Analisis hubungan kekerabatan manggis (Garcinia mangostana L ) menggunakan penanda morfologi dan molekuler (ISSR) terhadap kerabat dekatnya

(1)

ME

MOLEK

ENGGUNA

KULER (I

SE

INS

AKAN PE

ISSR) TER

SU

EKOLAH

TITUT PE

B

ENANDA M

RHADAP

ULASSIH

H PASCAS

ERTANIA

BOGOR

2011

MORFOL

KERABA

H

SARJANA

AN BOGO

LOGI DA

AT DEKA

A

OR

(2)

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Analisis Hubungan Kekerabatan Manggis (Garcinia mangostana L.) Menggunakan Penanda Morfologi dan Molekuler (ISSR) Terhadap Kerabat Dekatnya adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau kutipan dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.

Bogor, Januari 2011

Sulassih

(3)

SULASSIH. Analysis Relationship between Mangosteen (Garcinia mangostana

L.) and Its Relatives Based on Morphological and Moleculer Marker (ISSR) under direction of SOBIR and EDI SANTOSA

Mangosteen and its relatives of the genus Garcinia L. belong to the family Guttiferae which contains about 35 genera and up to 800 species. Guttifferae diversity was found across the Indonesian archipelago. In order to elucidate genetic diversity of mangosteen and its relatives, morphological and molecular analysis was conducted. Analysis of relationship through morphological marker and molecular ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) between 19 accessions of

G. mangostana and their close relatives revealed the phylogenetic relationship. The diversity based on 83 morphological characters, obtained 83 (100%) polymorphic loci Analysis of similarity resulted in 4 groups with distance of similarity coefficient 0.45-1.00. The diversity analysis using 12 ISSR primers, generated 130 loci in which 129 (99.23%) polymorphic loci and 1 (0.77%) monomorphic loci with 0.40-1.00 similarity coefficient, formed 3 groups. It is note worthy that epidermis cells pattern surround stomata cell of G. mangostana

is similar same as G. malaccensis and G. celebica. It is concluded that

G. celebica has a close relationship with G. mangostana and G. malaccensis.

(4)

SULASSIH. Analisis Hubungan Kekerabatan Manggis (Garcinia mangostana L.) Menggunakan Penanda Morfologi dan Molekuler (ISSR) Terhadap Kerabat Dekatnya. Dibimbing oleh SOBIR dan EDI SANTOSA.

Manggis (Garcinia mangostana) berasal dari Indonesia atau kawasan Asia Tenggara sebagai queen of tropical fruits merupakan Genus Garcinia dan famili Guttiferae. G. mangostana atau dikenal dengan manggis, merupakan komoditi yang bernilai ekonomis, tetapi masih memiliki permasalahan dalam hal mutu buah dan sistem perakaran. Keberagaman karakter Famili Guttiferae dapat digunakan untuk mengetahui hubungan kekerabatan, sehingga perlunya mengevaluasi hubungan kekerabatan. Hubungan kekerabatan Garcinia mangostana dengan kerabat lainnya dapat terungkap menggunakan analisis morfologi dan molekuler. Salah satu penanda molekuler yang dapat digunakan untuk mengungkap variabilitas genetik manggis adalah Inter Simple Sequence Repeats (ISSR). Analisis kekerabatan Garcinia mangostana bertujuan untuk menjelaskan hubungan kekerabatan antara Garcinia mangostana dengan kerabatnya.

G. mangostana dan kerabat dekatnya diperoleh 83 karakter yang berhasil diamati. Jumlah karakter polimorfik mencapai 100% yaitu sebanyak 83 karakter. Hasil analisis pengelompokan diperoleh sebanyak 4 kelompok pada koefisien

kemiripan 0.67 yaitu kelompok A meliputi G. hombroniana, G. celebica,

G. malaccensis dan G. mangostana, dan G. porecta, kelompok B meliputi

G. forbesii, kelompok C meliputi G. subelliptica, sedangkan kelompok D meliputi, C. inophyllum. Berdasarkan nilai analisis komponen utama, pengelompokan ditentukan oleh 7 karakter yaitu warna aril putih, ketebalan kulit buah sedang, ukuran bunga sedang, warna mahkota bunga kuning kehijauan, warna daun muda hija muda, posisi buah dibuku dan bentuk buah lonjong.

Analisis molekuler DNA terhadap 19 aksesi G. mangostana dan kerabat dekatnya menghasilkan 130 pita yaitu 129 pita polimorfik (99.23%) dan pita monomorfik sebanyak 1 pita (0.77%). Berdasarkan hasil analisis diperoleh 3

kelompok pada koefisien kemiripan 0.55 yaitu kelompok A meliputi

G. hombroniana, G. celebica, G. malaccensis, G. mangostana, dan G. porecta, kelompok B meliputi G. forbesii dan G. subelliptica, sedangkan kelompok C meliputi C. inophyllum. Analisis komponen utama pada PC ke-3 menghasilkan nilai kumulatif sebesar 70% dengan lokus penentu pengelompokan sebanyak 15 lokus yaitu pada primer PKBT2, PKBT3, PKBT4, PKBT8, PKBT9, PKBT11, ISSRED12, ISSSRED 13 dan ISSRED 23.

(5)

G. celebica dan G. hombroniana berwarna kuning kehijauan, sehingga ketika pengamatan karakter warna mahkota dilakukan pada saat musim yang bersamaan,

maka akan sulit untuk membedakan antara pohon G. celebica dan

G. hombroniana. Sama halnya dengan G. malaccensis dan G. porecta pada kondisi tertentu ditemukan warna buah matang dan bentuk buah G. malaccensis

mirip dengan G. porecta. Berbeda dengan analisis molekuler, G. celebica dapat dibedakan dengan G. hombroniana pada primer ISSRED20 dengan ukuran 250 bp dan 1200bp. Adapun kemiripan pita DNA G. celebica dengan G. malaccensis

dan G. mangostana terdapat pada primer ISSRED20 berukuran 400 dan 600 bp. Hipotesa Richards (1990b) menyatakan bahwa G. mangostana adalah hibrid dari tanaman dioecious (Richards 1990a) G. hombroniana sebagai tetua betina dan G. malaccensis sebagai tetua jantan, tetapi terdapat perbedaan dengan hasil pengamatan yaitu diperoleh hubungan kedekatan kerabat G. mangostana

dengan G. malaccensis dan G. celebica. Perbedaan tersebut disebabkan oleh perbedaan bahan tanaman, alat ukur dan perbedaan alat analisis yang digunakan. Berdasarkan hasil pengamatan dari ketiga metode analisis diperoleh kedekatan

G. mangostana dengan G. celebica dan G. malaccensis. G. celebica membentuk satu kelompok dengan G. mangostana pada koefisien kemiripan sebesar 0.75 atau 75%. Karakter pendukung terbentuknya kelompok tersebut yaitu pada pola susunan sel epidermis permukaan bawah daun, dimana bentuk dan pola sel

epidermis yang mengelilingi stomata pada G. celebica mirip dengan

G. mangostana dan G. malaccensis. Pola sel epidermis yang mengelilingi

stomata G. mangostana merupakan intermediat dari G. celebica dan

G. malaccensis. Selain pola sel epidermis, pada ujung buah G. hombroniana

tampak memanjang, Cupat atau stigmalobe G. celebica menempel pada ujung

buah seperti G. malaccensis dan G. mangostana. Warna mahkota bunga

G. mangostana merupakan intermediat antara G. celebica dan G. malaccensis

dengan asumsi pembawa warna kuning adalah G. celebica dan pembawa warna merah adalah G. malaccensis.

(6)

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB

(7)

MENGGUNAKAN PENANDA MORFOLOGI DAN

MOLEKULER (ISSR) TERHADAP KERABAT DEKATNYA

SULASSIH

Tesis

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada

Mayor Pemuliaan dan Bioteknologi Tanaman

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

(8)

(9)

Terhadap Kerabat Dekatnya Nama : Sulassih

NIM : A.253080041

Disetujui

Komisi Pembimbing

Dr. Ir. Sobir, MSi Dr. Edi Santosa, SP., MSi

Ketua Anggota

Diketahui

Ketua Mayor Dekan Sekolah Pascasarjana Pemuliaan dan Bioteknologi Tanaman

Dr. Ir .Trikoesoemaningtyas, MSc Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, MSc

(10)

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Alloh SWT atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema penelitian adalah Analisis Hubungan Kekerabatan Manggis (Garcinia mangostana L.) Menggunakan Penanda Morfologi dan Molekuler (ISSR) Terhadap Kerabat Dekatnya yang dilaksanakan sejak bulan September 2009 sampai dengan Agustus 2010.

Ucapan terima kasih dan penghargaan yang setinggi-tingginya penulis sampaikan kepada :

1. Dr. Ir. Sobir, MSi dan Dr. Edi Santosa, SP., MSi selaku komisi pembimbing yang telah memberikan arahan dan bimbingan sejak perencanaan, pelaksanaan penelitian sampai penyelesaian penyusunan tesis. 2. Dr. Ir. Trikoesoemaningtyas, MSc selaku Ketua Mayor Pemuliaan dan

Bioteknologi Tanaman SPs IPB dan Dr. Ir. Darda Efendi, MS selaku Sekretaris Mayor Pemuliaan dan Bioteknologi Tanaman SPs IPB.

