Manggis dan Kerabat Dekatnya
Manggis (Garcinia mangostana) sebagai queen of tropical fruits
merupakan famili Guttiferae. Manggis berasal dari Indonesia atau kawasan Asia Tenggara (Almeyda dan Martin 1976). Manggis atau G. mangostana termasuk ke dalam famili Guttiferae. Famili Guttiferae menurut Choisy (1824) terdiri dari 4 suku yaitu (1) Clusieae, (2) Garciniaeae, (3) Calophylleae, dan (4) Symphonieae. Suku Clusieae terdiri dari Mahurea, Marila, Godoya dan Clusia. Suku Garciniaeae terdiri dari genus Ochrocarpos, Marialva, Micranthera, Garcinia. Genus
Garcinia dibagi menjadi 2 section atau sub genus yaitu sub genus ke-1 adalah
Mangostana seperti species G. mangostana, G. cornea, G. cambogia dan
G. Morella sedangkan sub genus ke-2 adalah Brindonia seperti
G. cochinchinensis, G. elliptica, G. indica dan G. cowa. Suku Calophylleae terdiri dari genus Mammea, Xanthocymus, Stalagmitis, Mesua dan Calophyllum. Suku Symphonieae terdiri dari genus Canella, Moronobea, Chrysopia, Macanea, Singana dan Rheedia.
Berdasarkan klasifikasi famili Guttiferae menurut Choisy (1824), hubungan G. mangostana dengan C. inophyllum adalah termasuk ke dalam famili
Guttiferae tetapi berbeda suku dan genus yaitu G. mangostana termasuk ke dalam suku Garcinieae dan genus Garcinia, sedangkan C. inophyllum termasuk ke
dalam suku Calophylleae dan genus Chalopyllum. G. mangostana dengan
G. subelliptica termasuk ke dalam suku yang sama yaitu suku Garcinieae, tetapi berbeda sub genus/section. G. mangostana termasuk ke dalam sub genus ke-1 yaitu sub genus Mangostana sedangkan G. subelliptica termasuk ke dalam sub genus ke-2 yaitu sub genus Brindonia.
Jones (1980) mengklasifikasikan genus Garcinia menjadi 14 sub genus berdasarkan karakter mahkota bunga, kelopak bunga dan polen. Sub genus
Garcinia yaitu (1) Garcinia, (2) Rheediopsis, (3) Teracentrum, (4) Rheedia, (5) Macrostigma, (6) Tetraphalangium, (7) Tripetalum, (8) Brindonia,
(13) Discostigma, dan (14) Tagmanthera. Sari (2000) mengklasifikasikan
G. mangostana, G. celebica, G. hombroniana, G. porrecta ke dalam sub genus ke-1 yaitu Garcinia. G. subelliptica termasuk ke dalam sub genus ke-11 yaitu
Xanthocymus sedangkan G. forbesii merupakan out group dari genus Garcinia,
meskipun stuktur buah mirip dengan buah G. mangostana. Sama halnya dengan
C. inophyllum yang merupakan out group dari genus Garcinia, karena
C. inopyllum termasuk genus Calophyllum.
G. mangostana merupakan allotetraploid dari persilangan Garcinia hombroniana (2n=48) dan Garcinia malaccencis (2n=42) (Richards 1990b)
berdasarkan karakter morfologi yaitu (1) waktu berbunga, (2) warna getah, (3) warna mahkota bunga, (4) kedudukan stigma, (5) tekstur permukaan stigma,
(6) rasio stigma lobes, (7) diameter stigma, (8) susunan benang sari, (9) ada tidaknya benang sari pada bunga betina, (10) bentuk buah, (11) tekstur permukaan kulit buah, (12) warna buah matang (13) aroma aril. Karakter warna getah, warna mahkota bunga, kedudukan stigma dan warna buah dari G. mangostana mirip dengan G. malaccensis, sedangkan empat karakter lainnya meliputi permukaan stigma, bentuk/kerapatan benangsari, bentuk buah dan permukaan buah mirip dengan G. hombroniana.
