Tingkat Kesalahan (Error Rate), Nilai Penyejajaran (Aligned) dan Intensitas Basa Hasil Sekuensing
Pengukuran yang dilakukan selanjutnya adalah analisis terhadap tingkat kesalahan (error rate), nilai penyejajaran (aligned) dan intensitas basa hasil sekuensing. Masing-masing pustaka genom mengalami dua kali pembacaan (Read 1 dan read 2). Setiap pembacaan mengukur hal yang sama dan menghasilkan hasil yang berbeda untuk intensitas siklus I dan % intensitas siklus 20 (Tabel 10). Rerata error pada siklus 100 yaitu sebesar 0.00 % yang menunjukkan sekuensing berjalan dengan sangat baik dan tidak ada kesalahan. Intensitas siklus yang dihasilkan juga tergolong ideal (nilai intensitas ideal 1000) dimana
masing-Tabel 9 Densitas dan kualitas pustaka genom hasil sekuensing
Lajur (K/mmDensitas 2) Klaster PF (%) Phasing (%) Pre phasing (%) Reads (M) Reads PF (M) % >= Q30 CIP 392781 779 93.1 0.173 0.287 215.4 199.8 94 PT 29 766 93.1 0.178 0.285 211.9 196.6 94.1 Amudra 633 95 0.182 0.302 174.87 165.8 92.75 Margahayu 881 89.3 0.174 0.277 243.68 216.9 88.4
Gambar 7 Histogram jumlah klaster berdasarkan kualitas sekuen yang dihasilkan
masing nilai baik pada pembacaan 1 maupun 2 berada pada nilai 4736 hingga 5531.
PEMBAHASAN
Hasil Isolasi DNA Genom Kentang
DNA genom merupakan seluruh materi genetik yang dimiliki oleh suatu organisme termasuk didalamnya DNA yang berinteraksi dengan protein dan RNA (Weaver & Hedrick 1997). Isolasi DNA adalah pemisahan molekul DNA dari molekul lain seperti dinding sel, membran sel, dan membran inti sehingga strukturnya dapat terlihat dengan jelas. Tujuannya adalah mengidentifikasi dan mengkarakterisasi DNA yang dibutuhkan untuk proses analisis molekuler lainnya. Berbagai teknis analisis dalam pemuliaan tanaman dan biologi molekuler berdasarkan pada hibridisasi molekuler dan polymerase chain reaction (PCR) membutuhkan DNA dalam jumlah dan kualitas yang baik. Kandungan senyawa sekunder dalam sel tanaman berbeda beda maka setiap tanaman membutuhkan prosedur isolasi yang optimum agar diperoleh DNA genom yang dapat digunakan untuk proses analisis biomolekuler lainnya (Prahaditya 2013).
Metode isolasi DNA genom pada penelitian ini menggunakan metode Doyle & Doyle (1987) yang dimodifikasi. Ekstraksi DNA menggunakan prosedur ini pada prinsipnya menggunakan cetil trimetil ammonium bromide (CTAB) yang berfungsi untuk mendegradasi senyawa metabolit sekunder yang terdapat pada tanaman. Modifikasi yang dilakukan terdapat pada penambahan natrium disulfida dan polivinilpirolidon 2% ke dalam buffer CTAB 2% yang berguna sebagai antioksidan pencegah warna coklat polifenol saat penggerusan. Pengendapan
Tabel 10 Tingkat kesalahan (error rate), nilai penyejajaran (aligned) dan intensitas basa hasil sekuensing
Read Lajur Aligned
(%) Error Rate (%) Error Rate 100 cycle (%) Intensity cycle I % Intensity Cycle 20 1 CIP 392781 1.3 0.3 0.00 5466 81.8 PT 21 1.2 0.28 0.00 5331 81.6 Amudera 3.0 0.36 0.00 5531 81.0 Margahayu 1.6 0.41 0.00 4954 80.9 2 CIP 392781 1.3 0.74 0.00 4845 81.9 PT 21 1.2 0.72 0.00 4736 81.5 Amudera 2.9 0.67 0.00 4764 84.4 Margahayu 1.5 1.01 0.00 4408 80.9
16
menggunakan isopropanol pada metode Doyle & Doyle dilakukan pada suhu ruang selama satu malam, namun pada penelitian ini pengendapan isopropanol dilakukan selama 1 jam pada suhu -20oC dan juga untuk pengeringan hanya membutuhkan waktu 15 menit menggunakan vakum evaporator.