3. Dirjen DIKTI yang telah memberikan bantuan dana melalui program Beasiswa Bantuan Program Pasca Sarjana(BPPS) tahun 2008.

4. Pusat Kajian Buah Tropika LPPM IPB, yang telah memberikan izin kepada penulis untuk melanjutkan studi.

5. Prof. Dr. Ir. Sriani Sujiprihati, MS, Dr. Ir. Faiza, MS dan Ir Baran Wirawan, MSc yang telah mendukung penulis untuk melanjutkan studi.

6. Prof. Dr. Ir. Sudarsono, MSc yang memberikan waktunya untuk berdiskusi. 7. Dr. Ir. Hajrial Aswidinnoor, MSc selaku penguji luar komisi pembimbing. 8. Dr. Ir. M. Reza Tirtawinata dari Taman Wisata Mekar Sari, Ir. Rismita Sari

MSc, dan Dr. Izu Andry Fijridiyanto, SSi, MSc dari Kebun Raya Bogor, Dr. Ir. Tri Joko dari Laboratorium Biologi Molekuler Balai Besar Penelitian

dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian, Dr. Ir. Dorly, MS dari Laboratorium Anatomi dan Biologi Departemen

(11)

MS, Dr. Rimbawan, Willy Bayuardi, SP, MSi dan Setiawan, SE yang telah mendukung penulis untuk melanjutkan studi.

11. Dr. Ir. Soaloon Sinaga, Dr. Ir. Arief Nasution, MSi, Dr. Fitmawati, SSi, MS., Dr. Ir. Lizawati MSi., Dr. Ir. Amin Retnoningsih MSi., Dr. Ir. Fatimah Nursandi., MSi, Ir. Ellina Mansyah, MP., Ir. Kasutjianingati, MSi., Rosmaina, SP, MSi., atas dukungannya untuk melanjutkan studi.

12. Wening Enggarini, SSi, MSi., Ir. Susanti Basuki, MPhil, Ir. Suskandari, MSi., Ir. Atra Romeida, MSi., Ir. Arifah, MSi., Rd. Selvy Handayani, SP, MSi., Ismadi, SP, MSi, Alwi Mustaha, SP, MSi., Karlin Agustina, SP, MSi, Hilda Susanti, SP, MSi, Safrizal, SP, MSi atas bantuan dan waktunya untuk berdiskusi.

13. Dede Safitri, Kusuma Darma, SP, MSi, Heri Harti, SP, MSi., Endang Gunawan, SP, MSi., Naekman Naibaho, SP., Rike Lesmawati, Rena Destriani, Rina, Wulan, Ubay, Sulaeman, Baesuni dan Imas atas dukungannya.

14. Pa Dani, Walter, Arif, Anton, Anggi, Ai, Arin, Cia, Cici, Cori, Daner, Dian, Furi, Nofi, Neli, Roma, Mawi, Misnen, Okti, Prima, Peni, Ria, Susi, Umi, Uma, Yani, Wage, Erni Suminar, Yusi Arisanti, Heni, Noorohmah, Alvin Widyastuti, Deden, Karlina, Asep atas kebersamaannya selama perkuliahan.

15. Teman-teman di Faperta IPB, Rektorat IPB, dan LPPM IPB.

16. Teman-teman Mayor AGH, PBT dan Tekben 2007, 2008, 2009 dan 2010 atas kebersamaannya.

Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi pengembangan ilmu pengetahuan dan ilmu pertanian.

Bogor, Januari 2011

(12)

Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 27 Oktober 1976 dari ayah Paino dan ibu Marsinem. Penulis merupakan putri ke empat dari enam bersaudara. Tahun 1995 penulis lulus dari SMA Negeri 5 Bogor dan pada tahun yang sama penulis melanjutkan studi pada program diploma III Teknologi Benih Fakultas Pertanian IPB. Pada tahun 2000, penulis diterima pada program sarjana Jurusan Agronomi Universitas Nusa Bangsa Bogor dan lulus pada tahun 2003.

Penulis bekerja sebagai tenaga penunjang di Tata Usaha Fakultas Pertanian IPB pada tahun 1999 dan dialihkan pada Kantor Audit Internal IPB tahun 2004. Penulis bekerja sebagai penanggung jawab Laboratorium Pusat Kajian Buah Tropika LPPM IPB sejak tahun 2005.

(13)

Halaman

DAFTAR TABEL ... xiv

DAFTAR GAMBAR ... xvi

DAFTAR LAMPIRAN ... xviii

PENDAHULUAN ... 1

Latar Belakang ... 1

Tujuan ... 3

Kerangka Pemikiran ... 4

TINJAUAN PUSTAKA ... 7

Manggis dan Kerabat Dekatnya ... 7

Ekspresi Sex Individu Tanaman Berbunga ... 9

Penanda Morfologi ... 10

Penanda Molekuler InterSimple Sequence Repeats (ISSR)... 12

METODOLOGI ... 15

Waktu dan Tempat ... 15

Bahan dan Alat ... 15

Metode ... 16

Analisis Data ... 25

HASIL DAN PEMBAHASAN ... 27

Keberagaman Karakter Morfologi ... 27

Analisis Penanda Morfologi ... 29

Analisis Penanda Molekuler ... 34

Analisis Gabungan Penanda Morfologi dan Molekuler ... 40

Keberagaman dan keragaman Garcinia mangostana dan kerabatnya .. 42

PEMBAHASAN UMUM ... 47

SIMPULAN ... 55

Simpulan ... 55

Saran ... 55

DAFTAR PUSTAKA ... 57

(14)

Halaman

1. Bahan tanaman tanaman manggis dan kerabatnya ... 15

2. Karakter pengamatan morfologi pada G. mangostana dan kerabatnya .. 16

3. Nama dan susunan basa primer koleksi PKBT-IPB ... 21

4. Suhu yang digunakan pada proses Polymerase Chain Reaction (PCR) ... 21

5. Asumsi kesetaraan pengamatan peubah dan lokus yang teramplifikasi pada pengamatan penanda morfologi dan molekuler ... 22

6. Pengamatan parameter dan lokus pada penanda morfologi ... 22

7. Pengamatan parameter dan lokus pada penanda molekuler ... 24

8. Rekapitulasi karakter polimorfik penanda morfologi pada G. mangostana dan kerabatnya ... 29

9. Koefisien kemiripan G. mangostana dengan kerabat dekatnya pada penanda morfologi ... 32

10. Nilai analisis komponen utama pada karakter morfologi ... 32

11. Karakter morfologi pembentuk komponen utama ... 33

12. Rekapitulasi jumlah amplifikasi pita DNA G. mangostana dan kerabat dekatnya pada 11 primer ISSR ... 35

13. Koefisien kemiripan G. mangostana dengan kerabat dekatnya menggunakan penanda molekuler ... 37

14. Nilai komponen utama pada karakter molekuler ... 37

15. Karakter pita DNA pembentuk komponen utama ... 38

16. Rekapitulasi jumlah karakter dan lokus hasil analisis gabungan ... 40

17. Nilai koefisien kemiripan G. mangostana dengan kerabat dekatnya pada analisis gabungan kedua penanda ... 41

(15)

20. Perbandingan koefisien kemiripan G. mangostana dengan kerabat dekatnya pada penanda morfologi, molekuler DNA dan gabungan kedua penanda ... 45 21. Perbedaan kedekatan kekerabatan antara hasil pengamatan dan

hipotesa Richards (1990b) ... 51 22. Perbedaan metodologi hasil pengamatan dan hipotesa Richards

(1990b) ... 51 23. Kemiripan karakter morfologi pada G. celebica, G. malaccensis dan

(16)

Halaman

1. Bagan alir penelitian untuk mengamati kekerabatan genus Garcinia

menggunakan penanda morfologi dan molekuler ... 5 2. Wilayah amplifikasi Inter Simple Sequence Repeats (ISSR) ... 12 3. Hasil pengamatan morfologi karakter warna daun muda, warna daun

tua, warna mahkota bunga, warna buah matang, warna aril, warna

kulit biji dan warna getah batang pada G. hombroniana (A),

G. malaccensis (B), G.mangostana (C), G. celebica (D), G. porecta

(E), G. forbesii (F), G. subelliptica (G) dan C. inophylum (H) ... 27 4. Bentuk sel epidermis dan tipe stomata pada permukaan bawah daun

G. hombroniana (A), G. malaccensis (B), G. mangostana (C),

G. porecta (D), G. celebica (E), G. forbesii (F), G. subelliptica (G) dan C. inophyllum (H) pada perbesaran 400x dan difoto menggunakan kamera digital canon power shoot A480. Angka 1-6 adalah sel disekeliling sel stomata . ... 28 5. Dendrogram analisis karakter morfologi G. mangostana dan kerabat

dekatnya membentuk 4 kelompok pada koefisien kemiripan 0.67 ... 31 6. Analisis komponen utama dalam dua dimensi pada karakter

morfologi G. mangostana dan kerabatnya dengan membentuk 6

kelompok yaitu kelompok A meliputi G. hombroniana dan

G. celebica, kelompok B meliputi G. malaccensis dan

G. mangostana, kelompok C meliputi G. porecta, kelompok D meliputi G. forbesii, kelompok E meliputi G. subelliptica dan kelompok F meliputi C. inophyllum ... 34 7. Dendrogram analisis karakter molekuler (DNA) pada G. mangostana

dan kerabat dekatnya. Terbentuk 3 kelompok pada nilai koefisien kemiripan 0.47 ... 36 8. Karakter pola pita DNA G. mangostana dan kerabat dekatnya pada

primer PKBT8. H1, H2 = G. hombroniana, M1, M2, M3 =

G. malaccensis, L1, L2, L3, L7, L10 = G. mangostana, P1, AB =

G. porecta, AJ, C2, AD, C17, C18 = G. celebica, For = G. forbesii,

Fu = G. subelliptica dan Ny = C. inophyllum. ... 39 9. Hasil analisis komponen utama yang digambarkan ke dalam gambar

dua dimensi, menggunakan penanda molekuler pada G. mangostana

dan kerabatnya dekatnya membentuk 6 kelompok yaitu kelompok A terdiri dari G. celebica dan G. hombroniana, kelompok B terdiri