Berdasarkan penelitian Yapwattanaphun dan Subhadrabandhu (2004), dengan menambahkan sekuen T dan C pada area ITS 1 (Internal Transcribed Spacer) pada DNA ribosom (rDNA), terdapat kemiripan melalui pengelompokan
dari G. atroviridis, G. cowa, G. dulcis, G. malaccensis, G. mangostana, G. rostrata dan G. vilersiana. Kelompok yang dekat dengan G. mangostana
adalah G. malaccensis dan G. hombroniana. Kemiripan G. mangostana
berdasarkan penanda AFLP diperoleh bahwa G. malaccensis menghasilkan 57.5% pita sebagai tetua jantan dan 17.5% dari G. hombroniana sebagai tetua betina (Sinaga, 2008). Penanda isozim diperoleh informasi bahwa G. celebica
menghasilkan pita yang lebih sama dengan G. mangostana, sehingga diduga terdapat kerabat dekat lain yang dapat menjadi kandidat tetua seperti G. porrecta,
dan G. celebica. Kemiripan karakter pada G. porrecta dan G. celebica dimiliki pula oleh G. mangostana baik pada karakter organ bunga, buah, biji, getah, stomata maupun daun.
Ekspresi Sex Tanaman Berbunga
Ekspresi sex tanaman berbunga dapat dibagi menjadi tiga bagian yaitu (1) individu bunga, (2) individu tanaman dan (3) populasi. Ekspresi sex pada individu bunga dibagi menjadi tiga tipe yaitu (1) bunga hermaprodit yaitu bunga yang memiliki benang sari dan putik, (2) bunga androecious yaitu bunga yang hanya memiliki benang sari tanpa memiliki bakal buah dan (3) bunga gynoecious yaitu bunga yang memiliki putik tanpa memiliki benang sari. Ekspresi sex pada individu tanaman terbagi menjadi 7 tipe yaitu (1) tanaman hermaprodit yaitu individu tanaman yang hanya memiliki bunga hermaprodit, (2) tanaman
monoecious yaitu tanaman yang memiliki bunga jantan dan bunga betina dalam satu pohon, (3) tanaman androecious yaitu tanaman yang hanya memiliki bunga jantan, (4) tanaman gynoecious yaitu tanaman yang hanya memiliki bunga betina, (5) tanaman andromonoecious yaitu tanaman yang memiliki bunga hermaprodit dan bunga jantan, (6) gynomonoecious yaitu tanaman yang memiliki bunga hermaprodit dan bunga betina dan (7) trimonoecious yaitu tanaman yang memiliki bunga hermaprodit, bunga jantan dan bunga betina. Ekpresi sex pada populasi dibagi menjadi 5 tipe antara lain : (1) populasi hermaprodit yaitu populasi yang terdiri dari hanya tanaman hermaprodit, (2) populasi monoecious yaitu populasi yang terdiri dari hanya tanaman monoecious, (3) populasi dioecious yaitu populasi yang terdiri dari tanaman androecious dan gynoecious, (4) populasi androecious
yaitu populasi yang terdiri dari tanaman hermaprodit dan androecious dan (5) populasi gynodioecious yaitu populasi yang terdiri dari tanaman hermaprodit
dan gynoecious (Frankel dan Galun 1977).
Tanaman genus Garcinia pada umumnya memiliki bunga jantan dan betina (dioecious), kecuali pada G. scortechinii King dan G. mangostana (Richard 1990a). Garcinia termasuk tanaman berumah dua yaitu bunga jantan dan betina dihasilkan pada tanaman yang berbeda meskipun fakultatif agamospermy. Pemunculan bunga jantan dan bunga betina terdapat pada pohon yang berbeda sehingga termasuk kategori dioecious. Tanaman dioecious memiliki bunga betina hasil obligat agamospermy, sedangkan tanaman jantan merupakan hasil dari reproduksi seksual. Apabila tidak ditemukan bunga jantan, maka dapat
diasumsikan bahwa tanaman tersebut adalah obligate agamospermy (Downtown dan William 2009). Berdasarkan hasil penelusuran literatur (Te-chato 2007), disimpulkan bahwa yang dimaksud dengan tanaman jantan adalah tanaman genus
Garcinia lain yang memiliki polen yang viabel. Serbuk sari atau polen pada bunga manggis sendiri umumnya mengalami rudimenter, yaitu mengecil dan mengering, maka buah manggis hanya dihasilkan melalui perkembangan bunga betina tanpa melalui pembuahan. Kondisi ini dikenal dengan nama apomiksis. Fenomena apomiksis ini yang menyebabkan keseragaman manggis.