Uji terhadap kualitas DNA hasil isolasi dapat diketahui dengan teknik elektroforesis. Elektroforesis merupakan suatu cara untuk memisahkan fraksi-fraksi campuran berdasarkan pergerakan partikel-partikel koloid bermuatan yang dipengaruhi medan listrik. Elektroforesis umumnya digunakan untuk menentukan berat molekul, mendeteksi kemurnian, dan kerusakan protein atau asam nukleat, menetapkan titik isolistrik serta memisahkan spesies-spesies yang berbeda secara kualitatif dan kuantitatif. Oleh karena itu, metode elektroforesis banyak digunakan untuk analisis asam nukleat, virus, enzim dan protein (Bintang 2010).
DNA genom kentang dari 4 genotipe telah berhasil diisolasi dengan baik yang ditandai dengan terbentuknya pita-pita DNA pada elektroforegram. Elektroforegram merupakan hasil uji kualitatif terhadap DNA yang telah diisolasi. DNA hasil isolasi dielektroforesis pada gel agarosa 1% dan menggunakan marker DNA 100 bp. Keberhasilan atau kualitas DNA yang telah diisolasi merupakan DNA genom terlihat dari letak pita DNA yang mendekati sumur dan juga intensitas pita DNA yang tinggi dengan tidak adanya smear yang membuktikan DNA tidak terdegradasi dan DNA yang diperoleh tersebut merupakan DNA genom kentang yang utuh (Gambar 2). Elektroforesis gel akan memisahkan molekul DNA sesuai dengan ukurannya dan semakin besar molekul DNA maka pita DNA yang dihasilkan akan semakin dekat dengan sumur gel (Brown 2007).
Kuantitas hasil isolasi DNA genom kentang dapat diukur dengan menggunakan spektrofotometer nanodrop thermoscientific pada panjang gelombang 230 nm, 260 nm dan 280 nm. Uji kuantitas bertujuan untuk mengetahui konsentrasi dan kemurnian dari DNA genom hasil isolasi. Panjang gelombang 230 nm merupakan serapan maksimum untuk polisakarida, panjang gelombang 260 merupakan panjang serapan maksimum untuk asam nukleat dan panjang gelombang 280 nm merupakan serapan maksimum untuk protein. Kemurnian DNA ditentukan melalui rasio perbandingan nilai absorbansi asam nukleat (260 nm) dengan nilai absorbansi polisakarida (230 nm) untuk menunjukkan kemurnian terhadap polisakarida dan perbandingan dengan nilai absorbansi protein (280 nm) untuk menunjukkan kemurnian terhadap protein.
Hasil uji kuantitas DNA genom kentang memiliki konsentrasi asam nukleat sebesar 2224.8 ng/uL – 11672.7 ng/uL dengan rasio A260/280 sebesar 1.86 – 1.96 dan rasio A260/230 sebesar 2.1 – 2.44 (Tabel 1). Terdapat satu genotipe yang memiliki konsentrasi yang rendah yaitu sebesar 197.8 ng/uL dikarenakan sampel DNA adalah sampel yang telah diisolasi dan disimpan dalam waktu yang cukup lama. Sampel DNA genom kentang yang diisolasi dapat dikatakan sangat murni dari kontaminasi baik dari protein maupun polisakarida karena masih berada pada rentang ukuran 1.8-2.0. Yuwono (2005), menyatakan bahwa nilai kemurnian yang kurang dari 1.8 menunjukkan bahwa sampel mengandung kontaminasi protein dan polisakarida.
Fluorometer Qubit digunakan jika bekerja dengan sampel yang berharga
atau sangat sulit untuk diaplikasikan. Uji kuantitas selanjutnya dan sangat dibutuhkan adalah uji konsentrasi dsDNA hasil isolasi. Alat ini berbeda dengan nanodrop ataupun spektrofotometer lainnya karena alat ini hanya akan
menghitung molekul target seperti double standed DNA saja. Keuntungan penggunaan fluorometer ini adalah akurasinya baik dan sangat teliti sehingga mampu mendeteksi konsentrasi yang terendah sekalipun. Double stranded DNA atau dsDNA biasanya digunakan untuk sampel yang akan disekuensing, sampel DNA genom dan percobaan penelitian lainnya (Invitrogen 2010). Alat ini juga dapat diaplikasikan untuk mengukur konsentrasi single standed DNA dan protein target.