(17)

10. Dendrogram analisis gabungan antara karakter morfologi dan molekuler G. mangostana dan kerabat dekatnya membentuk 3 kelompok pada koefisien kemiripan 0.52. ... 41 11. Pola pita pembeda G. mangostana pada primer ISSRED18. Tanda

panah menunjukan tidak adanya pita pada G. mangostana pohon

ke-2 ukuran 400 bp. Keterangan aksesi yaitu : H1, Hke-2 =

G. hombroniana, M1, M2, M3 = G. malaccensis, L1, L2, L3, L7, L10 = G. mangostana, P1, AB = G. porecta, AJ, C2, AD, C17, C18

= G. celebica, For = G. forbesii, Fu = G. subelliptica dan Ny = C. inophyllum ... 43 12. Kemiripan pola pita DNA G. malaccensis pada primer PKBT9

dengan ukuran 250, 600, 800, 1000 dan 1300 bp. Keterangan aksesi yaitu : H1, H2 = G. hombroniana, M1, M2, M3 = G. malaccensis,

L1, L2, L3, L7, L10 = G. mangostana, P1, AB = G. porecta, AJ,

C2, AD, C17, C18 = G. celebica, For = G. forbesii,

Fu = G. subelliptica dan Ny = C. inophyllum ... 44 13. Pertumbuhan polen setelah 5 (2) dan 16 jam (3) dikecambahkan

pada bunga G. porrecta betina (A), G. celebica jantan (B) dan G. porrecta jantan (C). Tanda panah menunjukan benang sari/stamen yang terbentuk pada bunga G. porrecta betina pada perbesaran 400x dan difoto menggunakan kamera digital canon power shoot A480 perbesaran lensa 3.3x megafixel (B2, B3 dan C2) dan 4.6 megafixel (A2, A3 dan C2) ... 49

14. Hasil pengamatan sayatan melintang bakal buah pada bunga

G. hombroniana (1), G. celebica (2), G. porecta (3), C. inophyllum

(4), G. subelliptica (5). Sayatan melintang bakal buah pada bunga jantan G. celebica (6), G. porecta (7). Bunga untuk pengamatan bakal buah (A) dan sayatan melintang bakal buah (B). Tanda panah menunjukan calon biji pada bunga betina ... 50 15. Karakter morfologi pada bunga (1), buah (2) dan sel epidermis (3)

G. hombroniana (A), G. celebica (B), G. malaccensis (C) dan

(18)

Halaman

1. Koefisen kemiripan pada G. mangostana dan kerabat dekatnya

berdasarkan penanda morfologi ... 62

2. Koefisen kemiripan pada G. mangostana dan kerabat dekatnya berdasarka penanda molekuler ... 63

3. Koefisen kemiripan pada G. mangostana dan kerabat dekatnya berdasarkan penanda gabungan ... 64

4. Deskripsi pengamatan morfologi IPGRI 2003 ... 65

5. Karakter pengamatan morfologi ... 71

(19)

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Manggis (Garcinia mangostana) berasal dari Indonesia atau kawasan Asia Tenggara (Almeyda dan Martin 1976) dikenal sebagai queen of tropical fruits

merupakan Genus Garcinia dan famili Guttiferae. Famili Guttiferae dibagi menjadi 4 suku/sub famili yaitu : (1) Clusieae meliputi Mahurea, Marila, Godoya, Clusia, (2) Garcinieae meliputi Ochrocarpos, Marialva, Michranthera, dan

Garcinia, (3) Calophylleae meliputi : Mammea, Xanthocymus, Stalagmitis, Mesua, Calophyllum dan (4) Symphonieae meliputi Canella, Moronobea, Chrysopia, Macanea, Singana dan Rheedia (Choisy, 1824).

Genus Garcinia memiliki sekitar 800 species (Osman dan Milan 2006). Berdasarkan data di Herbarium Bogoriense, terdapat 100 jenis Garcinia di Indonesia (Sari 1996). Genus Garcinia terdapat di pulau Kalimantan sebanyak 25 species diantaranya adalah Garcinia malaccensis dan Garcinia xanthochymus, sedangkan di Sumatera dan Sulawesi masing-masing sebanyak 22 species, di Irian Jaya (Papua) 17 species, Jawa 8 species dan Nusa Tenggara sebanyak 5 species (Uji 2007). Genus Garcinia di Indonesia sebagian besar masih tumbuh liar di hutan-hutan, tetapi ada yang telah dibudidayakan seperti asam gelugur (Garcinia atroviridis), mundu (Garcinia dulcis), manggis (Garcinia mangostana), asam kandis (Garcinia nigrolineata), ceri (Garcinia parviflora) dan Garcinia beccari

(Uji 2007).

Manggis atau G. mangostana merupakan komoditi yang bernilai ekonomi, hal tersebut dapat dilihat dengan luasnya negara tujuan ekspor yaitu Cina, Hongkong, Malaysia, Thailand, Singapura, Perancis, Belanda, Kuwait, Qatar, dan

Arab Saudi sebagai pasar ekspor buah manggis yang potensial, dengan nilai

ekspor 796,375.00 USD (Deptan 2006). Produksi manggis Indonesia tahun 2009

mencapai 105,558 ton (BPS 2010). Meskipun demikian, tanaman manggis

(20)

(3) ukuran buah tidak seragam, masa juvenile manggis cukup lama, (4) miskin akar serabut dan (5) terjadi retak pada kulit pohon. Permasalahan-permasalahan tersebut disebabkan karena tanaman mengalami stress/kekurangan air pada saat musim kemarau. Solusi permasalahan tersebut yaitu dengan melakukan perbanyakan secara vegetatif menggunakan sambung pucuk maupun sambung asuh (Deptan 2007). Sambung asuh dapat dilakukan dengan menggunakan kerabat dekat G. mangostana, sehingga perlunya informasi keberagaman kerabat dekat

G. mangostana.

Genus Garcinia beragam dalam karakter morfologi pada (1) bunga, (2) daun, (3) buah (4) embrio dan biji, serta (5) warna getah. Tipe sex bunga kerabat

G. mangostana dapat dibedakan menjadi 3 yaitu : bunga hermaprodit, monoecious

dan dioecious. Jumlah kelopak serta mahkota terdiri dari 2, 3, 4 atau 5. Warna pada kelopak bunga berwarna kuning kehijauan dan putih, sedangkan mahkota bunga beragam yaitu putih, kuning, merah, hijau, hijau kekuningan merah muda dan ungu (Sari 2000).

Ukuran dan bentuk daun beragam, antara lain G. lattisima yang memiliki bentuk daun elips dan besar, berukuran 25-40 x 10-15 cm dan G. graminea yang memiliki bentuk daun panjang dan sempit. Warna getah meliputi warna putih dan kuning. Bentuk buah bervariasi dari bentuk lonjong sampai oval. Identifikasi karakter Garcinia dapat dicirikan pula melalui karakter kelopak bunga berjumlah 4 helai, mahkota bunga berjumlah 4 helai, benangsari berjumlah 6 buah dengan posisi mengelilingi dasar bakal buah, polen berbentuk bulat, bakal buah berbentuk oval, dan buah terdiri dari lokus yang umumnya berjumlah 8 berbiji (Sari 2000).

(21)

Keberagaman karakter dapat digunakan untuk mengetahui hubungan kekerabatan, sehingga perlu dilakukannya evaluasi hubungan kekerabatan antara

G. mangostana dengan beberapa kerabat dekatnya. Keragaman genetik dan hubungan kekerabatan G. mangostana dengan kerabat dekatnya dapat terungkap dengan menggunakan analisis morfologi dan molekuler. Penanda morfologi ditujukan pada karakter kualitatif seperti karakter warna dan bentuk pada bunga, buah, daun, biji, getah serta tipe stomata. Karakter kualitatif dikendalikan oleh gen sederhana (satu atau dua gen) dan sedikit dipengaruhi oleh lingkungan (Stoskopf

et al. 2009).

Penanda molekuler yang dapat digunakan untuk mengungkap variabilitas genetik manggis adalah Inter Simple Sequence Repeats (ISSR) (Mansyah 2010). Keuntungan ISSR antara lain (1) tidak dipengaruhi musim dan lingkungan (Azrai 2005), (2) tidak diperlukannya data sekuen terlebih dahulu, (2) membutuhkan 5-50 ng templat DNA per reaksi, (3) ISSR tersebar diseluruh genom (4) dapat menghasilkan pola polimorfisme lebih tinggi daripada RAPD (Gao et al. 2006), (5) menghasilkan polimorfisme pada tingkat interspecies (Zietkiewicz et al.