Penanda Morfologi
Penanda morfologi merupakan penanda yang dapat digunakan untuk mengukur besarnya keragaman pada tanaman berdasarkan karakter fenotipe, baik pada fase vegetatif maupun fase generatif. Karakter morfologi pada fase vegetatif ditujukan pada pengamatan batang dan daun, sedangkan pada fase generatif melalui bunga, buah dan biji. Karakter kualitatif meliputi warna dan bentuk dikendalikan oleh gen sederhana (satu atau dua gen) dan sedikit dipengaruhi oleh lingkungan (Stoskopf et al. 2009).
Karakter morfologi tanaman memperlihatkan perbedaan pada organ akar, batang dan daun. Daun lengkap mempunyai bagian upih daun atau pelepah daun (vagina), tangkai daun (petioles), dan helaian daun (lamina) sedangkan daun tidak lengkap yaitu daun yang kehilangan salah satu bagian dari daun. Heterofili adalah bentuk daun yang berlainan pada satu pohon pada cabang yang berlainan, sedangkan anisofili adalah terdapat dua bentuk daun pada cabang yang sama. Bentuk daun dapat dilihat pada rasio panjang terhadap lebar daun. Bentuk daun oval/elips/jorong apabila rasio panjang : lebar menunjukan 1.5 - 2 : 1, bentuk
memanjang/oblong jika rasio menunjukan 2.5 – 3 : 1, dan lanset dengan rasio 3 – 5 : 1 (Tjitrosoepomo 2005).
Bentuk ujung daun terbagi menjadi bentuk (1) runcing yaitu ujung daun membentuk sudut lancip 900, (2) meruncing (acuminatus) yaitu ujung runcing
lebih tinggi sehingga ujung daun tampak sempit panjang dan runcing, (3) membulat (rotundus) ujung tumpul tidak membentuk sudut, (4) rompang
(truncates) ujung daun rata, (5) ujung terbelah (retusus) ujung daun terdapat lekukan dan (6) ujung berduri (mucronatus) (Tjitrosoepomo 2005). Bentuk
acuminate dapat didefinisikan pula sebagai ujung yang meruncing sehingga pada ujung daun membentuk cekungan sepanjang sisi pada ujungnya. Bentuk acute
meruncing ke ujung dengan bentuk lurus pada kedua sisi ujung daun. Bentuk pangkal daun terbagi menjadi (1) oblique apabila bentuk pangkal daun tidak seimbang, (2) membulat (rounded), (3) aequilateral apabila kedua sisi bentuk seimbang, (4) cuneate apabila pangkal meruncing (Harris dan Harris 2004).
Hipotesa Richards (1990b) menyatakan bahwa karakter morfologi
G. mangostana berada diantara karakter G. hombroniana dan G. malaccensis
berdasarkan : (1) waktu berbunga, (2) warna getah, (3) warna mahkota bunga, (4) kedudukan stigma, (5) tekstur permukaan stigma, (6) rasio stigma lobes, (7) diameter stigma, (8) susunan benang sari, (9) ada tidaknya benang sari pada
bunga betina, (10) bentuk buah, (11) tekstur permukaan kulit buah, (12) warna buah matang (13) aroma aril. Karakter morfologi G. mangostana mirip dengan
G. celebica, G. porrecta, dan G. hombroniana yaitu memiliki kesamaan karakter pada morfologi tajuk, daun dan bunga. Pada bunga terdapat empat kelompok tangkai sari, mengelilingi putik/pistil terdiri dari 170 kotak sari yang mengandung polen (Zakki 2003).
