BAB II KAJIAN PUSTAKA
2.12 Tikus (Rattus norvegicus) Galur Wistar
Mamalia kecil menjadi pilihan untuk berbagai penelitian karena mempunyai beberapa keuntungan, yaitu tidak mahal, mudah didapat, hanya membutuhkan sedikit ruang, makan, dan minum, mudah dalam pemeliharaan, dan dapat diubah secara genetik. Hewan kecil biasanya mempunyai cara mempercepat penyembuhan dibandingkan manusia, dengan jangka waktu beberapa hari, sedangkan pada manusia dalam beberapa minggu atau bulan (Birke, 2014).
Syarat hewan yang digunakan untuk penelitian farmakologi harus terpenuhi yaitu harus jelas fisiologinya, bebas dari penyakit, didapat dari Breeding Centre yang baik atau dibiakkan sendiri. Etika terhadap hewan percobaan juga harus diperhatikan berdasarkan pada hasil lokakarya Pembentukan Panitia Etik Penelitian Kedokteran tahun 1986. Salah satu butir
dalam etika tersebut disebutkan bahwa bila percobaan menimbulkan sesuatu yang lebih dari sekadar rasa nyeri atau penderitaan ringan dalam waktu singkat, harus dilakukan dengan premedikasi yang memadai dan dibawah anesthesia sesuai dengan praktik kedokteran hewan yang lazim. Kemudian pada butir yang lain disebutkan bahwa pada akhir percobaan, hewan yang akan menanggung nyeri hebat atau kronik penderitaan, rasa tidak enak, cacat yang tidak dapat disembuhkan, harus dibunuh dengan cara yang layak (Darmono, 2011).
Persentase penggunaan hewan percobaan pada penelitian secara invivo adalah sebagai berikut: tikus (80%), mencit (11%), kelinci dan babi (4%), dan ayam (1%) (Birke, 2014). Bulu tikus yang tidak tebal mempunyai beberapa keuntungan dalam penelitian yang menggunakan model perlukaan pada epidermis. Pertama, epidermis yang tidak tertutup bulu tebal mengganggu pemisahan epidermis dari dermis; kedua, ukuran dari bulu tikus yang tidak tebal membuat model yang ideal untuk penilaian efek dari bahan farmakologi pada proses penyembuhan luka (Choi et al., 2001).
Tikus putih atau mencit adalah tikus rumah rumah adalah binatang asli Asia, India, dan Eropa Barat. Jenis ini sekarang ditemukan di seluruh dunia karena pengenalan oleh manusia. Tikus jarang berkelahi seperti mencit jantan, dapat tinggal sendirian dalam kandang, asal dapat mendengar dan melihat tikus lain. Jika dipegang dengan cara yang benar, tikus-tikus ini tenang dan mudah ditangani di laboratorium. Pemeliharaan dan makanan tikus lebih mahal daripada mencit, tetapi karena hewan ini lebih besar daripada mencit untuk beberapa macam percobaan tikus lebih menguntungkan (Fatchiyah, 2013).
Klasifikasi dari Tikus (Rattus norvegicus) galur Wistar adalah (Keith, 2010) :
Kingdom : Animalia
Phylum : Chordata
Subphylum : Vertebrata
Class : Mammalia
Order : Rodentia
Family : Muridae
Genus : Rattus
Species : norvegicus
Tikus termasuk dalam genus Rattus dengan spesies Rattus rattus dan Rattus norvegicus. Tikus yang sering digunakan sebagai tikus laboratorium adalah Rattus norvegicus karena tubuhnya yang lebih besar dari pada Rattus rattus (Keith, 2010).
Rattus norvegicus yang sering dipakai dalam penelitian adalah strain Wistar dan Spargue Dawley yang merupakan tikus albino. Tikus strain Wistar memiliki ciri – ciri kepala lebar, telinga panjang dan memiliki ekor panjang kurang dari panjang tubuhnya, sedangkan strain Sprague Dawley memiliki ekor untuk meningkatkan rasio panjang tubuh dibandingkan dengan tikus Wistar (Keith, 2010).
