai OD578 = 0.2. Suspensi bakteri siap digunakan untuk transformasi. 3.3.2.3. Transformasi Kalus Tebu dengan Gen Fitase
Kalus tebu dimasukkan kedalam 2 mL eppendorf dan diinokulasi dengan 0.5 mL kultur suspensi Agrobacterium (OD578 = 0.2) dan dibiarkan 5 – 10 menit pada suhu ruang setelah itu kalus dikeringkan dengan kertas steril untuk
mengurangi cairan suspensi bakteri. Kalus yang telah dikeringkan tadi dimasukkan ke dalam 30 mL MS yang mengandung 0.5 g/L kasein hidrolisat, 100 mg/L asetosiringon dan 50 mg/L kanamisin, diinkubasi pada kondisi gelap suhu 28°C dan digoyang 60 rpm selama 2 hari. Bila ditemukan pertumbuhan
Agrobacterium pada media maka media diganti dengan media baru. Setelah ko- kultivasi kalus dicuci dengan air steril sebanyak 2 kali, keringkan pada kertas saring steril, kemudian transfer pada 25 ml MS yang mengandung 0.5 g/L kasein hidrolisat, cefotaksim 1000 mg/L, inkubasi pada kondisi gelap 28oC dan digoyang pada 60 rpm selama 2 jam. Selanjutnya kalus ditransfer ke dalam 30 mL media MS padat yang mengandung 0.5 mg/L kasein hidrolisat, 500 mg/L cefotaksim lalu diinkubasi dengan kondisi gelap pada 28oC selama 1 minggu, selanjutnya ganti media dengan media MS yang mengandung 0.5 mg/L kasein hidrolisat, 500 mg/L cefotaksim, 100 mg/L kanamisin dan kultur selama 2 minggu atau lebih untuk memastikan tidak ada pertumbuhan bakteri (Ananda, 2004). Selanjutnya kalus ditanam pada media MS I dengan kanamisin 150 mg/L untuk mendapatkan struktur yang kompak dan mampu berproliferasi, setelah sebulan kalus disubkultur dan selanjutnya dapat diregenerasikan pada media dasar MS dengan zat pengatur tumbuh BAP, Kinetin, IBA dan IAA.
3.3.3. Pengujian Molekuler 3.3.3.1. Ekstraksi DNA
Total DNA tanaman diisolasi dari daun tebu transforman dengan menggerus 2 gram daun dengan nitrogen cair hingga berupa serbuk halus. Kemudian serbuk tersebut dipindahkan ke dalam tabung eppendorf dan ditambah dengan 200 l TE dan buffer ekstraksi DAS 500 l, selanjutnya disimpan dalam es selama 5 menit. Kemudian ditambah dengan 500 l cloroform : isoamil alkohol dengan perbandingan 24 : 1. Disentrifus selama 10 menit dengan 13.000 g, selanjutnya supernatan diambil dan dipindah dalam tabung ependorf baru, ditambah isopropanol sebanyak 0.54 volume larutan, disentrifus selama 10 menit dengan 13.000g. Pelet dicuci dengan 200 l alkohol 70%, dengan disentrifus selama 2 menit dan 13.000g. Alkohol dibuang dan pelet dikeringkan selama 30 menit, setelah kering ditambah TE sebanyak 20 l.
3.3.3.2. Amplifikasi DNA
Hasil ekstraksi DNA tanaman tebu digunakan untuk amplifikasi DNA dengan teknik PCR. Primer yang digunakan adalah primer spesifik untuk gen fitase. Primer gen fitase yang digunakan adalah 5’ – CA GGC TCT ATC CGC TAA TCG – 3’ dan 5’ – GG CGC GGT GGG GCA ATA ATC – 3’. Reaksi diatur sebagai berikut; denaturasi pada 940C selama 30 detik, annealing pada 580C selama 30 detik dan ekstension pada 720C selama 45 detik. Jumlah setiap campuran reaksi sebanyak 25 µL yang terdiri dari 12.5 µL Master Mix; 1.25 µL masing-masing primer spesifik untuk gen fitase; 1.5 µL DNA tanaman transgenik putatif atau kontrol serta 8.5 µL ddH2O. Reaksi dijalankan sebanyak 30 siklus. Selanjutnya DNA hasil amplifikasi dimasukkan dalam sumur gel agarose 2%. Elektroforesis dijalankan selama 45 menit pada 115V dalam buffer 0.5 TAE, kemudian direndam dalam ethidium bromide 10µg/mL lalu dilihat pada UV transsiluminator.
3.3.4. Uji Aktifitas Enzim Fitase Pada Tebu Transforman dan Non Transforman (Greiner, 2005)
Sebanyak 0.1 g daun tebu transforman dihaluskan menggunakan mortar dan kemudian ditambah 350 μl natrium asetat 0.1 M pH 5.0. Larutan kemudian diinkubasi selama 3 jam pada suhu 4°C sambil distirer atau dishaker. Setelah itu disentrifugasi pada 1200g selama 15 menit dan didapatkan supernatant sebagai sumber enzim fitase sebanyak 50 μl. Sumber enzim fitase sebanyak 50 μl ditambah dengan 350 μl natrium asetat 0.1 M pH 4.5 yang mengandung 1.5 mM fitat, diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37°C. Kemudian untuk menghentikan reaksi enzim fitase ditambahkan 1500 µl larutan AAM (aseton : 5N sulfuric acid : 10 µM ammonium molybdate dengan perbandingan 1 : 1 : 2) pada larutan hasil inkubasi. Setelah itu 100 µl 1 M asam sitrat ditambahkan sebagai larutan penstabil reaksi enzim fitase tersebut dan ukur OD pada 355 nm.
Aktivitas enzim fitase ini dapat dilihat secara visualisasi yaitu dengan terbentuknya warna agak kekuningan pada larutan sampel bila dibandingkan dengan larutan blanko. Hal ini disebabkan adanya aktivitas enzim fitase tersebut dalam menguraikan sumber fitat yang ada dalam larutan sampel. Untuk
mengetahui besarnya aktivitas enzim fitase maka setelah diukur kepekatan warna kuningnya (OD) menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 35 nm selanjutnya dihitung menggunakan rumus sebagai berikut :
U = ΔE . Volume total ml Σ.t Volume enzim
ΔE = Esampel - Eblanko
Σ = 8.7 cm2 µmol-1
T = 30 menit ; Volume total = 2000 µl ; Volume enzim = 50 µl
Menurut Greiner, (2005), 1 unit aktivitas fitase didefinisikan sebagai jumlah fosfat yang dapat dibebaskan oleh setiap 1 ml larutan enzim kasar dalam waktu 30 menit pada kondisi suhu 370C.