Pengamatan stomata pada permukaan atas maupun permukaan bawah daun merupakan peubah pada pengamatan morfologi. Stomata adalah celah dalam epidermis yang dibatasi oleh dua sel penutup berbentuk ginjal, sedangkan sel yang berbeda bentuknya disebut sel tetangga. Bentuk sisi sel epidermis bervariasi seperti berleluk dalam, berlekuk dangkal atau rata. Sel epidermis yang mengelilingi sel penutup dapat digunakan sebagai identifikasi dari tipe stomata. Tipe stomata dapat dibedakan menjadi 4, berdasarkan susunan sel epidermis yang berada di samping sel penutup yaitu : (1) anomositik apabila sel penutup dikelilingi oleh sel yang tidak dapat dibedakan ukuran dan bentuknya dengan sel epidermis, (2) anisositik apabila sel penutup dikelilingi tiga buah sel tetangga yang tidak sama besar, (3) parasitik apabila sel penutup diringi satu atau lebih oleh sel tetangga yang sejajar dengan sel penutup dan (4) diasitik apabila stomata dikelilingi oleh dua sel tetangga yang letaknya tegak lurus (Hidayat 1995).
Penanda Molekuler Inter Simple Sequence Repeats (ISSR)
Penanda molekuler digunakan untuk menunjukan polimorfisme pada
tingkat DNA. Penanda molekuler yang diharapkan adalah sebagai berikut : (1) polimorfik yang tinggi, (2) kodominan untuk dapat membedakan homozigot
dan heterozigot pada tanaman diploid, (3) pemunculan diseluruh genom, (4) selektif terhadap perilaku alami, (5) pendugaan mudah, cepat dan murah untuk
dideteksi, dan (7) reproducibility tinggi (Kumar et al. 2009).
Penanda dengan menggunakan DNA terbagi menjadi dua tipe yaitu (1) non PCR seperti RFLP dan (2) berbasis PCR seperti RAPD, AFLP, SSR, ISSR dengan terbentuknya separasi pita hasil proses elektroforesis sebagai pencerminan alel atau lokus. Penanda molekuler berbasis sekuen DNA dapat terdeteksi dan pewarisan sifat mudah diamati, sehingga efisien untuk evaluasi dan seleksi.
Penanda molekuler Inter Simple Sequence Repeats (ISSR) merupakan salah satu penanda dengan motif sekuen berulang. Ada kalanya terdapat penambahan sekuen nukleotida baik pada bagian ujung 3’ maupun ujung 5’ seperti (CA)8RG dan (CA)8RY. ISSR adalah fragmen DNA dengan ukuran 100-3000 bp berlokasi diantara wilayah mikrosatelit, wilayah amplifikasi sekuen DNA yaitu pada inter-SSR bagian flanked genom secara berlawanan pada area yang dekat dengan sekuen berulang (Zietkiewicz et al. 1994). Area amplifikasi menurut Zietkiewicz et al. (1994) dapat dilihat pada Gambar 2.
Primer yang digunakan adalah primer utas tunggal dengan motif mikrosatelit/SSR. Keuntungan ISSR antara lain tidak diperlukannya data sekuen terlebih dahulu, membutuhkan 5-50 ng templat DNA per reaksi, ISSR tersebar diseluruh genom, dapat bersifat dominan maupun kodominan (Soltis et al. 1998) dan dapat menghasilkan pola polimorfisme lebih tinggi daripada RAPD (Gao et al. 2006). Penanda bersifat dominan, yaitu tidak dapat membedakan individu yang homozigot dan heterozigot, sedangkan penanda kodominan dapat membedakan individu yang homozigot dan heterozigot. Tanaman umumnya memiliki dinukleotida dengan motif SSR seperti AC/TG, AT/AT, dan AG/TC. Inter Simple Sequence Repeats (ISSR) merupakan penanda yang dikembangkan dari motif SSR. Interpretasi alel terletak pada pemunculan atau tidak munculnya pita DNA (Soltis et al. 1998), ISSR dapat digunakan untuk menghasilkan pola separasi pita DNA polimorfik dalam pengamatan genotipe untuk (1) memperoleh hubungan asal tanaman dengan pusat penyebaran, (2) identifikasi genetik tetua, klon, galur dan (3) analisis keragaman genetik serta kekerabatan (Gao et al. 2006).