Gambar 2.9 Tikus Galur Wistar ( Estina, 2010)
BAB III
KERANGKA BERPIKIR, KONSEP DAN HIPOTESIS PENELITIAN
3.1 Kerangka Berpikir
Sinar UV adalah salah satu faktor ekstriksik yang dapat menyebabkan penuaan pada kulit yang disebut photoaging. Pada photoaging terjadi perubahan pada kulit berupa kerutan, lesi pigmentasi yaitu frackles, hiperpigmentasi dan hipopigmentasi. Sinar UV yang dapat menembus sampai ke lapisan kulit dan merusak serat – serat kolagen adalah sinar UVB.
Sinar UVB memiliki panjang gelombang 290 – 320 nm, hanya 2 – 5 % dari sinar UVB yang mencapai bumi dan kerusakannya menembus sampai ke lapisan dermis. Paparan sinar UVB berulang akan berinteraksi langsung dengan DNA yaitu induksi kerusakan DNA, berupa Cross-linking basa pirimidin. Reaksi ini dapat menghasilkan reactive oxygen species (ROS). Paparan sinar UVB juga mengubah elektron pada kromosfor, menjadi singlet elektron dan pembentukan superoksida anion yang diikuti oleh dismutase ke hidrogen peroksida. Pembentukan ROS ini terjadi pada pemajanan sinar UVB kurang dari 30 menit.
Kolagen merupakan komponen fibrillar dari jaringan ikat dan sebagai protein ekstraselular yang paling utama dari tubuh manusia. Kolagen mengisi 70 – 80% dermis, dengan tipe kolagen dermis terbanyak yaitu tipe kolagen I yang menjaga kelenturan dermis.
Kolagen yang telah terpapar berulang oleh sinar UVB akan mengalami degradasi dan penghambatan pertumbuhan prokolagen. Degradasi kolagen tidaklah
lengkap, akan tetapi terjadi akumulasi fragmentasi kolagen yang mengurangi integritas struktural dermis. Akumulasi fragmentasi kolagen menghambat pertumbuhan kolagen baru dan memberikan efek regulasi negatif pada sintesis kolagen. Gambaran histopatologi kulit dan kolagen yang terpapar UVB yaitu atrofi epidermis, pendataran dermal epidermal junction (DEJ), elastosis dermis dan fragmentasi kolagen.
Beras hitam (Oryza sativa L. indica) mengandung senyawa fenol yang salah satunya adalah golongan flavonoid yaitu antosianin golongan cyanidin-3-glucoside dan peonidin-3-cyanidin-3-glucoside. Antosianin dapat menghambat aktivasi dari beberapa faktor transkripsi antara lain MAP-kinase, C-Jun protein terminal kinase yang kemudian akan mengaktifkan kompleks AP-1. Kompleks AP-1 menyebabkan degradasi dari kolagen matur dan menghambat biosintesis kolagen baru akibat pembentukan ROS pada paparan sinar UVB berulang. Selain itu beras hitam juga mengandung vitamin C yang merupakan antioksidan primer yang dapat menghambat pembentukan ROS dengan mendonorkan elektronnya, sehingga radikal bebas ternetralisasi.
Kandungan senyawa fenol yang termasuk di dalamnya adalah antosianin yang cukup tinggi serta kandungan vitamin C pada beras hitam menjadikan beras hitam salah satu bahan yang memiliki potensi sumber antioksidan kuat yang dapat menekan efek stress oksidatif sel dan sebagai protektor kolagen.
3.2 Konsep Penelitian
Krim ekstrak beras hitam 20%
(Oryza sativa L. indica)
Faktor Internal
• Genetik
• Galur
• Hormon
Faktor Eksternal
• Penyakit
• Makanan
• Asap rokok
• Sinar matahari
Tikus (Rattus novergicus) galur Wistar yang dipapar sinar UVB
Jumlah kolagen
Keterangan :
Tidak diteliti Diteliti
3.3 HIPOTESIS
Pemberian krim ekstrak beras hitam (Oryza sativa L. indica) 20% topikal efektif menghambat penurunan jumlah kolagen pada kulit tikus Wistar yang dipapar sinar ultraviolet B.
BAB IV
METODE PENELITIAN
4.1 Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental dengan menggunakan rancangan post test only control group (Marczyk, et al., 2005).