Pengukuran konsentrasi dsDNA dilakukan dengan pengenceran 100 dan 200 kali. Hasil yang diperoleh yaitu dalam setiap 1 ul DNA hasil isolasi terdapat dsDNA dengan konsentrasi 70.6 ng/uL hingga 231 ng/uL (Tabel 2). Konsentrasi dsDNA yang telah diukur ini akan sangat memudahkan untuk tahapan konstruksi pustaka selanjutnya. Berat dsDNA yang dibutuhkan untuk tahapan awal konstruksi pustaka awal yaitu saat fragmentasi adalah 1 ug jika volume DNA yang tersedia sedikit dan 2.6 ug jika volume DNA yang tersedia banyak atau dapat dikatakan konsentrasi dsDNA yang dibutuhkan hanya 20 ng/uL yang diencerkan ke dalam 130 uL atau 55 uL buffer resuspensi. Volume DNA yang harus diencerkan diperoleh dengan perhitungan yaitu 20 ng/uL x 130 ul dan kemudian dibagi dengan konsentrasi dsDNA yang telah diukur.
Konstruksi Pustaka Genom DNA Kentang
Pustaka genom adalah sekumpulan klon yang mengandung DNA genom total dari suatu organisme. Pustaka genom seharusnya mengandung seluruh sekuen DNA dari suatu organisme (Lodish et al. 2000). Selain sebagai bahan genetik, pustaka genom juga sangat bermanfaat untuk mengisolasi gen utuh yang mengandung promoter, terminator dan intron untuk mengetahui regulasi ekspresi gen. Peta fisik suatu genom juga membutuhkan pustaka genom, sehingga pustaka genom merupakan bagian yang sangat penting dalam perbaikan genetika tanaman, baik melalui teknologi DNA rekombinan maupun melalui pemuliaan konvensional (Suharsono 2002).
Konstruksi pustaka genom kentang pada penelitian ini mengikuti protokol
TruSeq DNA low troughput protocol dari Illumina yang dimodifikasi pada
beberapa tahapannya. Tujuan dari protokol ini yaitu menambahkan sekuen adaptor ke dalam ujung fragmen DNA untuk menghasilkan pembacaan ganda atau sekuen ujung pasangan pustaka. Tahapan awal konstruksi pustaka genom kentang ini setalah isolasi DNA genom utuh dari kentang yaitu dilakukannya pemotongan DNA kentang pada panjang tertentu yang diharapkan potongan tersebut telah dapat mewakilkan gen-gen penyandi genom kentang, modifikasi ujung DNA, adenilasi ujung 3’OH dan ligasi adaptor, pemurnian produk ligasi dan perbanyakan fragmen DNA secara invitro atau menggunakan PCR. Hasil konstruksi dari pustaka genom nantinya dapat divalidasi agar dapat dilanjutkan ke tahap berikutnya.
Hasil Fragmentasi DNA Genom Kentang
Fragmentasi atau pemotongan DNA genom kentang dilakukan secara fisik dengan alat Covaris yang menggunakan prinsip sonikasi untuk memotong DNA genom secara acak pada kisaran pemotongan 300-400 bp. Pemilihan potongan
18
DNA pada 300-400 bp karena ukuran ideal pustaka genom yang disarankan oleh illumina adalah < 800 bp karena pustaka yang berukuran sangat panjang ataupun sangat pendek dapat mempengaruhi keakuratan data yang dihasilkan pada saat proses sekuensing berlangsung. Alat Covaris ini dilengkapi dengan tabung
Covaris yang didesain secara khusus untuk pemotongan DNA. Alat ini tidak
membutuhkan DNA dalam jumlah besar untuk melakukan pemotongan. Covaris akan memotong dan menghasilkan fragmen dsDNA dengan ujung 3’ atau 5’
overhang. Konsentrasi dsDNA yang dibutuhkan yaitu 20 ng/uL yang dilarutkan
ke dalam buffer resuspensi dengan berat akhir DNA 1 ug dan 2.6 ug. Buffer
resuspensi ini akan tetap menjaga DNA dalam kondisi yang baik dan stabil dan
juga dapat melarutkan kembali DNA setelah DNA berinteraksi dengan banyak pereaksi yang digunakan. Kelebihan pemotongan dengan menggunakan covaris ini adalah konsentrasi DNA yang dibutuhkan untuk pemotongan tidak banyak namun harus benar-benar dsDNA dan juga dapat meminimalisir terbuangnya DNA secara percuma. Sampel DNA dengan bobot DNA dari 50 ng- 2 ug pertabungnya dapat dipotong dengan menggunakan M220 (Covaris 2012).