METODOLOGI
Waktu dan Tempat
Lokasi bahan tanaman meliputi : (1) Kebun Raya Bogor, (2) Taman Wisata Mekarsari, (3) Kebun Tajur PKBT LPPM IPB dan (4) kebun manggis Kampung Cengal Leuwiliang Bogor. Analisis laboratorium dilakukan di laboratorium : (1) Pusat Kajian Buah-buahan Tropika LPPM IPB, (2) Laboratorium Anatomi dan Morfologi Departemen Biologi Fakultas Matematika dan IPA IPB, dan (3) Laboratorium Biologi Molekuler BB-Biogen. Penelitian dilaksanakan pada bulan September 2009 sampai dengan September 2010.
Bahan dan Alat
Bahan tanaman manggis dan kerabatnya, diperoleh dari koleksi Kebun Raya Bogor, Pusat Kajian Buah-buahan Tropika LPPM IPB, Taman Wisata Mekarsari dan kebun manggis Kampung Cengal Leuwiliang Bogor (Tabel 1).
Tabel 1. Bahan tanaman tanaman manggis dan kerabatnya
No Tanaman Lokasi
1. G. celebica Kebun Raya Bogor 2. G. hombroniana1 Kebun Raya Bogor 3. G. hombroniana2 Kebun Raya Bogor 4. G. malaccensis no1 Taman Wisata Mekarsari 5. G. malaccensis no2 Taman Wisata Mekarsari 6. G. malaccensis no3 Taman Wisata Mekarsari 7. G. celebica TWM 17 Taman Wisata Mekarsari 8. G. celebica TWM 18 Taman Wisata Mekarsari 9. G. celebica (AJ) Kebun PKBT Tajur 10. G. celebica (AD) Kebun PKBT Tajur 11. G. porrecta Wall var Schizogyna Boerl Kebun PKBT Tajur 12. G. forbesii Kebun PKBT Tajur 13. C. inophyllum Kebun PKBT Tajur 14. G. subelliptica/Fukugi Kebun PKBT Tajur 15. G. mangostana no1 Leuwiliang Bogor 16. G. mangostana no.2 Leuwiliang Bogor 17. G. mangostana no. 3 Leuwiliang Bogor 18. G. mangostana no. 7 Leuwiliang Bogor 19. G. mangostana no. 10 Leuwiliang Bogor
Bahan kimia yang digunakan antara lain : CTAB, NaCl, Mercaptoetanol, Tris HCl, air bebas ion, pasir kuarsa, polypynylpolypyrolidone (PVP), Chloroform isoamylalkohol (CIAA 24:1), isopropanol, alkohol absolut 70%, loading dye, agarose, buffer TAE 1x, primer ISSR (12 primer), PCR mix, tube 1.5 ml, tube 0.2 ul, tip putih, tip kuning, tip biru, ethidium bromide. Bahan yang digunakan untuk anatomi stomata antara lain alkohol 70%, asam nitrat (HNO3) 40%, NaOCl, Safranin, Glyserin 20%, aquades, dan gelas objek.
Peralatan yang digunakan adalah water bath, mortar, gunting, mikropipet, tube rak, vortex, sentrifuge, UV spektofotometer, Polymerase Chain Reaction
(PCR) merk Applied Biosystem 2720 thermal cycler, elektroforesis merk Mupid, UV transiluminator, kamera digital dan canon power shoot A480, oven, mikroskop, pinset, mikrometer, dan colour chart Royal Horticultural Society fifth edition.