Gambar 4.1 Rancangan Post Test Only Control Group
Keterangan : P : Populasi R : Random S : Sampel
P0 : Perlakuan dengan pemberian paparan sinar ultraviolet B dan krim bahan dasar P1 : Perlakuan dengan pemberian paparan sinar ultraviolet B dan krim ekstrak beras
hitam (Oryza sativa L indica) 20%
O1 : Observasi jumlah kolagen kelompok 1, setelah perlakuan P0
O2 : Observasi jumlah kolagen kelompok 2, setelah perlakuan P1 4.2. Tempat Dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Animal Unit bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Udayana. Waktu penelitian dilakukan selama 4 minggu, bulan Februari 2015. Pemeriksaan histopatologi jaringan kulit dilakukan di Laboratorium Histologi Fakultas Kedokteran Universitas Udayana.
Waktu pemeriksaan histopatologis dilakukan selama 1 minggu, bulan Maret 2015.
Pembuatan ekstrak beras hitam dilakukan di Unit Layanan Laboratorium Fakultas Teknologi Pertanian Universitas Udayana. Waktu pembuatan ekstrak selama 2 minggu, bulan November 2014. Analisis Fitokimia ekstrak beras hitam dilakukan di Unit Layanan Laboratorium Fakultas Teknologi Pertanian Universitas Udayana pada bulan Juli 2014.
4.3. Populasi dan Sampel
4.3.1. Populasi
Populasi dalam penelitian ini adalah tikus (Rattus norvegicus) galur wistar jantan berusia 2 bulan. Tikus tidak menderita sakit, mau makan dan minum. Tikus ini diperoleh dari Laboratorium Animal Unit bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Udayana.
4.3.2. Kriteria Sampel
4.3.2.1. Kriteria Inklusi
a) Tikus (Rattus norvegicus) galur Wistar jantan
b) Umur 2 bulan
c) Berat 160 – 200 gram d) Sehat
e) Mau makan dan minum
Kriteria drop Out : apabila tikus Wistar mati pada saat penelitian.
4.4. Besar Sampel dan Cara Pengambilan Sampel
Dengan menggunakan rumus dari Federer (Federer, 2008), maka besarnya sampel dapat dihitung sebagai berikut :
( n – 1 )( t – 1 ) ≥ 15 ( n – 1 )( 2 – 1 ) = 15 ( n – 1 )( 1 ) = 15
n – 1 = 15 n = 16 Keterangan :
n : Banyaknya ulangan
t : Banyaknya perlakuan
Berdasarkan perhitungan dengan rumus di atas maka diperoleh n = 16. Karena sampel dibagi menjadi 2 kelompok, maka jumlah sampel adalah 32. Sampel ditambah 10% dari 32 yaitu penambahan 3,2 ≈ 4 sampel menjadi 36 ekor untuk menghindari drop out selama penelitian.
4.5. Variabel Penelitian
Variabel dalam penelitian ini terdiri dari variabel prakondisi, variabel bebas, variabel tergantung dan variabel kendali.
4.5.1. Identifikasi Variabel
Variabel yang akan diukur adalah jumlah kolagen yang diambil dari jaringan kulit tikus wistar jantan secara histopatologi pada kelompok yang terpapar sinar ultraviolet B dengan pemberian krim bahan dasar dan kelompok yang terpapar sinar ultraviolet B dengan pemberian krim ekstrak beras hitam 20%.
4.5.2. Klasifikasi Variabel
• Variabel prakondisi adalah sinar UVB
• Variabel bebas adalah krim ekstrak beras hitam 20%.
• Variabel tergantung adalah jumlah kolagen dermis.
• Variabel terkendali adalah strain tikus, umur, jenis kelamin, genetik, pakan tikus, aktifitas tikus, kesehatan tikus dan berat badan tikus.
4.5.3. Hubungan Antar Variabel
Gambar 4.2 Skema Hubungan Antar Variabel Penelitian Variabel
Bebas Krim Ekstrak Beras Hitam 20%
Variabel Terkendali
Strain tikus, umur, jenis kelamin, genetik, pakan, aktifitas,kesehatan, berat badan
Variabel Tergantung
Jumlah Kolagen Dermis
Variabel Prakondisi
Sinar UVB
4.5.4. Definisi Operasional Variabel
1. Beras hitam dihasilkan dari padi yang ditanam secara organik, didapatkan dari desa Sidoharjo, Kabupaten Tegal, Jawa Tengah.
2. Ekstrak beras hitam adalah jumlah ekstraksi bagian endosperma dan embrio dari beras hitam yang dibuat di Unit Layanan Laboratorium Fakultas Teknologi Pertanian Universitas Udayana.