1994), (6) bersifat dominan (Soltis et al. 1998; Kumar et al. 2009), (7) dapat digunakan untuk analisis keragaman genetik dan analisis kekerabatan (Trojanowska dan Bolibok 2004).

Tujuan

Penelitian keragaman genetik Garcinia mangostana dan kerabatnya pada tingkat individu tanaman bertujuan :

a. Menjelaskan hubungan kekerabatan antara Garcinia mangostana dengan kerabatnya berdasarkan penanda morfologi.

(22)

Kerangka pemikiran

Genus Garcinia memiliki sekitar 800 species (Osman dan Milan 2006). Genus Garcinia terdapat di sepanjang kepulauan Indonesia seperti pulau Kalimantan, Sumatra, Sulawesi, di Irian Jaya (Papua), Jawa dan Nusa Tenggara (Uji 2007). Kekayaan plasma nutfah genus Garcinia tersebut memiliki keragaman pada bentuk, ukuran, warna dan tipe, baik dari bunga, buah, daun, embrio, biji maupun getah.

Manggis (Garcinia mangostana L.) diyakini merupakan hibrid dari

Garcinia hombroniana dan Garcinia malaccensis (Richards 1990b) berdasarkan hasil pengamatan 13 karakter morfologi. Namun, analisis kekerabatan menggunakan penanda AFLP menunjukan adanya kemiripan dengan G. celebica

dan G. porrecta (Sinaga 2008). Yapwattanaphun dan Subhadrabandhu (2004)

menyatakan bahwa G. hombroniana mengelompok dengan G. rostrata, G. speciosa dan G. sizygiifolia letaknya berdekatan dengan kelompok

G. mangostana dan G. malaccensis. Hal tersebut mendasari untuk melakukan penelitian, dengan tujuan diperoleh kejelasan hubungan antara G. mangostana

(23)

Gambar 1. Bagan alir untuk mengamati kekerabatan genus Garcinia

menggunakan penanda morfologi dan molekuler Keberagaman Genus Garcinia

Penanda morfologi Penanda molekular

Ekspresi individu tanaman berbunga

Pengamatan

Scoring/genotyping

Analisis • Koefisien kemiripan • Pengelompokan • Kesesuaian good of fit • Komponen utama

(24)

(25)

TINJAUAN PUSTAKA

Manggis dan Kerabat Dekatnya

Manggis (Garcinia mangostana) sebagai queen of tropical fruits

merupakan famili Guttiferae. Manggis berasal dari Indonesia atau kawasan Asia Tenggara (Almeyda dan Martin 1976). Manggis atau G. mangostana termasuk ke dalam famili Guttiferae. Famili Guttiferae menurut Choisy (1824) terdiri dari 4 suku yaitu (1) Clusieae, (2) Garciniaeae, (3) Calophylleae, dan (4) Symphonieae. Suku Clusieae terdiri dari Mahurea, Marila, Godoya dan Clusia. Suku Garciniaeae terdiri dari genus Ochrocarpos, Marialva, Micranthera, Garcinia. Genus

Garcinia dibagi menjadi 2 section atau sub genus yaitu sub genus ke-1 adalah

Mangostana seperti species G. mangostana, G. cornea, G. cambogia dan

G. Morella sedangkan sub genus ke-2 adalah Brindonia seperti

G. cochinchinensis, G. elliptica, G. indica dan G. cowa. Suku Calophylleae terdiri dari genus Mammea, Xanthocymus, Stalagmitis, Mesua dan Calophyllum. Suku Symphonieae terdiri dari genus Canella, Moronobea, Chrysopia, Macanea, Singana dan Rheedia.

Berdasarkan klasifikasi famili Guttiferae menurut Choisy (1824), hubungan G. mangostana dengan C. inophyllum adalah termasuk ke dalam famili

Guttiferae tetapi berbeda suku dan genus yaitu G. mangostana termasuk ke dalam suku Garcinieae dan genus Garcinia, sedangkan C. inophyllum termasuk ke

dalam suku Calophylleae dan genus Chalopyllum. G. mangostana dengan

G. subelliptica termasuk ke dalam suku yang sama yaitu suku Garcinieae, tetapi berbeda sub genus/section. G. mangostana termasuk ke dalam sub genus ke-1 yaitu sub genus Mangostana sedangkan G. subelliptica termasuk ke dalam sub genus ke-2 yaitu sub genus Brindonia.

Jones (1980) mengklasifikasikan genus Garcinia menjadi 14 sub genus berdasarkan karakter mahkota bunga, kelopak bunga dan polen. Sub genus

Garcinia yaitu (1) Garcinia, (2) Rheediopsis, (3) Teracentrum, (4) Rheedia, (5) Macrostigma, (6) Tetraphalangium, (7) Tripetalum, (8) Brindonia,

(26)

(13) Discostigma, dan (14) Tagmanthera. Sari (2000) mengklasifikasikan

G. mangostana, G. celebica, G. hombroniana, G. porrecta ke dalam sub genus ke-1 yaitu Garcinia. G. subelliptica termasuk ke dalam sub genus ke-11 yaitu

Xanthocymus sedangkan G. forbesii merupakan out group dari genus Garcinia,

meskipun stuktur buah mirip dengan buah G. mangostana. Sama halnya dengan

C. inophyllum yang merupakan out group dari genus Garcinia, karena

C. inopyllum termasuk genus Calophyllum.

G. mangostana merupakan allotetraploid dari persilangan Garcinia hombroniana (2n=48) dan Garcinia malaccencis (2n=42) (Richards 1990b)

berdasarkan karakter morfologi yaitu (1) waktu berbunga, (2) warna getah, (3) warna mahkota bunga, (4) kedudukan stigma, (5) tekstur permukaan stigma,

(6) rasio stigma lobes, (7) diameter stigma, (8) susunan benang sari, (9) ada tidaknya benang sari pada bunga betina, (10) bentuk buah, (11) tekstur permukaan kulit buah, (12) warna buah matang (13) aroma aril. Karakter warna getah, warna mahkota bunga, kedudukan stigma dan warna buah dari G. mangostana mirip dengan G. malaccensis, sedangkan empat karakter lainnya meliputi permukaan stigma, bentuk/kerapatan benangsari, bentuk buah dan permukaan buah mirip dengan G. hombroniana.

Berdasarkan penelitian Yapwattanaphun dan Subhadrabandhu (2004), dengan menambahkan sekuen T dan C pada area ITS 1 (Internal Transcribed Spacer) pada DNA ribosom (rDNA), terdapat kemiripan melalui pengelompokan

dari G. atroviridis, G. cowa, G. dulcis, G. malaccensis, G. mangostana, G. rostrata dan G. vilersiana. Kelompok yang dekat dengan G. mangostana

adalah G. malaccensis dan G. hombroniana. Kemiripan G. mangostana

berdasarkan penanda AFLP diperoleh bahwa G. malaccensis menghasilkan 57.5% pita sebagai tetua jantan dan 17.5% dari G. hombroniana sebagai tetua betina (Sinaga, 2008). Penanda isozim diperoleh informasi bahwa G. celebica

menghasilkan pita yang lebih sama dengan G. mangostana, sehingga diduga terdapat kerabat dekat lain yang dapat menjadi kandidat tetua seperti G. porrecta,

(27)

Ekspresi Sex Tanaman Berbunga

Ekspresi sex tanaman berbunga dapat dibagi menjadi tiga bagian yaitu (1) individu bunga, (2) individu tanaman dan (3) populasi. Ekspresi sex pada individu bunga dibagi menjadi tiga tipe yaitu (1) bunga hermaprodit yaitu bunga yang memiliki benang sari dan putik, (2) bunga androecious yaitu bunga yang hanya memiliki benang sari tanpa memiliki bakal buah dan (3) bunga gynoecious yaitu bunga yang memiliki putik tanpa memiliki benang sari. Ekspresi sex pada individu tanaman terbagi menjadi 7 tipe yaitu (1) tanaman hermaprodit yaitu individu tanaman yang hanya memiliki bunga hermaprodit, (2) tanaman

monoecious yaitu tanaman yang memiliki bunga jantan dan bunga betina dalam satu pohon, (3) tanaman androecious yaitu tanaman yang hanya memiliki bunga jantan, (4) tanaman gynoecious yaitu tanaman yang hanya memiliki bunga betina, (5) tanaman andromonoecious yaitu tanaman yang memiliki bunga hermaprodit dan bunga jantan, (6) gynomonoecious yaitu tanaman yang memiliki bunga hermaprodit dan bunga betina dan (7) trimonoecious yaitu tanaman yang memiliki bunga hermaprodit, bunga jantan dan bunga betina. Ekpresi sex pada populasi dibagi menjadi 5 tipe antara lain : (1) populasi hermaprodit yaitu populasi yang terdiri dari hanya tanaman hermaprodit, (2) populasi monoecious yaitu populasi yang terdiri dari hanya tanaman monoecious, (3) populasi dioecious yaitu populasi yang terdiri dari tanaman androecious dan gynoecious, (4) populasi androecious

yaitu populasi yang terdiri dari tanaman hermaprodit dan androecious dan (5) populasi gynodioecious yaitu populasi yang terdiri dari tanaman hermaprodit

dan gynoecious (Frankel dan Galun 1977).