Metode
Penanda Morfologi Tanaman
Pengamatan morfologi tanaman meliputi karakter daun, bunga, buah, getah dan biji seperti pada Tabel 2 yang mengacu pada IPGRI (2003) pada Lampiran 4.
Tabel 2. Karakter pengamatan morfologi pada G. mangostana dan kerabatnya
Organ No Karakter Keterangan
Daun 1. warna daun muda (hijau muda, hijau muda kecoklatan, coklat merah)
pengamatan pada daun muda berumur dua minggu setelah
flushatau pecah tunas
2. warna daun tua (hijau, hijau tua) pengamatan pada daun dewasa dan tumbuh sempurna
3. bentuk daun (elips, oblong) pengamatan pada daun dewasa dan tumbuh sempurna
4. bentuk ujung daun (acute, acuminate, obtuse, retuse)
pengamatan pada daun dewasa dan tumbuh sempurna
5. jumlah bunga per kelompok (satu, dua, lebih dari tiga)
pengamatan pada saat antesis, yaitu bunga mekar dan ditandai terdapatnya nektar pada permukaan kepala putik
Tabel 2. Karakter pengamatan morfologi pada G. mangostana dan kerabatnya (lanjutan)
Organ No Karakter Keterangan
Bunga 6. jumlah mahkota (empat, lima) pengamatan pada saat antesis, yaitu bunga mekar dan ditandai terdapatnya nektar pada permukaan kepala putik
7. warna mahkota (kuning, kuning kehijauan, putih, merah muda, hijau kekuningan, kuning dengan tepi merah)
pengamatan pada saat antesis, yaitu bunga mekar dan ditandai terdapatnya nektar pada permukaan kepala putik
8. warna kelopak (hijau, putih) pengamatan pada saat antesis, yaitu bunga mekar dan ditandai terdapatnya nektar pada permukaan kepala putik
9. warna tangkai bunga (hijau, putih) pengamatan pada saat antesis, yaitu bunga mekar dan ditandai terdapatnya nektar pada permukaan kepala putik
10. ukuran bunga (kecil diameter < 3 cm, sedang diameter 3 cm, besar diameter > 3 cm)
pengamatan pada saat antesis, yaitu bunga mekar dan ditandai terdapatnya nektar pada permukaan kepala putik
11. posisi bunga (diujung, dibuku, diujung dan dibuku)
pengamatan pada saat antesis, yaitu bunga mekar dan ditandai terdapatnya nektar pada permukaan kepala putik
12. jumlah kelopak bunga (empat, lima)
pengamatan pada saat antesis, yaitu bunga mekar dan ditandai terdapatnya nektar pada permukaan kepala putik
Buah 13. jumlah buah per kelompok (satu, dua, tiga)
pengamatan pada buah matang (berumur 4 bulan)
14. posisi buah (diujung, dibuku) pengamatan pada buah matang 15. bentuk buah (bulat, gepeng,
lonjong)
pengamatan pada buah matang 16. warna stigmalobe (coklat, coklat
tua, merah)
pengamatan pada buah matang 17. ketebalan kulit (tipis, sedang,
tebal)
Tabel 2. Karakter pengamatan morfologi pada G. mangostana dan kerabatnya (lanjutan)
Organ No Karakter Keterangan
Buah 18. warna buah matang (ungu, merah, hijau, kuning, merah kekuningan)
pengamatan pada buah matang
19. memiliki kelopak buah (ada kelopak buah, tidak ada kelopak buah)
pengamatan pada buah matang
20. penonjolan ujung buah (ujung buah memanjang, ujung buah tidak memanjang)
pengamatan pada buah matang
21. warna aril (putih, putih kekuningan, kuning, tidak ada aril)
pengamatan pada buah matang
22. jumlah aril (empat, enam, tujuh, delapan)
pengamatan pada buah matang
Biji 23. bentuk biji (reniform, bulat) pengamatan pada biji dewasa 24. warna kulit biji (coklat muda,
