Rata-rata tingkat kelangsungan hidup pada akhir studi lima jenis yang berbeda dari ikan nila berkisar antara 0-60% (Gambar 3).
Gambar 3 Rata-rata tingkat kelangsungan hidup lima strain Ikan Nila selama 21 hari uji tantang terhadap infeksi bakteri S. agalactiae-N14G Tingkat kelangsungan hidup terendah (0%) ditemukan pada strain BEST dan Nirwana. Tingkat kelangsungan hidup tertinggi (60%) ditemukan pada strain Red-NIFI dan GIFT, Srikandi (50%).
Jenis infeksi S. agalactiae pada ikan nila adalah sub-akut dengan masa inkubasi tiga minggu. Gejala klinis streptococcosis pada ikan nila menunjukkan seperti berenang lemah dan berada di dasar akuarium, berenang tidak beraturan, respon terhadap pakan lemah, perubahan warna tubuh, tubuh membentuk huruf “C”, eksoptalmia pada mata, dan bukaan operkulum lebih cepat (Gambar 4). Hasil pengamatan sesuai dengan penelitian Evans (2002) yang menunjukkan bahwa S. agalactiae terbukti sangat menular dengan angka kematian mencapai 90-100% dalam 2 minggu pertama setelah infeksi buatan.
0 2 4 6 8 10 12 H0 H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 H10 H 11 H 12 H 13 H 14 H 15 H 16 H 17 H 18 H 19 H 20 H 21 Ju m lah ikan u ji Hari
ke-Tingkat Kelangsungan Hidup
13
Gambar 4 Gejala klinis ikan nila yang terinfeksi bakteri patogen
Streptococcus agalactiae-N14G
Variasi dan Jarak Genetik Lima Strain Ikan Nila
Analisis genetik menggunakan metode PCR RAPD dan AFLP. Metode RAPD menggunakan empat macam primer dan AFLP menggunakan dua pasangan kombinasi primer selektif menghasilkan beberapa potong pita (Gambar 5 dan 6).
14
Gambar 5 Produk PCR-RAPD hasil running pada PAGE 8% lima strain nila; Keterangan: B = BEST, N = Nirwana, RN = Red-NIFI, S = Srikandi, G = GIFT
15
Gambar 6 Produk PCR-AFLP hasil running pada PAGE 8% lima strain nila; Keterangan: B = BEST, N = Nirwana, RN = Red-NIFI, S = Srikandi, G = GIFT
Kombinasi primer EcoRI-ACG dan MseI-CTG menghasilkan 24 total pita dengan persentase polimorfik sebesar 45.8%, untuk kombinasi primer EcoRI-ACC dan MseI-CTT menghasilkan 26 total pita dengan persentase polimorfik yang rendah, yaitu 15.4% (Tabel 3).
16
Tabel 3 Primer AFLP yang digunakan dan profil pita dari lima strain ikan nila
Kombinasi primer selektif Total
pita Pita monomorfik Pita polimorfik Presentasi pita polimorfik (%)
EcoRI-ACG+MseI-CTG 24 13 11 45.8
EcoRI-ACC+MseI-CTT 26 22 4 15.4
Baik RAPD maupun AFLP menghasilkan fragmen pita yang polimorf. Pada hasil elektroforesis RAPD menggunakan primer OPA-20 ditemukan adanya alel spesifik yang berada pada posisi yang sama antara lokus strain Red-NIFI, Srikandi, dan GIFT, tetapi tidak ditemukan pada strain BEST dan Nirwana. Pada hasil elektroforesis AFLP menggunakan kombinasi primer EcoRI-ACG+MseI-CTG ditemukan alel spesifik yang berada pada posisi yang sama pada lokus strain BEST dan Nirwana, tetapi tidak ditemukan pada Red-NIFI, Srikandi, dan GIFT.
Dengan perkembangan marka molekular, kesamaan posisi alel pada beberapa strain dapat dikaji lebih lanjut sebagai keterpautan antara gen. Keterepautan tersebut dapat berfungsi untuk mendeteksi dan mengkarakterisasi lokus yang mengendalikan sifat kuantitatif ke dalam faktor genetik yang terkait (Paterson et al. 1988). Adanya kesamaan posisi alel pada strain-strain tertentu mungkin mengekspresikan suatu sifat tertentu yang berkaitan dengan sistem imun.