(28)

diasumsikan bahwa tanaman tersebut adalah obligate agamospermy (Downtown dan William 2009). Berdasarkan hasil penelusuran literatur (Te-chato 2007), disimpulkan bahwa yang dimaksud dengan tanaman jantan adalah tanaman genus

Garcinia lain yang memiliki polen yang viabel. Serbuk sari atau polen pada bunga manggis sendiri umumnya mengalami rudimenter, yaitu mengecil dan mengering, maka buah manggis hanya dihasilkan melalui perkembangan bunga betina tanpa melalui pembuahan. Kondisi ini dikenal dengan nama apomiksis. Fenomena apomiksis ini yang menyebabkan keseragaman manggis.

Penanda Morfologi

Penanda morfologi merupakan penanda yang dapat digunakan untuk mengukur besarnya keragaman pada tanaman berdasarkan karakter fenotipe, baik pada fase vegetatif maupun fase generatif. Karakter morfologi pada fase vegetatif ditujukan pada pengamatan batang dan daun, sedangkan pada fase generatif melalui bunga, buah dan biji. Karakter kualitatif meliputi warna dan bentuk dikendalikan oleh gen sederhana (satu atau dua gen) dan sedikit dipengaruhi oleh lingkungan (Stoskopf et al. 2009).

Karakter morfologi tanaman memperlihatkan perbedaan pada organ akar, batang dan daun. Daun lengkap mempunyai bagian upih daun atau pelepah daun (vagina), tangkai daun (petioles), dan helaian daun (lamina) sedangkan daun tidak lengkap yaitu daun yang kehilangan salah satu bagian dari daun. Heterofili adalah bentuk daun yang berlainan pada satu pohon pada cabang yang berlainan, sedangkan anisofili adalah terdapat dua bentuk daun pada cabang yang sama. Bentuk daun dapat dilihat pada rasio panjang terhadap lebar daun. Bentuk daun oval/elips/jorong apabila rasio panjang : lebar menunjukan 1.5 - 2 : 1, bentuk

memanjang/oblong jika rasio menunjukan 2.5 – 3 : 1, dan lanset dengan rasio 3 – 5 : 1 (Tjitrosoepomo 2005).

Bentuk ujung daun terbagi menjadi bentuk (1) runcing yaitu ujung daun membentuk sudut lancip 900, (2) meruncing (acuminatus) yaitu ujung runcing

(29)

(truncates) ujung daun rata, (5) ujung terbelah (retusus) ujung daun terdapat lekukan dan (6) ujung berduri (mucronatus) (Tjitrosoepomo 2005). Bentuk

acuminate dapat didefinisikan pula sebagai ujung yang meruncing sehingga pada ujung daun membentuk cekungan sepanjang sisi pada ujungnya. Bentuk acute

meruncing ke ujung dengan bentuk lurus pada kedua sisi ujung daun. Bentuk pangkal daun terbagi menjadi (1) oblique apabila bentuk pangkal daun tidak seimbang, (2) membulat (rounded), (3) aequilateral apabila kedua sisi bentuk seimbang, (4) cuneate apabila pangkal meruncing (Harris dan Harris 2004).

Hipotesa Richards (1990b) menyatakan bahwa karakter morfologi

G. mangostana berada diantara karakter G. hombroniana dan G. malaccensis

berdasarkan : (1) waktu berbunga, (2) warna getah, (3) warna mahkota bunga, (4) kedudukan stigma, (5) tekstur permukaan stigma, (6) rasio stigma lobes, (7) diameter stigma, (8) susunan benang sari, (9) ada tidaknya benang sari pada

bunga betina, (10) bentuk buah, (11) tekstur permukaan kulit buah, (12) warna buah matang (13) aroma aril. Karakter morfologi G. mangostana mirip dengan

G. celebica, G. porrecta, dan G. hombroniana yaitu memiliki kesamaan karakter pada morfologi tajuk, daun dan bunga. Pada bunga terdapat empat kelompok tangkai sari, mengelilingi putik/pistil terdiri dari 170 kotak sari yang mengandung polen (Zakki 2003).

(30)

Penanda Molekuler Inter Simple Sequence Repeats (ISSR)

Penanda molekuler digunakan untuk menunjukan polimorfisme pada

tingkat DNA. Penanda molekuler yang diharapkan adalah sebagai berikut : (1) polimorfik yang tinggi, (2) kodominan untuk dapat membedakan homozigot

dan heterozigot pada tanaman diploid, (3) pemunculan diseluruh genom, (4) selektif terhadap perilaku alami, (5) pendugaan mudah, cepat dan murah untuk

dideteksi, dan (7) reproducibility tinggi (Kumar et al. 2009).

Penanda dengan menggunakan DNA terbagi menjadi dua tipe yaitu (1) non PCR seperti RFLP dan (2) berbasis PCR seperti RAPD, AFLP, SSR, ISSR dengan terbentuknya separasi pita hasil proses elektroforesis sebagai pencerminan alel atau lokus. Penanda molekuler berbasis sekuen DNA dapat terdeteksi dan pewarisan sifat mudah diamati, sehingga efisien untuk evaluasi dan seleksi.

Penanda molekuler Inter Simple Sequence Repeats (ISSR) merupakan salah satu penanda dengan motif sekuen berulang. Ada kalanya terdapat penambahan sekuen nukleotida baik pada bagian ujung 3’ maupun ujung 5’ seperti (CA)8RG dan (CA)8RY. ISSR adalah fragmen DNA dengan ukuran 100-3000 bp berlokasi diantara wilayah mikrosatelit, wilayah amplifikasi sekuen DNA yaitu pada inter-SSR bagian flanked genom secara berlawanan pada area yang dekat dengan sekuen berulang (Zietkiewicz et al. 1994). Area amplifikasi menurut Zietkiewicz et al. (1994) dapat dilihat pada Gambar 2.

(31)

(32)

(33)

METODOLOGI

Waktu dan Tempat

Lokasi bahan tanaman meliputi : (1) Kebun Raya Bogor, (2) Taman Wisata Mekarsari, (3) Kebun Tajur PKBT LPPM IPB dan (4) kebun manggis Kampung Cengal Leuwiliang Bogor. Analisis laboratorium dilakukan di laboratorium : (1) Pusat Kajian Buah-buahan Tropika LPPM IPB, (2) Laboratorium Anatomi dan Morfologi Departemen Biologi Fakultas Matematika dan IPA IPB, dan (3) Laboratorium Biologi Molekuler BB-Biogen. Penelitian dilaksanakan pada bulan September 2009 sampai dengan September 2010.

Bahan dan Alat

Bahan tanaman manggis dan kerabatnya, diperoleh dari koleksi Kebun Raya Bogor, Pusat Kajian Buah-buahan Tropika LPPM IPB, Taman Wisata Mekarsari dan kebun manggis Kampung Cengal Leuwiliang Bogor (Tabel 1).

Tabel 1. Bahan tanaman tanaman manggis dan kerabatnya

No Tanaman Lokasi

(34)

Bahan kimia yang digunakan antara lain : CTAB, NaCl, Mercaptoetanol, Tris HCl, air bebas ion, pasir kuarsa, polypynylpolypyrolidone (PVP), Chloroform isoamylalkohol (CIAA 24:1), isopropanol, alkohol absolut 70%, loading dye, agarose, buffer TAE 1x, primer ISSR (12 primer), PCR mix, tube 1.5 ml, tube 0.2 ul, tip putih, tip kuning, tip biru, ethidium bromide. Bahan yang digunakan untuk anatomi stomata antara lain alkohol 70%, asam nitrat (HNO3) 40%, NaOCl, Safranin, Glyserin 20%, aquades, dan gelas objek.

Peralatan yang digunakan adalah water bath, mortar, gunting, mikropipet, tube rak, vortex, sentrifuge, UV spektofotometer, Polymerase Chain Reaction

(PCR) merk Applied Biosystem 2720 thermal cycler, elektroforesis merk Mupid, UV transiluminator, kamera digital dan canon power shoot A480, oven, mikroskop, pinset, mikrometer, dan colour chart Royal Horticultural Society fifth edition.

Metode

Penanda Morfologi Tanaman

Pengamatan morfologi tanaman meliputi karakter daun, bunga, buah, getah dan biji seperti pada Tabel 2 yang mengacu pada IPGRI (2003) pada Lampiran 4.