coklat, coklat tua)
pengamatan pada biji dewasa
Getah 25. warna getah pada batang
(putih, kuning)
pengamatan pada batang muda
Stomata 26. rasio lebar terhadap panjang stomata (kecil, sedang, besar)
pengamatan pada daun dewasa dan tumbuh sempurna 27. bentuk sel epidermis di
permukaan atas daun (berlekuk dalam, berlekuk dangkal, rata)
pengamatan pada daun dewasa dan tumbuh sempurna
28. bentuk sel epidermis di permukaan bawah daun (berlekuk dalam, berlekuk dangkal, rata)
pengamatan pada daun dewasa dan tumbuh sempurna
29. keberadaan stomata di permukaan atas dan bawah daun (ada stomata, tidak ada stomata)
pengamatan pada daun dewasa dan tumbuh sempurna
Pengamatan stomata dilakukan dengan membuat sayatan paradermal menggunakan modifikasi metode utuh (whole mount) yang diwarnai dengan 1% safranin (Sass 1958). Tahapan preparat antara lain : daun difiksasi dalam 70% alkohol, kemudian dicuci dengan aquades, selanjutnya direndam dalam larutan 20% HNO3 selama 3-4 jam agar lapisan epidermis dapat dengan mudah dilepaskan dari jaringan mesofil. Lapisan epidermis tersebut direndam dalam 1% safranin selama 5 menit, setelah diwarnai diletakkan pada gelas objek dengan ditambahkan medium gliserin, kemudian ditutup dengan gelas penutup. Preparat diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 400x dan difoto menggunakan kamera digital canon power shoot A480 pada perbesaran lensa 3.3x megafixel. Karakter yang diamati adalah (1) tipe stomata, (2) panjang stomata, (3) diameter stomata, (4) bentuk sel epidermis permukaan atas dauan, (5) bentuk sel epidermis permukaan bawah daun dan (6) keberadaan stomata di permukaan atas maupun bawah permukaan daun. Data panjang dan diameter stomata merupakan nilai rata-rata dari pengukuran 5 ulangan bidang pandang yang dipilih secara acak. Setiap satu ulangan bidang pandang terdiri dari 4 buah stomata yang diamati yaitu 2 buah yang berukuran terbesar dan 2 buah yang berukuran terkecil.
Penanda Molekuler ISSR Isolasi DNA
Analisis molekuler diawali dengan isolasi DNA dengan menggunakan metode CTAB Doyle dan Doyle 1987 yang sudah dimodifikasi (Drabkoba et al.
2002). Sampel daun dari masing-masing bahan tanaman dihancurkan dengan menggunakan mortar yang di dalamnya ditambahkan buffer ekstrak, kemudian diinkubasi dalam waterbath pada suhu 65 0C selama 20 menit. Setelah inkubasi, ditambahkan larutan kloroform isoamyl alkohol/CIAA (24:1) sebanyak 1 kali volume kemudian divortex selama 1 menit hingga larutan tercampur.
Sampel disentrifuse dengan kecepatan 10 000 rpm selama 10 menit dengan tujuan untuk memisahkan bagian DNA dan bahan-bahan lainnya. Supernatan dimasukan ke dalam tabung baru dan ditambahkan CIAA kembali sebanyak 1x volume dan disentrifuse kembali. Supernatan ditambahkan
isopropanol sebanyak 1x volume. Larutan DNA tersebut disentrifuse kembali dan larutan di buang hingga pellet DNA tertinggal diujung tube, kemudian ditambahkan akohol 70% sebanyak 100 µl dan disentrifuge kembali. Alkohol dibuang dan pellet DNA dikeringkan dengan cara tube dibalik disimpan dalam desikator sampai pellet DNA mengering. Pelet DNA yang kering ditambahkan air bebas ion sebanyak 10 µl dan dijadikan sebagai stok DNA.