Jarak genetik merupakan tingkat perbedaan gen antara dua populasi yang biasa dihitung berdasarkan fungsi dari frekuensi alel. Jarak genetik dapat digunakan untuk memperkirakan waktu terjadinya pemisahan antar populasi dan dapat juga digunakan dalam membangun pohon filogenetik (Nei 1987). Berdasarkan hasil analisis RAPD, dengan menggunakan primer OPA-11 menunjukkan jarak genetik terdekat terjadi pada strain nila BEST dengan Nirwana dan BEST dengan GIFT yang memiliki jarak genetik sebesar 0.111 (Tabel 4).
Tabel 4 Tingkat kemiripan genetik kelima sampel (diagonal atas) dan jarak genetik (diagonal bawah) menggunakan primer OPA-11
BEST Nirwana Red-NIFI Srikandi GIFT
BEST *** 0.889 0.848 0.788 0.889
Nirwana 0.111 *** 0.727 0.727 0.833
Red-NIFI 0.152 0.273 *** 0.800 0.848
Srikandi 0.212 0.273 0.200 *** 0.848
GIFT 0.111 0.167 0.152 0.152 ***
Analisis menggunakan primer OPA-15 menunjukkan jarak genetik terdekat terjadi pada strain nila Red-NIFI dengan GIFT yang memiliki jarak genetik sebesar 0.097 (Tabel 5).
17 Tabel 5 Tingkat kemiripan genetik kelima sampel (diagonal atas) dan jarak
genetik (diagonal bawah) menggunakan primer OPA-15
BEST Nirwana Red-NIFI Srikandi GIFT
BEST *** 0.857 0.759 0.800 0.643
Nirwana 0.143 *** 0.839 0.741 0.733
Red-NIFI 0.241 0.161 *** 0.786 0.903
Srikandi 0.200 0.259 0.214 *** 0.741
GIFT 0.357 0.267 0.097 0.259 ***
Analisis menggunakan primer OPA-16 menunjukkan jarak genetik terdekat terjadi pada strain nila BEST dengan Nirwana yang memiliki jarak genetik sebesar 0.130 (Tabel 6).
Tabel 6 Tingkat kemiripan genetik kelima sampel (diagonal atas) dan jarak genetik (diagonal bawah) menggunakan primer OPA-16
BEST Nirwana Red-NIFI Srikandi GIFT
BEST *** 0.870 0.750 0.833 0.688
Nirwana 0.130 *** 0.696 0.783 0.645
Red-NIFI 0.250 0.304 *** 0.833 0.625
Srikandi 0.167 0.217 0.167 *** 0.688
GIFT 0.312 0.355 0.375 0.312 ***
Analisis menggunakan primer OPA-16 menunjukkan jarak genetik terdekat terjadi pada strain nila BEST dengan Nirwana yang memiliki jarak genetik sebesar 0.000 (Tabel 7).
Tabel 7 Tingkat kemiripan genetik kelima sampel (diagonal atas) dan jarak genetik (diagonal bawah) menggunakan primer OPA-20
BEST Nirwana Red-NIFI Srikandi GIFT
BEST *** 1.000 0.714 0.593 0.643
Nirwana 0.000 *** 0.769 0.720 0.692
Red-NIFI 0.286 0.231 *** 0.737 0.600
Srikandi 0.407 0.280 0.263 *** 0.842
GIFT 0.357 0.308 0.400 0.158 ***
Dari hasil kombinasi primer EcoRI-ACG dan MseI-CTG diperoleh jarak genetik paling kecil terdapat pada strain nila BEST dengan Nirwana dan Srikandi dengan GIFT yang memiliki jarak genetik sebesar 0.273. Hal ini menunjukkan adanya hubungan kekerabatan yang lebih dekat antara kedua pasangan strain nila tersebut (Tabel 8).
18
Tabel 8 Tingkat kemiripan genetik kelima sampel (diagonal atas) dan jarak genetik (diagonal bawah) dengan kombinasi primer EcoRI-ACG dan MseI-CTG
BEST Nirwana Red-NIFI Srikandi GIFT
BEST *** 0.914 0.811 0.882 0.857
Nirwana 0.086 *** 0.895 0.857 0.833
Red-NIFI 0.189 0.105 *** 0.811 0.789
Srikandi 0.118 0.143 0.189 *** 0.914
GIFT 0.143 0.167 0.211 0.086 ***
Kombinasi primer EcoRI-ACC dan MseI-CTT menunjukkan jarak genetik terdekat terjadi pada strain nila BEST dengan Nirwana dengan nilai jarak genetik sebesar 0.000 (Tabel 9).