3. Krim ekstrak beras hitam 20% adalah krim mengandung ekstrak beras hitam 20%, Sepigel 305, lanol 2%, dimethicon 2% dan phenoxyethanol 0,5% yang dibuat di PT. Aesthetic, Jl. Taman Mekar Wangi Abadi I No.
62, Bandung. Krim diaplikasikan 0,1ml/cm2 pada kulit tikus wistar, sebanyak 2 kali sehari selama 4 minggu. Pada hari pemaparan sinar UVB, krim diaplikasikan 20 menit sebelum paparan sinar UVB dan 4 jam setelah paparan sinar UVB.
4. Krim bahan dasar adalah jumlah bahan dasar krim yang mengandung Sepigel 305, lanol 2%, dimethicon 2% dan phenoxyethanol 0,5%.
Diaplikasikan 0,1 ml/cm2 pada kulit tikus wistar, sebanyak 2 kali sehari selama 2 minggu. Pada hari pemaparan sinar UVB, krim diaplikasikan 20 menit sebelum paparan sinar UVB dan 4 jam setelah paparan sinar UVB.
5. UVB adalah sinar UVB yang berasal dari lampu UVB PL-S9W/01/2P merk Philips yang diberikan sebanyak 3 kali seminggu yaitu pada hari Senin, Rabu dan Jumat dengan total dosis 840 mJ/cm2 selama 4 minggu.
6. Tikus Wistar yang digunakan pada percobaan ini adalah tikus (Rattus norvegicus) galur wistar jantan, berumur 2 bulan dengan berat badan 160 – 200 gram.
7. Jaringan kulit tikus Wistar adalah jaringan histologis yang diambil dari kulit punggung tikus wistar yang dipapar sinar UVB dan diberikan krim.
Jaringan kulit diambil menggunakan skalpel no. 10 dan gunting anatomis dengan panjang jaringan kulit 2 cm, lebar 2 cm dan kedalaman subkutan 2 mm.
8. Kolagen yaitu protein fibrous utama yang terdiri dari fibril dan mikrofibril yang tersusun sejajar dan saling bersilangan, komponen utama dermis yang merupakan 70 – 80 % dari berat dermis. Jumlah kolagen dermis adalah luas daerah dermis yang berwarna merah terang pada pewarnaan immunohistokimia Sirius red yang mengindikasikan kolagen tanpa fragmentasi dan dinyatakan dengan ukuran persentase pixel.
4.6. Alat Bahan dan Hewan Percobaan
Alat, bahan dan hewan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut :
4.6.1 Alat penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah :
1. Kandang tikus (Rattus norvegicus) galur Wistar.
2. Tempat minum.
3. Lampu ultraviolet B.
4. Alat cukur.
5. Timbangan digital.
6. Peralatan bedah seperti gunting anatomis untuk bedah, skalpel no 10.
7. Peralatan untuk membuat sediaan histopatologi seperti mikrotom, gelas objek dan gelas penutup.
8. Mikroskop Olympus.
9. Kamera.
10. Penggaris.
4.6.2. Bahan Penelitian
Bahan utama untuk penelitian ini adalah ekstrak bagian endosperma dan embrio dari beras hitam (Oryza sativa L. indica) yang diekstrak di laboratorium Fakultas Teknologi Pertanian Universitas Udayana.
Beras hitam berasal dari desa Sidoharjo, Kabupaten Tegal, Jawa Tengah.
Pembuatan krim dasar dan krim ekstrak beras hitam 20% dilakukan di laboratorium PT. Kaizen Aesthetic, Jl. Taman Mekar Wangi Abadi I No. 62, Bandung. Bahan untuk pewarnaan kolagen adalah Sirius Red, pewarnaan dilakukan di Laboratorium Histologi Fakultas Kedokteran Universitas Udayana.
4.6.3. Hewan Percobaan
Hewan percobaan yang digunakan dalam percobaan ini adalah tikus (Rattus norvegicus) galur Wistar berusia 2 bulan, jenis kelamin jantan dengan berat badan 160 – 200 gram dengan makanan ternak diet standar dengan menggunakan HPS 511 yang mengandung protein 20%, lemak 5%, pati 45% serat kasar 5% dan abu 4%. Minum menggunakan air matang ad libitum.