Fragmentasi DNA merupakan suatu proses yang mendeskripsikan cara memperoleh fragmen DNA genom optimal yang mengandung pustaka akhir pada rerata panjang ukuran 300-400 bp dan merupakan tahapan yang paling kritis. Illumina menyarankan untuk hasil optimal potongan DNA pada 300-400 bp, sedangkan untuk perbanyakan eksom bisa pada ukuran 200-300 bp (Illumina 2010a). Hasil fragmentasi DNA kemudian dapat diperiksa dengan dielektroforesis pada gel agarosa 2% selama 40 menit. Gambar 3 merupakan elektroforegram fragmen DNA genom yang sudah difragmentasi menggunakan Covaris. Elektroforegram ini memperlihatkan pita hasil DNA genom yang smear pada ukuran 200 hingga 1200 bp, ukuran yang nantinya akan dipilih adalah DNA yang berukuran 300-400 bp. DNA yang berukuran lebih besar ataupun lebih kecil dari ukuran yang diharapkan nantinya akan diseleksi pada tahapan-tahapan konstruksi pustaka selanjutnya dengan menggunakan pereaksi-pereaksi yang spesifik.
Hasil Modifikasi Ujung Fragmen DNA
Modifikasi ujung fragmen DNA atau perform end repair merupakan suatu tahapan setelah pemotongan DNA genom menggunakan covaris. Proses ini akan mengubah ujung lengket hasil dari fragmentasi ke dalam ujung tumpul (blunt end) menggunakan end repair mix. End repair mix mengandung enzim eksonuklease dan polymerase. Aktivitas 3’-5’ eksonuklease akan menghilangkan atau memotong pada ujung 3’ dan aktivitas polymerase akan memenuhi atau membuat ujung 5’ (Illumina 2010a). Tahapan modifikasi ujung terdiri dari memasukkan end
repair mix untuk modifikasi, inkubasi untuk mengoptimalkan reaksi dan proses
pembuatan ujung dan selanjutnya adalah proses clean up atau pembersihan sisa-sisa pereaksi yang tidak bereaksi dengan DNA dan juga dengan menambahkan
AMPure XP beads ke dalam tabung dimana AMPure XP beads ini akan mengikat
DNA dan menghilangkan kelebihan-kelebihan pereaksi yang digunakan. AMPure
XP beads mengandung silika dan manik-manik paramagnetik yang dengan
bantuan medan magnet akan mengikatkan fragmen DNA pada dinding tabung. Sehingga, pada saat pencucian dengan etanol 80% fragmen DNA tidak ikut terbuang bersama supernatan.
Pengukuran konsentrasi hasil modifikasi ujung DNA dapat diukur dengan menggunakan nanodrop untuk mengetahui konsentrasi dan kemurniannya dan hal ini bisa dilakukan jika supernatan yang digunakan masih tersisa di dalam tabung dan tidak mengurangi jumlah larutan DNA untuk tahapan selanjutnya. Tabel 3 merupakan jumlah konsentrasi dan kemurnian DNA setelah tahapan pembersihan ujung fragmen DNA. Konsentrasi asam nukleat yang dihasilkan sebesar 54.7 ng/uL hingga 107.1 ng/uL dengan tingkat kemurnian A260/280 sebesar 1.99-2.33 dan rasio A260/230 sebesar 1.35 – 2.45 (Tabel 3). Hal ini dapat menunjukkan DNA yang telah dimodifikasi murni dari kontaminasi protein karena nilai yang ditunjukkan tidak terlalu berbeda dengan rentang nilai yang seharusnya, dan kemurnian dari polisakarida untuk sampel dengan genotipe CIP 392781 kurang (<1.8) tapi tidak terlalu mempengaruhi terhadap kualitas pustaka modifikasi ujung fragmen DNA karena DNA yang digunakan pada pengukuran ini adalah DNA yang tersisa dan mungkin diakibatkan tidak teliti dalam penggunaan mikropipet. Hasil dari modifikasi ujung fragmen DNA kemudian dapat dilanjutkan ke tahapan adenilasi ujung 3’OH dan ligasi adaptor.