Tabel 9 Tingkat kemiripan genetik kelima sampel (diagonal atas) dan jarak genetik (diagonal bawah) dengan kombinasi primer EcoRI-ACC dan MseI-CTT
BEST Nirwana Red-NIFI Srikandi GIFT
BEST *** 1.000 0.917 0.958 0.979
Nirwana 0.000 *** 0.917 0.958 0.979
Red-NIFI 0.083 0.083 *** 0.958 0.936
Srikandi 0.042 0.042 0.042 *** 0.979
GIFT 0.021 0.021 0.064 0.021 ***
Berdasarkan hasil analisis jarak genetik menggunakan metode RAPD dan AFLP, diperoleh dendogram pohon filogeni yang menunjukkan kekerabatan dari kelima strain nila (Gambar 7-12). Hasil analisis RAPD terjadi variasi nilai jarak genetik dan posisi pada pohon filogeni dari kelima strain nila. Dendogram dari kedua metode tersebut menunjukkan bahwa strain BEST selalu berada pada klaster yang sama dengan Nirwana. Hasil analisis AFLP, menunjukkan bahwa strain BEST memiliki kekerabatan yang dekat dengan Nirwana, begitu pula dengan strain Srikandi yang berkerabat dekat dengan GIFT. Sedangkan strain Red-NIFI terpisah dari keempat strain nila lainnya karena memiliki nilai jarak genetik yang jauh.
Gambar 7 Dendogram analisis cluster jarak genetik (UPGMA) data RAPD dengan menggunakan primer OPA-11
19
Gambar 8 Dendogram analisis cluster jarak genetik (UPGMA) data RAPD dengan menggunakan primer OPA-15
Gambar 9 Dendogram analisis cluster jarak genetik (UPGMA) data RAPD dengan menggunakan primer OPA-16
Gambar 10 Dendogram analisis cluster jarak genetik (UPGMA) data RAPD dengan menggunakan primer OPA-20
20
Gambar 11 Dendogram analisis cluster jarak genetik (UPGMA) data AFLP dengan kombinasi primer EcoRI-ACG dan MseI-CTG
Gambar 12 Dendogram analisis cluster jarak genetik (UPGMA) data AFLP dengan kombinasi primer EcoRI-ACC dan MseI-CTT .
Keterkaitan Karakteristik Respon Imun dan Analisis Genetik
Berdasarkan data titer antibodi dan tingkat kelangsungan hidup lima strain nila yang berbeda, memberikan hubungan yang jelas atau korelasi yang positif antara dua parameter tersebut dengan hasil analisis genetik yang dapat dilihat dari pola fragmen yang spesifik dimiliki atau tidak dimiliki oleh strain-strain tertentu, juga berdasarkan kekerabatan yang dilihat dari jarak genetiknya. Hal ini dapat terjadi kemungkinan karena adanya pengaruh variasi gen terhadap sistem imun. Nilai yang diperoleh pada titer antibodi memiliki korelasi yang kuat dengan tingkat perlindungan antigen spesifik, dan terlihat secara signifikan terhadap tingkat kelangsungan hidup. Hasil analisis genetik juga mendukung bahwa strain nila BEST dan Nirwana
21 yang berada pada satu klaster memiliki sistem ketahanan tubuh yang rendah terhadap infeksi bakteri patogen, S. agalactiae.
SIMPULAN
Strain Red-NIFI memiliki ketahanan yang tinggi dalam hal resisten terhadap infeksi penyakit S. agalactiae, kemudian diikuti oleh GIFT dan Srikandi. Sementara dua strain lainnya, BEST dan Nirwana memiliki ketahanan yang rendah terhadap bakteri S. agalactiae. Eksplorasi dan integrasi parameter, yaitu diferensiasi leukosit, aktivitas lisozim, titer antibodi, dan tingkat kelangsungan hidup dalam penelitian ini mengungkapkan bahwa parameter tersebut dapat digunakan untuk membedakan sistem imun spesifik dan non-spesifik pada ikan nila. Korelasi yang kuat antara strain yang tahan maupun yang rentan terhadap infeksi bakteri S. agalactiae ditemukan pada hasil uji tantang dan kekerabatan analisis genetik berdasarkan alel spesifik dan jarak genetik.