Hewan yang digunakan sesuai dengan persyaratan penelitian eksperimental. Prasyaratnya adalah tikus ditempatkan dalam kandang yang
terbuat dari wadah plastik berukuran 23 cm x 17 cm x 9,5 cm dengan alas sekam padi dan tutup dari anyaman kawat berisi tempat makan dan tempat minum gantung. Satu kandang maksimal dihuni 2 ekor tikus. Kandang ditempatkan dalam ruangan berventilasi dan udara alami.
4.7 Prosedur Penelitian
4.7.1 Persiapan hewan Uji
• Sebanyak 36 ekor tikus diadaptasi selama 1 minggu
• Secara random tikus dibagi menjadi 2 kelompok. Kelompok 1 dipapar UVB dan diberikan krim bahan dasar (P0), dan kelompok 2 dipapar UVB dan diberikan krim ekstrak beras hitam 20% (P1), masing – masing kelompok terdiri dari 18 ekor tikus.
• Semua tikus dari kelompok 1 dan 2 dicukur bulu punggungnya, diaplikasikan krim bahan dasar pada kelompok 1 dan krim ekstrak beras hitam 20% pada kelompok 2.
• 20 menit akan memberikan waktu absorbsi bahan topikal pada kulit, setelah aplikasi bahan topikal diberikan pajanan UVB dan aplikasi bahan topikal diulang 4 jam kemudian untuk memberikan waktu pembentukan ROS. Aplikasi bahan topikal tetap diberikan di hari tanpa penyinaran (Vani, 2013).
• Tikus dari kelompok 1 dan 2 diberikan paparan UVB yang diberikan sebanyak 3 kali seminggu yang dimulai dengan 50 mJ/cm2 selama 50 detik pada minggu pertama, diikuti dengan 70 mJ/cm2 selama 70 detik pada minggu kedua dan 2 minggu berikutnya dengan 80 mJ/cm2 selama
80 detik sehingga total UVB yang diterima adalah 840 mJ/cm2 selama 4 minggu (Vani, 2013).
• Tikus dieutanasia dengan menggunakan ketamin dosis berlebih (125 mg/kg BB) secara intramuskular di dalam anaerobic jar (Darmono, 2011) 48 jam setelah penyinaran terakhir, untuk menyingkirkan pengaruh penyinaran akut. Proses pengambilan sampel kulit dilakukan di daerah punggung yang akan diambil kulitnya, dibersihkan dari bulu, kulit digunting dengan ketebalan kurang lebih 2 mm sampai dengan subkutan dengan panjang 2 cm dan lebar 2 cm. setelah itu dibuat sediaan histopatologis dan dihitung jumlah kolagen dermisnya sebagai data post test. Setelah itu sisa organ tikus yang tidak digunakan akan dikubur.
• Total sampel yang didapat sebanyak 36 sampel. Sampel diambil dari jaringan kulit diambil dengan kedalaman subkutan 2 mm, panjang 2 cm dan lebar 2 cm kemudian dibuat sediaan histologis.
• Pembuatan sediaan histologis a) Tahap Fiksasi
Jaringan kulit tikus direndam dalam larutan formalin buffer fosfat 10% selama 1 hari. Kemudian dilakukan trimming bagian jaringan yang akan diambil.
b) Tahap Dehidrasi
Jaringan kulit tikus direndam dengan alkohol bertingkat berturut – turut 30%, 40%, 50%, 70%, 80%, 90%, 96% masing – masing 3 kali selama 25 menit.
c) Tahap clearing
Jaringan dimasukan ke dalam clearing agent (alkohol : toluene = 1:1) selama 30 menit dan dicelupkan ke dalam toluol murni sampai transparan.
d) Tahan Embedding
Setelah dilakukan infiltrasi sebanyak 4 kali dengan parafin murni, kemudian jaringan ditanam kedalam parafin cair, dibiarkan membentuk blok (+/- 1 hari) agar mudah diiris dengan mikrotom.
e) Tahap pemotongan
Proses pemotongan jaringan menggunakan markotom, tebal 6μ, secara serial, diambil irisan ke-5, 10, 15 untuk dibuat slide dengan pewarna Sirius red, ditempelkan pada gelas objek yang sudah diolesi pelekat, ditetesi aquadest dan dikeringkan.