Tabel 2. Karakter pengamatan morfologi pada G. mangostana dan kerabatnya

Organ No Karakter Keterangan

Daun 1. warna daun muda (hijau muda, hijau muda kecoklatan, coklat merah)

pengamatan pada daun muda berumur dua minggu setelah

flushatau pecah tunas

2. warna daun tua (hijau, hijau tua) pengamatan pada daun dewasa dan tumbuh sempurna

3. bentuk daun (elips, oblong) pengamatan pada daun dewasa dan tumbuh sempurna

4. bentuk ujung daun (acute, acuminate, obtuse, retuse)

pengamatan pada daun dewasa dan tumbuh sempurna

5. jumlah bunga per kelompok (satu, dua, lebih dari tiga)

(35)

Tabel 2. Karakter pengamatan morfologi pada G. mangostana dan kerabatnya (lanjutan)

Organ No Karakter Keterangan

Bunga 6. jumlah mahkota (empat, lima) pengamatan pada saat antesis, yaitu bunga mekar dan ditandai terdapatnya nektar pada permukaan kepala putik

7. warna mahkota (kuning, kuning kehijauan, putih, merah muda, hijau kekuningan, kuning dengan tepi merah)

pengamatan pada saat antesis, yaitu bunga mekar dan ditandai terdapatnya nektar pada permukaan kepala putik

8. warna kelopak (hijau, putih) pengamatan pada saat antesis, yaitu bunga mekar dan ditandai terdapatnya nektar pada permukaan kepala putik

9. warna tangkai bunga (hijau, putih) pengamatan pada saat antesis, yaitu bunga mekar dan ditandai terdapatnya nektar pada permukaan kepala putik

10. ukuran bunga (kecil diameter < 3 cm, sedang diameter 3 cm, besar diameter > 3 cm)

11. posisi bunga (diujung, dibuku, diujung dan dibuku)

12. jumlah kelopak bunga (empat, lima)

Buah 13. jumlah buah per kelompok (satu, dua, tiga)

pengamatan pada buah matang (berumur 4 bulan)

14. posisi buah (diujung, dibuku) pengamatan pada buah matang 15. bentuk buah (bulat, gepeng,

lonjong)

pengamatan pada buah matang 16. warna stigmalobe (coklat, coklat

tua, merah)

pengamatan pada buah matang 17. ketebalan kulit (tipis, sedang,

tebal)

(36)

Tabel 2. Karakter pengamatan morfologi pada G. mangostana dan kerabatnya (lanjutan)

Organ No Karakter Keterangan

Buah 18. warna buah matang (ungu, merah, hijau, kuning, merah kekuningan)

pengamatan pada buah matang

19. memiliki kelopak buah (ada kelopak buah, tidak ada kelopak buah)

20. penonjolan ujung buah (ujung buah memanjang, ujung buah tidak memanjang)

21. warna aril (putih, putih kekuningan, kuning, tidak ada aril)

22. jumlah aril (empat, enam, tujuh, delapan)

Biji 23. bentuk biji (reniform, bulat) pengamatan pada biji dewasa 24. warna kulit biji (coklat muda,

coklat, coklat tua)

pengamatan pada biji dewasa

Getah 25. warna getah pada batang

(putih, kuning)

pengamatan pada batang muda

Stomata 26. rasio lebar terhadap panjang stomata (kecil, sedang, besar)

pengamatan pada daun dewasa dan tumbuh sempurna 27. bentuk sel epidermis di

permukaan atas daun (berlekuk dalam, berlekuk dangkal, rata)

28. bentuk sel epidermis di permukaan bawah daun (berlekuk dalam, berlekuk dangkal, rata)

29. keberadaan stomata di permukaan atas dan bawah daun (ada stomata, tidak ada stomata)

(37)

Pengamatan stomata dilakukan dengan membuat sayatan paradermal menggunakan modifikasi metode utuh (whole mount) yang diwarnai dengan 1% safranin (Sass 1958). Tahapan preparat antara lain : daun difiksasi dalam 70% alkohol, kemudian dicuci dengan aquades, selanjutnya direndam dalam larutan 20% HNO3 selama 3-4 jam agar lapisan epidermis dapat dengan mudah dilepaskan dari jaringan mesofil. Lapisan epidermis tersebut direndam dalam 1% safranin selama 5 menit, setelah diwarnai diletakkan pada gelas objek dengan ditambahkan medium gliserin, kemudian ditutup dengan gelas penutup. Preparat diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 400x dan difoto menggunakan kamera digital canon power shoot A480 pada perbesaran lensa 3.3x megafixel. Karakter yang diamati adalah (1) tipe stomata, (2) panjang stomata, (3) diameter stomata, (4) bentuk sel epidermis permukaan atas dauan, (5) bentuk sel epidermis permukaan bawah daun dan (6) keberadaan stomata di permukaan atas maupun bawah permukaan daun. Data panjang dan diameter stomata merupakan nilai rata-rata dari pengukuran 5 ulangan bidang pandang yang dipilih secara acak. Setiap satu ulangan bidang pandang terdiri dari 4 buah stomata yang diamati yaitu 2 buah yang berukuran terbesar dan 2 buah yang berukuran terkecil.

Penanda Molekuler ISSR

Isolasi DNA

Analisis molekuler diawali dengan isolasi DNA dengan menggunakan metode CTAB Doyle dan Doyle 1987 yang sudah dimodifikasi (Drabkoba et al.

2002). Sampel daun dari masing-masing bahan tanaman dihancurkan dengan menggunakan mortar yang di dalamnya ditambahkan buffer ekstrak, kemudian diinkubasi dalam waterbath pada suhu 65 0C selama 20 menit. Setelah inkubasi, ditambahkan larutan kloroform isoamyl alkohol/CIAA (24:1) sebanyak 1 kali volume kemudian divortex selama 1 menit hingga larutan tercampur.

(38)

isopropanol sebanyak 1x volume. Larutan DNA tersebut disentrifuse kembali dan larutan di buang hingga pellet DNA tertinggal diujung tube, kemudian ditambahkan akohol 70% sebanyak 100 µl dan disentrifuge kembali. Alkohol dibuang dan pellet DNA dikeringkan dengan cara tube dibalik disimpan dalam desikator sampai pellet DNA mengering. Pelet DNA yang kering ditambahkan air bebas ion sebanyak 10 µl dan dijadikan sebagai stok DNA.

Uji kualitas DNA total dilakukan dengan menggunakan larutan agarose 0.8% dan dielektroforesis dalam larutan buffer TAE 1x yang dialirkan arus listrik dari muatan negatif menuju muatan positif selama selama 50 menit pada voltage 50 volt. Konsentrasi DNA total dapat diperkirakan berdasarkan hasil elektroforesis yaitu dengan cara membandingkan DNA total dengan lamda DNA. Lamda DNA yang digunakan produk merk promega. Lamda yang digunakan untuk mengecek konsentrasi DNA total dibutuhkan sebanyak 1µl dan diisikan pada lubang sumur pertama pada agarose. Konsentrasi Lamda DNA dalam 1 ul adalah 457 µg/ml. Volume DNA total untuk tes kualitas DNA digunakan sebanyak 5 µl, sehingga untuk setiap 1 µl DNA setara dengan 91.4 ng/µl. Kebutuhan DNA untuk tahapan PCR sebanyak 10 ng, maka DNA total diencerkan konsentrasinya menjadi 5x. Pewarnaan dengan cara perendaman gel agarose di dalam larutan EtBr 1% selama 10 menit, kemudian didokumentasikan dengan menggunakan kamera digital canon power shoot A480 pada penyinaran uv transilluminator. Elektroforesis ditujukan untuk pengecekan kualitas DNA total dan produk PCR.

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Polymerase Chain Reaction (PCR) dilakukan dengan alat PCR merk

Applied Biosystem 2720 thermal cycler. Primer yang digunakan adalah primer

(39)

Tabel 3. Nama dan susunan basa primer koleksi PKBT-IPB

No Nama Primer

Susunan Basa

Suhu Annealing

No Nama Primer

Susunan Basa

Suhu Annealing

1 PKBT 2 (AC)8 TT 53 0C 7 PKBT 11 (GT)9 C 54 0C 2 PKBT 3 (AG)8 T 53 0C 8 ISSRED 20 (TCC) 5A 48 0C 3 PKBT 4 (AG)8 AA 53 0C 9 ISSRED 23 (CT) 8T 48 0C 4 PKBT 6 (AG)8TT 53 0C 10 ISSRED 17 (GAC) 5 48 0C 5 PKBT 8 (GA)9 C 54 0C 11 ISSRED 12 (AGAC) 4 36 0C 6 PKBT 9 (GA)9T 54 0C 12 ISSRED 18 (GGAT) 4 48 0C

Komposisi PCR yang digunakan dalam proses PCR meliputi DNA stok, primer ISSR, PCR mix go tag green master Promega dan air bebas ion. Komposisi PCR meliputi : DNA 10 ng/µl, primer 10 pmol/µl, PCR mix 12.5 µl, kemudian ditambahkan air bebas ion hingga mencapai volume 25 µl. Tahapan PCR meliputi pre heat, denaturation, annealing, extention, dan pendinginan suhu. Tahapan, penggunaan proses PCR terdapat pada Tabel 4.

Tabel 4. Suhu yang digunakan pada proses Polymerase Chain Reaction

(PCR)

Tahapan Suhu Waktu

Heat 940 C 4 menit

Denaturasi 940 C 30 detik Annealing 360 C-530C 30 detik

Extension 720 C 1 menit

Penurunan 720 C 5 menit

Pendinginan 40 C sampai tak terhingga

Siklus PCR 35 siklus

Pengamatan Penanda Morfologi dan Molekuler

(40)

Tabel 5. Asumsi kesetaraan pengamatan peubah dan lokus pada pengamatan penanda morfologi dan molekuler

Penanda Morfologi Penanda Molekuler

Peubah karakter primer

Lokus sub karakter pita

Peubah yang diamati pada penanda morfologi dinyatakan sebagai karakter. Setiap karakter morfologi terdiri dari beberapa sub karakter yang setara dengan lokus. Peubah yang diamati pada penanda morfologi terdapat pada Tabel 6.