Hasil Adenilasi Ujung 3’OH dan Ligasi Adaptor
Adenilasi bertujuan mencegah ligasi antar fragmen DNA dan menyiapkan DNA sebelum ligasi adaptor. Sebuah nukleotida adenin ditambahkan ke ujung 3’ dari fragmen tumpul untuk mencegah DNA saling berligasi satu sama lain selama reaksi ligasi adaptor. Kecocokan nukleotida tunggal T pada ujung 3’ akan menyediakan adaptor untuk melengkapi overhang untuk ligasi adaptor pada fragmen. Strategi ini memastikan rendahnya kecepatan terbentuknya chimera (jalinan-jalinan template) (Illumina 2010a). A tailing mix dalam adenilasi akan membuat fragmen DNA menjadi kompatibel dengan adaptor dan mencegah ligasi sendiri (self ligation) dengan penambahan adenin tersebut pada 3’overhang.
Ligasi adaptor merupakan proses yang akan melekatkan indeks atau adaptor penunjuk pada ujung fragmen DNA dan menyiapkan pengikatan pustaka untuk hibridisasi di atas suatu flow cell. Proses ligasi adaptor menggunakan adaptor indeks nomor 2 (AD002) yang berisi sekuen nukleotida CGATGT (A) dan DNA
ligation mix yang menghubungkan adaptor untuk disisipkan (Illumina 2010a). Stop ligation buffer ditambahkan secepatnya ke dalam tabung setelah proses
inkubasi untuk menghentikan proses ligasi. Karena proses ligasi yang terjadi terus menerus tanpa dihentikan dengan cepat dapat mengakibatkan saling terjalinnya nukleotida sehingga tidak menghasilkan pustaka yang sesuai ataupun dapat mengakibatkan adaptor saling menempel satu sama lain.
Supernatan yang tersisa setelah proses tahapan pembersihan adenilasi ujung 3’OH dan ligasi adaptor kemudian diukur konsentrasi atau kuantitas dan kemurnian DNA nya. Konsentrasi asam nukleat pada tahapan ini mengalami penurunan jika dibandingkan dengan tahapan sebelumnya. Hal ini disebabkan karena semakin banyak seleksi yang dilakukan sehingga nantinya didapatkan pustaka DNA yang akurat. Konsentrasi asam nukleat yang diperoleh yaitu sebesar 40.9 ng/uL hingga 47.5 ng/uL dengan tingkat kemurnian A260/280 pada rentang 1.97 hingga 2.0 (Tabel 4). Terdapat satu genotipe (CIP 392781) yang tidak diukur konsentrasi dan kemurniannya dikarenakan sisa supernatan setelah pembersihan tidak mencukupi dan banyak terkontaminasi oleh manik-manik paramagnetik.
20
Kesalahan pengukuran atau penggunaan pipet dalam hal ini sangat diperhatikan agar hasil yang diperoleh optimal. Supernatan yang tidak tersisa mungkin disebabkan oleh kesalahan dalam proses penggunaan pipet.
Hasil Pemurnian DNA setelah Ligasi Adaptor
Pemurnian produk hasil ligasi adaptor dilakukan dengan menggunakan gel agarosa 2%. Proses pemurnian reaksi produk ligasi dilakukan pada sebuah gel dan akan mengangkat adaptor-adaptor yang tidak menempel, adaptor yang terligasi baik satu sama lainnya, dan melakukan seleksi ukuran dari sekuensing pustaka untuk menghasilkan kelompok (cluster) yang cocok (Illumina 2010a). Tahapan pemurnian ini mengalami sedikit modifikasi dari protokolnya yaitu saat dielektroforesis pada gel elektroforesis selama 60 menit dengan 100 volt sementara aturan prosedur yaitu 120 volt dan 120 menit. Optimasi telah dilakukan sebelumnya oleh Satyawan (2014), dimana ke dalam tabung yang berisi DNA hasil ligasi langsung ditambahkan blue juice sebagai pemberat dan pemberi warna DNA sedangkan pewarna SyBr Gold langsung dicampurkan ke dalam gel agarosa 2% untuk deteksi yang lebih akurat.