• Pewarnaan dengan Sirius red
a. Jaringan yang masih mengandung parafin dideparafinasi dan dihidrasi.
b. Perwarnaan inti sel dengan Haematoxylin Weigert’s selama 8 menit dan cuci sediaan selama 10 menit dengan air mengalir.
c. Kemudian pewarnaan dengan sirius red selama 1 jam untuk membersihkan pewarnaan mendekati seimbang dimana penambahan waktu tidak meningkatkan hasil dan waktu yang lebih pendek tidak disarankan meskipun warna terlihat baik.
d. Cuci dengan air asam sebanyak 2 kali.
e. Hilangkan air yang berlebihan secara fisik dengan menggoyang secara perlahan.
f. Dehidrasi dengan ethanol 100% sebanyak 3 kali.
g. Bersihkan dalam cairan Xylene dan mounting pada medium yang bersifat asam.
• Pengamatan hasil
Jumlah kolagen dihitung dengan metode analisis cepat digital, setiap sediaan preparat difoto dengan menggunakan kamera LC evolution dan mikroskop Olympus Bx51 dengan pembesaran objektif 400x.
Lapang pandang yang diambil yaitu lapang pandang yang paling banyak kolagen yang ditandai dengan daerah berwarna merah terang kemudian preparat difoto 3 kali, yaitu sisi kiri, tengah dan sisi kanan sediaan. Hasil foto disimpan dalam format JPEG.
• Prosedur perhitungan jumlah kolagen dermis
Prosedur menggunakan piranti lunak Adobe Photoshop CS3 versi 9.0. jaringan kolagen tampak berwarna merah yang dengan fungsi magic wand oleh program Adobe Photoshop CS3. Kemudian dengan menggunakan fungsi inverse maka terpilihlah pixel selain warna merah, lalu dihapus menggunakan fungsi delete, sehingga gambar yang tersisa adalah pixel dengan warna merah. Jumlah kolagen dihitung sebagai persentase pixel area kolagen yang berwarna merah dibandingkan pixel area seluruh jaringan (Kiernan, 2011)
Pixel area kolagen
Jumlah Kolagen = x 100%
Pixel area lapangan pandang jaringan
4.7.2. Preparasi Simplisia
1. Beras Hitam yang berasal dari Tegal dicuci bersih di bawah air mengalir.
2. Beras hitam dikeringkan dengan cara dijemur kemudian dihancurkan 3. Beras hitam diekstrak dengan etanol 96%
4.7.3. Ekstraksi
1. Sampel yang telah dihancurkan diekstrak menggunakan etanol 96%.
2.
Lalu dimeserasi dengan magnetik stirer sampai ampas sampel tidak berwarna, disaring sehingga diperoleh filtrat
.3. Setelah 24 jam, redemen disaring sehingga diperoleh filtrat dan residu
4. Residu dipisahkan dan Filtrat diuapkan dengan evaporator suhu 40°C sampai diperoleh sampel pekat.
4.7.4 Pembuatan Krim
Formulasi bahan dasar krim : Sepigel 305 sebagai emulsifier dengan konsentrasi 3% dicampur ke dalam air selama 5 menit, lalu dimasukan lanol 2%, dimethicon 2% dan phenoxyethanol 0,5%, lanjutkan pencampuran hingga berbentuk krim.
Formulasi bahan krim ekstrak beras hitam : ekstrak beras hitam 20%, Sepigel 305 sebagai emulsifier dengan konsentrasi 3% dicampur ke dalam air selama 5 menit, lalu dimasukan lanol 2%, dimethicon 2% dan phenoxyethanol 0,5%, lanjutkan pencampuran hingga berbentuk krim.
4.8. Analisis Data
Data yang telah terkumpul diproses dengan IBM SPSS 21.0 for Macintosh, dan dianalisis dengan langkah – langkah :
1. Analisis deskriptif disajikan dalam bentuk tabel dan diagram untuk mengetahui karakteristik data yang dimiliki.
2. Analisis Normalitas dan Homogenitas
a. Uji normalitas data menggunakan uji Shapiro-Wilk, oleh karena sampel berjumlah lebih kecil dari 30. Data terdistribusi normal pada p> 0,05.
b. Uji homogenitas, setelah dilakukan uji normalitas data dengan menggunakan uji Levene’s test. Data dinyatakan homogen pada p>0,05.
3. Analisis komparasi
Analisis perbedaan rerata antar kelompok menggunakan uji t-independent karena data berjenis numerik, berdistribusi normal dan homogen.