Tabel 6. Pengamatan parameter dan lokus pada penanda morfologi

No Parameter penanda

morfologi/ karakter

Lokus/sub karakter penanda morfologi

1. warna daun muda hijau muda, hijau muda kecoklatan, coklat merah

2. warna daun tua hijau, hijau tua 3. bentuk daun elips, oblong

4. bentuk ujung daun acute, acuminate, obtuse, retuse 5. jumlah bunga per

kelompok

satu, dua, lebih dari tiga 6. jumlah mahkota empat, lima

7. warna mahkota kuning, kuning kehijauan, putih, merah muda, hijau kekuningan, kuning dengan tepi merah

8. warna kelopak bunga hijau, putih 9. warna tangkai bunga hijau, putih

10. ukuran bunga kecil diameter < 3 cm, sedang diameter 3 cm, besar diameter > 3 cm

11. posisi bunga diujung, dibuku, diujung dan dibuku 12. jumlah kelopak bunga empat, lima

13. jumlah buah per kelompok

satu, dua, tiga

(41)

Tabel 6. Pengamatan parameter dan lokus pada penanda morfologi (lanjutan)

morfologi/ karakter

Lokus/sub karakter penanda morfologi

16. warna stigmalobe coklat, coklat tua, merah 17. ketebalan kulit tipis, sedang, tebal

18. warna buah matang ungu, merah, hijau, kuning, merah kekuningan

19. memiliki kelopak buah ada kelopak buah, tidak ada kelopak buah 20. penonjolan di ujung

buah

ujung buah memanjang, ujung buah tidak memanjang

21. warna aril putih, putih kekuningan, kuning, tidak ada aril

22. jumlah aril empat, enam, tujuh, delapan, tidak ada aril 23. bentuk biji reniform, bulat

24. warna kulit biji coklat muda, coklat, coklat tua 25. warna getah pada

batang

putih, kuning

26. rasio lebar terhadap panjang stomata

(kecil, sedang, besar)

27. bentuk sel epidermis di permukaan atas daun

(berlekuk dalam, berlekuk dangkal, rata)

28. bentuk sel epidermis di permukaan bawah daun

(berlekuk dalam, berlekuk dangkal, rata) 29. keberadaan stomata di

permukaan atas dan bawah daun

(ada stomata, tidak ada stomata)

(42)

Tabel 7. Pengamatan parameter dan lokus pada penanda molekuler.

molekuler/primer

Lokus/pita penanda molekuler

1. PKBT2 250a bp, 250b, 250c, 250d, 500a, 500b, 500c, 500d, 750a, 750b, 750c, 1000a, 1000b, 1000c, 1000d, 1500a, 1500b, 2000a, 2000b, 2500

8. ISSRED 12 250a bp, 250b, 250c, 250d, 500a, 500b, 500c, 500d, 750a, 750b, 750c, 1000a, 1000b, 1000c, 1000d, 1500a, 1500b, 2000a, 2000b, 2500

(43)

Tabel 7. Pengamatan parameter dan lokus pada penanda molekuler (lanjutan)

molekuler/primer

Lokus/pita penanda molekuler

Pengamatan Viabilitas Polen

Viabilitas polen diuji di dalam media perkecambahan 10% sukrosa, 0.005% H3BO3, 10 mM CaCl2, 0.05% KH2PO4 dan 4% PEG 6000 (Schreiber dan Dresselhaus 2003). Pengamatan dilakukan pada pembentukan polen tube. Waktu pengamatan adalah 5 jam dan 16 jam setelah dikecambahkan..

Analisis Data

Data hasil pengamatan morfologi dan molekular dianalisis dengan menggunakan program NTSYSpc (Numerical Taxonomy and Multivariate

(44)

pada program NTSYSpc versi 2.0. Tingkat keselarasan koefisien kesamaan antara penanda dibandingkan dengan menggunakan MXCOMP program NTSYSpc versi 2.0. Tingkat keselarasan pengelompokan ditentukan oleh nilai goodness of fit

yaitu kesesuaian antara nilai koefisien kemiripan (SM) dengan kriteria sangat sesuai (r > 0.9), sesuai (0.8 < r < 0.9), tidak sesuai (0.7 < r < 0.8) dan sangat tidak sesuai (r < 0.7).

(45)

HASIL DAN PEMBAHASAN

Keberagaman Karakter Morfologi

Keberagaman morfologi bentuk, warna, tipe maupun ukuran, diperoleh berdasarkan hasil pengamatan langsung pada karakter warna bunga, warna daun muda, bentuk buah, warna buah matang, dan warna aril (Gambar 3).

Gambar 3. Hasil pengamatan morfologi karakter warna daun muda (1), warna daun tua (2), warna mahkota bunga (3), warna buah matang (4), warna aril (5), warna kulit biji (6) dan warna getah dibatang (7)

pada G. hombroniana (A), G. malaccensis (B), G. mangostana (C),

G. celebica (D), G. porrecta (E), G. forbesii (F), G. subelliptica (G) dan C. inophyllum (H).

A

B

C

D

E

F

G

H

5 6 7

4 3

(46)

(47)

Analisis Penanda Morfologi

Keragaman morfologi dapat diamati pada (1) tingkat kultivar sesama

G. mangostana, (2) antar species yaitu G. mangostana dengan G. malaccensis, G. hombroniana, G. celebica, G. porrecta, G. forbessi dan G. subelliptica dan (3)

antar genus seperti G. mangostana dengan C. inophyllum. Parameter atau peubah yang diamati pada penanda morfologi sebanyak 29 karakter meliputi bentuk, ukuran, tipe dan warna pada daun, bunga, buah, getah, biji dan stomata. Parameter morfologi yang dapat diamati, diasumsikan setara dengan jenis primer pada penanda molekuler, sedangkan lokus sub karakter setara dengan lokus pita pada penanda molekuler. Hasil pengamatan morfologi pada G. mangostana dan kerabat dekatnya dari 29 peubah yang diamati, diperoleh 83 karakter pembeda. Jumlah karakter polimorfik mencapai 100% yaitu 83 karakter/lokus (Tabel 8).

Tabel 8. Rekapitulasi karakter polimorfik penanda morfologi pada

G. mangostana dan kerabatnya

No Parameter Penanda

Morfologi

Jumlah sub karakter

Sub karakter yang berbeda

Jumlah karakter polimorfik

1. warna daun muda 3 3 3

2. _{warna daun tua} 2 2 2

3. _{bentuk daun} _{2 2} ₂

4. _{bentuk ujung daun} _{4 4} ₄

5. jumlah bunga per kelompok

3 3 3

6. jumlah mahkota 2 2 2

7. _{warna mahkota} 6 6 6

8. _{warna kelopak} _{2 2} ₂

9. warna tangkai bunga 2 2 2

10. ukuran bunga 2 2 2

11. posisi bunga 3 3 3

12. jumlah kelopak bunga

2 2 2

13. jumlah buah per kelompok

3 3 3

(48)

Tabel 8. Rekapitulasi karakter polimorfik penanda morfologi pada

G. mangostana dan kerabatnya (lanjutan)

No Parameter Penanda

Morfologi

Jumlah sub karakter

Sub karakter yang berbeda

Jumlah karakter polimorfik

15. bentuk buah 3 3 3

16. warna stigmalobe 3 3 3

17. ketebalan kulit 3 3 3

18. warna buah matang 5 5 5

19. memiliki kelopak buah 2 2 2

20. penonjolan ujung buah 2 2 2

21. warna aril 4 4 4

22. jumlah aril 5 5 5

23. bentuk biji 2 2 2

24. warna kulit biji 3 3 3

25. warna getah pada batang

2 2 2

26. rasio lebar terhadap panjang stomata

3 3 3

27. bentuk sel epidermis di permukaan atas daun

3 3 3

28. bentuk sel epidermis di permukaan bawah daun

3 3 3

29. keberadaan stomata di permukaan atas dan bawah daun

2 2 2

Jumlah 83 83 83 (100%)

Berdasarkan hasil analisis dengan menggunakan program NTSYS, diperoleh dendrogram pengelompokan aksesi sebanyak 4 kelompok pada koefisien kemiripan 0.67 yaitu (1) kelompok A meliputi G. hombroniana dan

(49)

menggambarkan pengelompokan antara (1) species yang termasuk ke dalam sub genus Garcinia, (2) membedakan kelompok sub genus Garcinia dengan sub genus Xanthocymus dan (3) inter genus yaitu membedakan genus Garcinia dan genus Calophyllum.

Menurut Jones (1980) genus Garcinia diklasifikasikan menjadi 14 sub genus yaitu Garcinia, Rheediopsis, Teracentrum, Rheedia, Macrostigma, Tetraphalangium, Tripetalum, Brindonia, Mungotia, Hebradendron, Xanthocymus, Paragarcinia, Discostigma dan Tagmanthera. Berdasarkan klasifikasi dari Jones (1980), G. subelliptica masuk ke dalam sub genus ke XI yaitu Xanthocymus, sehingga hasil dendrogram tepat membentuk kelompok yang memisahkan antara kelompok sub genus Garcinia dengan kelompok sub genus

Xanthocymus.