Gambar 4 merupakan perwakilan dari beberapa genotipe kentang hasil pemurnian setelah ligasi adaptor. Genotipe yang mewakili yaitu Amudera dan Margahayu. Pita-pita DNA yang smear ditunjukkan berada pada ukuran yang diharapkan yaitu 300-400 bp dengan marker 100 bp. Pita DNA yang smear ini menunjukkan ukuran-ukuran terpotongnya DNA dimana pada ukuran 300-400 bp intensitas DNA sedikit tinggi sehingga DNA dapat dipotong pada ukuran tersebut. Pemotongan tersebut dilakukan dengan cara mengiris gel pada ukuran DNA 300-400 bp dan kemudian gel yang telah diiris dimasukkan ke dalam tabung untuk kemudian disimpan dan digunakan pada tahapan selanjutnya. Ukuran-ukuran ini diseleksi sesuai dengan ukuran pustaka yang dibutuhkan (<800 bp) untuk sekuensing menggunakan NGS. Tahapan terakhir dari konstruksi pustaka genom yang dilakukan adalah perbanyakan DNA hasil pemurnian ligasi adaptor yaitu perbanyakan DNA yang berukuran 300-400 bp.
Hasil Perbanyakan DNA setelah Pemurnian DNA Fragmen
Perbanyakan DNA atau enrichment DNA fragment setelah tahapan pemurnian produk ligasi dilakukan dengan menggunakan PCR untuk menyeleksi perbanyakan fragmen DNA yang mempunyai adaptor pada kedua ujungnya dan untuk diperbanyak menjadi banyak DNA pustaka. PCR primer cocktail akan menempel ke ujung daripada adaptor. Jumlah siklus PCR juga harus diminimalkan untuk mencegah penggambaran pustaka yang tidak simetris (Illumina 2010a). Tahapan predenaturasi dilakukan selama 30 detik pada suhu 980C dan kemudian dilanjutkan dengan siklus PCR sebanyak 10 siklus dengan rincian denaturasi pada 980C selama 10 detik, penempelan atau annealing pada suhu 60oC selama 30 detik dan dilanjutkan dengan tahapan pemanjangan atau
extention pada suhu 720C selama 30 detik. Tahapan setelah pemanjangan dilakukan selama 5 menit pada suhu 720C dan kemudian siklus ditahan pada suhu 40C. Pada perbanyakan DNA setelah pemurnian ini hanya DNA yang berukuran 300-400 bp yang telah ditempeli adaptor pada kedua ujungnya yang diperbanyak.
Konsentrasi dan kemurnian DNA setelah tahapan perbanyakan fragmen DNA dapat diukur dengan menggunakan nanodrop sedangkan uji kualitas hasil perbanyakan dapat diketahui dengan elektroforesis DNA pada gel agarosa 2%. Supernatan yang tersisa pada tabung dapat digunakan untuk pengukuran setelah proses pembersihan perbanyakan fragmen DNA. Kuantitas atau konsentrasi asam nukleat yang diperoleh yaitu sebesar 3 ng/uL hingga 17.7 ng/uL dengan tingkat kemurnian A260/280 yang diperoleh sebesar 1.53 hingga 2.67 dan kemurnian terhadap polisakarida A260/230 yang diperoleh sebesar 1.62 hingga 4.47 (Tabel 5). Kemurnian yang kecil yaitu <1.8 dan yang melebihi nilai 2 mungkin disebabkan pada saat pengukuran masih terkontaminasi oleh manik-manik paramagnetik. Kualitas pustaka hasil perbanyakan fragmen DNA ditunjukkan oleh elektroforegram pada gambar 5 yang menunjukkan bahwa pita-pita DNA berada pada ukuran yang diharapkan yaitu 400-500 bp dan ukuran ini masih berada pada rentang ukuran ideal dari pustaka genom.