BAB V
HASIL PENELITIAN
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental yang menggunakan metode post test only control group design. Penelitian menggunakan tikus galur Wistar jantan, umur dua bulan, berat 160-200 gram yang dibagi menjadi dua kelompok masing-masing berjumlah 18 ekor tikus. Kelompok 1 sebagai kelompok kontrol adalah kelompok yang diberikan paparan sinar UVB dan krim bahan dasar, kelompok 2 adalah kelompok yang diberikan paparan sinar UVB dan krim ekstrak beras hitam 20%. Pembahasan ini menguraikan uji normalitas data, uji homogenitas data, uji komparabilitas dan uji efek perlakuan.
Setiap kelompok diberi paparan sinar UVB sebanyak 3 kali seminggu yaitu hari Senin, Rabu dan Jum’at, selama empat minggu. Dosis sinar UVB pada minggu pertama adalah 50mJ/cm
2selama 50 detik, pada minggu kedua adalah 70mJ/cm
2selama 70 detik dan pada minggu ketiga dan keempat adalah 80 mJ/cm
2selama 80 detik, sehingga total dosis sinar UVB yang diberikan adalah 840mJ/cm
2. Pada hari pemaparan UVB, krim pada setiap kelompok diberikan 20 menit sebelum dan 4 jam sesudah paparan sinar UVB. Pada hari tanpa pemaparan UVB, krim tetap diberikan 2 kali sehari.
Empat puluh delapan jam setelah paparan, tikus Wistar di euthanasia
terlebih dahulu menggunakan ketamin dosis berlebih (150 mg/kg bb) secara
intramuscular. Daerah punggung yang akan diambil kulitnya, dibersihkan dari
bulu kemudian dibuat preparat histopatologis menggunakan pewarnaan Sirius red
yang memberikan warna merah terang pada kolagen. Jumlah kolagen dihitung dengan persentase pixel luas area
kolagen dari tiga lapang pandang baik dari kelompok kontrol dan kelompok perlakuan dibandingkan dengan pixel seluruh jaringan dermis.
5.1 Gambaran Histopatologis Kulit Tikus Wistar Setelah Perlakuan
Setelah empat minggu perlakuan, jaringan kulit punggung tikus Wistar dibiopsi untuk dilakukan pemeriksaan histopatologis. Kolagen akan berwarna merah terang pada pewarnaan Sirius red. Gambaran kolagen pada jaringan dermis tikus Wistar disajikan pada Gambar 5.1 .
Kelompok 1 Kelompok 2 Gambar 5.1
Gambaran Kolagen Kulit Tikus Wistar Dengan Pewarnaan Sirius red
Keterangan gambar: Jaringan histopatologis dermis tikus Wistar dengan pembesaran 400x. Gambaran kolagen ditunjuk oleh tanda panah berwarna hitam. Pada kelompok 1 (kontrol) terlihat kolagen berwarna merah terang, tidak utuh dan berjumlah sedikit yang ditandai dengan area putih yang ditunjuk oleh panah berwarna biru di antara area merah terang; pada kelompok 2 (krim ekstrak beras hitam 20%) terlihat kolagen berwarna merah terang, berjumlah banyak, tebal, utuh dan memenuhi hampir seluruh daerah lapang pandang jaringan dermis.
5.2 Uji Statistik
5.2.1 Uji Deskriptif
Hasil uji deskriptif rerata jumlah kolagen pada masing-masing kelompok disajikan pada Tabel 5.1.
Tabel 5.1
Hasil Uji Deskriptif Rerata Jumlah Kolagen
Kelompok Jumlah Sampel (N) Mean Standar Deviasi
Kolagen Kontrol 18 72,43 5,64
Perlakuan 18 80,93 3,22
5.2.2 Uji Normalitas Data
Data kolagen sesudah perlakuan diuji normalitasnya dengan menggunakan uji Shapiro-Wilk. Hasilnya menunjukkan data berdistribusi normal (p>0,05), disajikan pada Tabel 5.2.
Tabel 5.2
Hasil Uji Normalitas Data Kolagen Sesudah Perlakuan
Kelompok Subjek
5.2.3 Uji Homogenitas Data
Data kolagen sesudah perlakuan diuji homogenitasnya dengan
Data kolagen sesudah perlakuan diuji homogenitasnya dengan