Uji kualitas DNA total dilakukan dengan menggunakan larutan agarose 0.8% dan dielektroforesis dalam larutan buffer TAE 1x yang dialirkan arus listrik dari muatan negatif menuju muatan positif selama selama 50 menit pada voltage 50 volt. Konsentrasi DNA total dapat diperkirakan berdasarkan hasil elektroforesis yaitu dengan cara membandingkan DNA total dengan lamda DNA. Lamda DNA yang digunakan produk merk promega. Lamda yang digunakan untuk mengecek konsentrasi DNA total dibutuhkan sebanyak 1µl dan diisikan pada lubang sumur pertama pada agarose. Konsentrasi Lamda DNA dalam 1 ul adalah 457 µg/ml. Volume DNA total untuk tes kualitas DNA digunakan sebanyak 5 µl, sehingga untuk setiap 1 µl DNA setara dengan 91.4 ng/µl. Kebutuhan DNA untuk tahapan PCR sebanyak 10 ng, maka DNA total diencerkan konsentrasinya menjadi 5x. Pewarnaan dengan cara perendaman gel agarose di dalam larutan EtBr 1% selama 10 menit, kemudian didokumentasikan dengan menggunakan kamera digital canon power shoot A480 pada penyinaran uv transilluminator. Elektroforesis ditujukan untuk pengecekan kualitas DNA total dan produk PCR.
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Polymerase Chain Reaction (PCR) dilakukan dengan alat PCR merk
Applied Biosystem 2720 thermal cycler. Primer yang digunakan adalah primer
Inter Simple Sequence Repeat (ISSR) koleksi Laboratorium Pusat Kajian Buah Tropika LPPM IPB sebanyak 12 primer dengan kode PKBT dan ISSRED. Primer yang digunakan untuk amplifikasi DNA adalah primer yang sudah diuji melalui tahap optimasi suhu di Laboratorium Pusat Kajian Buah Tropika (Tabel 3).
Tabel 3. Nama dan susunan basa primer koleksi PKBT-IPB No Nama Primer Susunan Basa Suhu Annealing No Nama Primer Susunan Basa Suhu Annealing 1 PKBT 2 (AC)8 TT 53 0C 7 PKBT 11 (GT)9 C 54 0C 2 PKBT 3 (AG)8 T 53 0C 8 ISSRED 20 (TCC) 5A 48 0C 3 PKBT 4 (AG)8 AA 53 0C 9 ISSRED 23 (CT) 8T 48 0C 4 PKBT 6 (AG)8TT 53 0C 10 ISSRED 17 (GAC) 5 48 0C 5 PKBT 8 (GA)9 C 54 0C 11 ISSRED 12 (AGAC) 4 36 0C 6 PKBT 9 (GA)9T 54 0C 12 ISSRED 18 (GGAT) 4 48 0C
Komposisi PCR yang digunakan dalam proses PCR meliputi DNA stok, primer ISSR, PCR mix go tag green master Promega dan air bebas ion. Komposisi PCR meliputi : DNA 10 ng/µl, primer 10 pmol/µl, PCR mix 12.5 µl, kemudian ditambahkan air bebas ion hingga mencapai volume 25 µl. Tahapan PCR meliputi pre heat, denaturation, annealing, extention, dan pendinginan suhu. Tahapan, penggunaan proses PCR terdapat pada Tabel 4.
Tabel 4. Suhu yang digunakan pada proses Polymerase Chain Reaction
(PCR)
Tahapan Suhu Waktu
Heat 940 C 4 menit
Denaturasi 940 C 30 detik Annealing 360 C-530C 30 detik
Extension 720 C 1 menit
Penurunan 720 C 5 menit
Pendinginan 40 C sampai tak terhingga
Siklus PCR 35 siklus
Pengamatan Penanda Morfologi dan Molekuler
Peubah atau parameter yang diamati pada penanda morfologi sebanyak 29 karakter meliputi bentuk, ukuran, tipe dan warna pada daun, bunga, buah, getah, biji dan stomata. Parameter morfologi yang dapat diamati, diasumsikan setara dengan jenis primer pada penanda molekuler, sedangkan lokus sub karakter setara dengan lokus pita pada penanda molekuler (Tabel 5).
Tabel 5. Asumsi kesetaraan pengamatan peubah dan lokus pada pengamatan penanda morfologi dan molekuler