Hasil Validasi Kualitas Dan Kuantitas Pustaka Genom Kentang
Pustaka genom kentang yang telah berhasil dikonstruksi dapat diukur kualitas dan kuantitasnya untuk memudahkan pada tahap klasterisasi dan sekuensing DNA. Kualitas pustaka genom kentang yang telah berhasil dikonstruksi dapat diukur ukuran fragmennya dengan menggunakan instrumen
bioanalyzer dan analisis menggunakan software photocap_MW. Analisis terhadap
kuantitas pustaka genom hasil konstruksi dapat dilakukan dengan menggunakan
quantitative PCR (qPCR). Analisis ini masing-masing hanya menggunakan DNA
hasil pustaka yang sedikit (±2 ul) sehingga jumlah pustaka DNA yang nantinya akan digunakan untuk klasterisasi dan sekuensing masih terpenuhi. Terdapat perbedaan antara bionalyzer dan qPCR selain masing-masingnya untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. Instrumen bioanalyzer selain digunakan untuk analisis kualitas juga dapat mengukur kuantitas pustaka DNA namun instrumen ini akan membaca semua pustaka berdasarkan potongannya. Sementara itu, qPCR hanya akan mengukur pustaka yang memiliki fragmen yang ditempeli adaptor pada kedua ujungnya dan juga menggunakan 2 primer sehingga data kuantitas lebih akurat.
Kualitas pustaka genom hasil konstruksi dapat diketahui dengan menggunakan alat bionalyzer dari agilent. Alat bionalyzer dapat mengetahui secara spesifik atau secara tepat potongan ukuran dari fragmen DNA pustaka. Pengukuran fragmen DNA pustaka menghasilkan ukuran pustaka yang baik yaitu <800 bp, ukuran fragmen pustaka genotipe CIP 392781 dan PT.29 yaitu pada 324 bp dan 360 bp dengan konsentrasi pustaka sebesar 5578 Pg/ul dan 4452 Pg/ul. Beberapa genotipe kentang diukur dengan menggunakan analisis software
photocap_MW. Sebelumnya, pustaka yang telah dianalisis kuantitasnya
menggunakan qPCR dielektroforesis pada gel agarosa 2% dan gambar yang berhasil ditangkap didokumentasikan dan dianalisis menggunakan software sehingga hanya menghasilkan ukuran saja tanpa bisa menghitung konsentrasi pustaka akhir. Hasil yang didapatkan yaitu ukuran fragmen sebesar 568 bp untuk genotipe Amudera dan 471 bp untuk genotipe Margahayu (Tabel 6). Ukuran ini masih memenuhi ukuran ideal yang dibutuhkan untuk klasterisasi dan sekuensing pustaka genom kentang.
22
Bionalyzer terdiri dari sebuah alat yang terhubung dengan sebuah komputer
dan software didalamnya dan chip atau lempeng yang kompatibel yang menghasilkan pita-pita DNA saat pembacaannya. Chip agilent ini dapat digunakan untuk mengukur DNA, RNA dan protein dengan prinsip pengujian yang sama. Prinsip pengujian elektroforesis yang didasarkan pada prinsip gel elektroforesis yang dipindahkan ke dalam bentuk lempengan. Bentuk lempengan akan mengurangi penggunaan waktu dan penggunaan sampel. Pengujian kuantitas DNA dan protein dapat diselesaikan dengan bantuan “upper marker”. Peak sampel berada dibawah daerah upper marker dan karena konsentrasi upper marker telah diketahui maka konsentrasi tiap sampel juga dapat dihitung (Agilent Technologies 2003). Hasil pengukuran dengan bioanalyzer juga dapat menghasilkan data berupa gambar elektroforegram dengan pita-pita yang tajam dan ukuran yang sangat spesifik (Gambar 5).
Metode deteksi dengan qPCR merupakan sebuah proses dimana reaksi PCR ini mengandung enzim dNTPs, buffer dan SyBr Green I, primer dan template.
SyBr Green I tidak memiliki fluororescen yang signifikan terhadap kehadiran single stranded DNA (ssDNA). Proses selanjutnya yaitu produk dsDNA akan
berinteraksi dengan SyBr Green I dan menjadi sebuah produk yang bersinar. Ketika produk sudah cukup terakumulasi maka fluororescen akan meningkat lebih tinggi dibanding sebelumnya dan ini dinamakan dengan siklus ambang batas (Ct). Nilai Ct kemudian digunakan untuk mengukur kuantitas jumlah template saat