Gambar 5. Dendrogram analisis karakter morfologi G. mangostana dan kerabat dekatnya membentuk 4 kelompok pada koefisien kemiripan 0.67

Berdasarkan pengelompokan tersebut G. mangostana mengelompok dengan G. malaccensis pada koefisien kemiripan 0.88. Hal tersebut sejalan dengan hipotesa Richards (1990b) yang menyatakan tetua G. mangostana adalah

G. malaccensis, tetapi pada kelompok A terdapat aksesi lainnya yaitu G. celebica,

A

0.45 0.59 0.73 0.86 1.00

(50)

tampak lebih dekat mengelompok pada koefisien kemiripan sebesar 0.75 (Tabel 9) dibandingkan dengan letak kelompok G. hombroniana terhadap G. mangostana.

Tabel 9. Koefisien kemiripan G. mangostana dengan kerabat dekatnya pada penanda morfologi

Aksesi Nilai koefisien

kemiripan

G. malaccensis vs G. mangostana 0.88

G. celebica vs G. mangostana 0.75

G. hombroniana vs G. mangostana 0.72

G. porrecta vs G. mangostana 0.68

G. forbesii vs G. mangostana 0.64

G. subelliptica vs G. mangostana 0.59

C. inophyllum vs G. mangostana 0.45

Karakter yang menentukan terbentuknya pengelompokan dapat dianalisis pada nilai Analisis Komponen Utama. Analisis Komponen Utama (AKU/Principal Component Analysis) digunakan untuk (1) identifikasi peubah baru yang mendasari data peubah ganda, (2) mengurangi banyaknya dimensi peubah yang banyak dan berkorelasi menjadi peubah baru yang tidak berkorelasi dengan mempertahankan keragaman pada himpunan data dan (3) menghilangkan peubah asal yang mempunyai sumbangan informasi yang relatif kecil. Banyaknya komponen utama yang dipilih yaitu apabila persentase keragaman kumulatif minimum 70% (Supranto 2004). Hasil analisis komponen utama pada penanda morfologi dapat dijelaskan oleh 3 komponen utama yang mencakup hanya 72% data dari total keseluruhan data (Tabel 10).

Tabel 10. Nilai analisis komponen utama pada karakter morfologi

PC1 PC2 PC3

Eigenvalue/akar ciri 3.6310 2.3908 1.2541

Proportion 0.360 0.237 0.124

Cumulative 0.36 0.59 0.72

(51)

Jumlah karakter penentu pembentuk pengelompokan terpilih adalah selaras dengan nilai akar ciri yaitu 4 karakter pada komponen utama/PC1, 2 karakter pada PC3 dan 1 karakter pada PC3 (Tabel 11).

Tabel 11. Karakter morfologi pembentuk komponen utama

Komponen utama

Jumlah

karakter Jenis karakter Nilai

PC1 4 warna aril putih 0.251

ketebalan kulit buah sedang 0.246

ukuran bunga sedang -0.246

warna mahkota bunga kuning kehijauan -0.240 PC2 2 warna daun muda hijau muda 0.230

posisi buah dibuku 0.230

PC3 1 bentuk buah lonjong 0240

Karakter pembentuk komponen utama yaitu warna aril putih, ketebalan kulit buah sedang, ukuran buah sedang, warna mahkota bunga kuning kehijauan, warna daun muda hijau muda, posisi buah di buku dan bentuk buah lonjong. Karakter warna aril putih pada G. mangostana, G. malaccensis dan G. forbesii, ukuran bunga sedang yaitu G. celebica, G. porrecta dan C. inophyllum, warna

mahkota bunga kuning kehijauan pada G. hombroniana, G. celebica dan

G. porrecta, warna daun hijau pada G. subelliptica dan C. inophyllum, posisi buah di buku/disamping seperti G. forbesii dan G. subelliptica, bentuk buah lonjong pada G. malaccensis dan G. porrecta.

Berdasarkan hasil analisis komponen utama terbentuk 6 kelompok yaitu (1) kelompok A meliputi G. hombroniana dan G. celebica, (2) kelompok B

meliputi G. malaccensis dan G. mangostana, (3) kelompok C meliputi

G. porrecta, (4) kelompok D meliputi G. forbesii, (5) kelompok E meliputi

G. subelliptica dan (6) kelompok F meliputi C. inophyllum (Gambar 6).

(52)

yaitu kelompok A meliputi G. hombroniana dan G. celebica, kelompok B meliputi G. malaccensis dan G. mangostana, kelompok C meliputi G. porrecta,

kelompok D meliputi G. forbesii, kelompok E meliputi G. subelliptica dan kelompok F meliputi C. inophyllum.

Gambar 6. Analisis komponen utama dalam dua dimensi pada karakter morfologi G. mangostana dan kerabatnya dengan

membentuk 6 kelompok yaitu kelompok A meliputi

G. hombroniana dan G. celebica, kelompok B meliputi

G. malaccensis dan G. mangostana, kelompok C meliputi

G. porrecta, kelompok D meliputi G. forbesii, kelompok E

meliputi G. subelliptica dan kelompok F meliputi

C. inophyllum.

Analisis Penanda Molekuler

Primer yang digunakan untuk analisis hubungan kekerabatan

G. mangostana adalah sebanyak 12 primer, tetapi primer yang mampu menunjukan pola polimorfik adalah sebanyak 11 primer yaitu PKBT2, PKBT3, PKBT4, PKBT8, PKBT9, PKBT 11, ISSRED 12, ISSRED 17, ISSRED 18,

ISSRED 20, dan ISSRED 23. Amplifikasi primer terhadap 19 aksesi

G. mangostana dan kerabat dekatnya menghasilkan 130 pita yang terdiri dari pola pita polimorfik sebanyak 129 pita atau sebesar 99.23% dan pita monomorfik sebanyak 1 pita atau sebesar 0.77% (Tabel 12). Keberagaman pola pita dari 11 primer menunjukan keberagaman yang tinggi hingga mencapai 99.23% yang terlihat dari nilai pola pita polimorfik yang dihasilkan, sedangkan pola pita

(53)

monomorfik hanya terbentuk 1 pita mencapai 0.77% (Tabel 12) yaitu PKBT2 pada ukuran 400 bp. Primer ISSRED12 dengan susunan basa (AGAC)4 mampu menghasilkan jumlah pita terbanyak yaitu 15 pita polimorfik, sedangkan primer yang menghasilkan pola pita polimorfik sedikit adalah primer PKBT3 dengan susunan basa (AG)8T dan ISSRED 20 dengan susunan basa (TCC)5A, masing-masing terbentuk 9 pita.

Tabel 12. Rekapitulasi jumlah amplifikasi pita DNA G. mangostana dan kerabat dekatnya pada 11 primer ISSR

No Primer Jumlah pita Jumlah pita

polimorfik

Jumlah pita monorfik

1 PKBT2 13 12 1

2 PKBT3 9 9 0

3 PKBT4 _{11 11 0}

4 PKBT8 _{10 10 0}

5 PKBT9 _{12 12 0}

6 PKBT11 10 10 0

7 ISSRED12 _{15 15 0}

8 ISSRED17 _{14 14 0}

9 ISSRED18 _{13 13 0}

10 ISSRED20 9 9 0

11 ISSRED23 14 14 0

Total 130 129 (99.23%) 1 (0.77%)

Analisis penanda molekuler DNA diperlukan untuk mengevaluasi/ menganalisis keragaman genetik dan hubungan kekerabatan antara populasi, spesies maupun individu yang berbeda, karena marka molekuler lebih menunjukan pola perubahan evolusi jika dibandingkan dengan karakter morfologi atau fisiologi. Berdasarkan hasil analisis data biner skor pita DNA dengan menggunakan program NTSYS, diperoleh 3 kelompok pada koefisien kemiripan 0.47 yaitu (1) kelompok A meliputi G. hombroniana, G. celebica, G. malaccensis,

G. mangostana, G. porrecta, (2) kelompok B meliputi G. forbesii, dan

(54)

Matrik korelasi (r) pada penanda molekuler sebesar 0.98602 artinya pengelompokan tersebut sangat sesuai menggambarkan pengelompokan (1) species yang termasuk ke dalam sub genus Garcinia, (2) memisahkan kelompok species yang termasuk ke dalam sub genus Garcinia dengan sub genus

Xanthocymus dan (3) memisahkan kelompok genus Garcinia dengan genus

Calophyllum. Kesesuaian pengelompokan dapat diartikan bahwa setiap species

tepat mengelompok misalnya G. mangostana tepat mengelompok dengan

G. mangostana, tidak ada yang mengelompok dengan C. inophyllum.

Gambar 7. Dendrogram analisis karakter molekuler (DNA) pada

G. mangostana dan kerabat dekatnya. Terbentuk 3 kelompok pada nilai koefisien kemiripan 0.47.

Kelompok (1) species yang termasuk ke dalam sub genus Garcinia yaitu

G. mangostana, G. malaccensis, G. hombroniana, G. celebica, dan G. porrecta,

(2) species yang termasuk ke dalam sub genus Xanthocymus yaitu G. subelliptica

dan (3) kelompok out group yaitu genus Calophyllum yaitu C. inophyllum.

Berdasarkan dendrogram apabila dilihat dari nilai koefisien kemiripan 0.40, maka pengelompokan akan terbagi menjadi dua kelompok besar yang memisahkan antara genus Garcinia dengan genus Calophyllum.

A

B C

0.47

Koefisen kemiripan Coefficient

0.40 0.55 0.70 0.85 1.00