TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Bioteknologi Molekuler
Pada tahun 1981, Federasi Bioteknologi Eropa mendefinisikan bioteknologi sebagai berikut, bioteknologi adalah aplikasi terpadu biokimia,mikrobiologi, dan rekayasa kimiadengan tujuan untuk mendapatkan aplikasi teknologi dengan kapasutas biakan mikroba, sel, atau jaringan di bidang industri, kesehatan, dan pertanian. Sedangkan menurut Sardjoko (1991), boteknologi didefinisikan sebagai proses-proses biologi oleh mikroorganisme yang dimanfaatkan oleh dan untuk kepentingan manusia. Definisi bioteknologi yang lebih luas dinyatakan oleh Bul,et,al, (1982), yaitu penerapan prinsip-prinsip ilmiah dan rekayasa pengolahan bahan oleh agen-agen biologi seperti mokroorganisme, sel tumbuhan, sel hewan, manusia, dan enzim untuk menghasilkan barang dan jasa. Pada tahun 1981, Federasi Bioteknologi Eropa mendefinisikan bioteknologi sebagai berikut, bioteknologi adalah aplikasi terpadu biokimia,mikrobiologi, dan rekayasa kimiadengan tujuan untuk mendapatkan aplikasi teknologi dengan kapasutas biakan mikroba, sel, atau jaringan di bidang industri, kesehatan, dan pertanian. Sedangkan menurut Sardjoko (1991), boteknologi didefinisikan sebagai proses-proses biologi oleh mikroorganisme yang dimanfaatkan oleh dan untuk kepentingan manusia.
Definisi bioteknologi yang lebih luas dinyatakan oleh Bul,et,al, (1982), yaitu penerapan prinsip-prinsip ilmiah dan rekayasa pengolahan bahan oleh agen-agen biologi seperti mokroorganisme, sel tumbuhan, sel hewan, manusia, dan enzim untuk menghasilkan barang dan jasa.
Pada tahun 1953 ditemukan struktur DNA oleh Watson dan Crick dan tahun 1966 dipecahkannya kode-kode genetik, oleh Rossenberg serta telah diketahuinya proses transkripsi dan translasi. Sedangkan pada tahun 1970 ditemukan enzim restriksi endonuklease (enzim pemotong gen), enzim ligase (enzim penyambung gen) dan disusul pada tahun 1973 ditemukan metode DNA rekombinan atau rekayasa genetika mengawali babak baru bioteknologi modern. Bioteknologi modern dikembangkan dengan teknologhi rekayasa genetika pada agen-agen biologi tingkat molekuler. Yang menjadi sasaran bioteknologi modern dengan teknologi rekayasa genetika adalah seluruh aspek kehidupan mulai dari makanan, kedokteran, pertanian, peternakan, pertambangan dan penanggulangan pencemaran lingkungan.
2.2 Rekayasa Genetik
Rekayasa genetika adalah suatu proses manipulasi gen yang bertujuan untuk mendapatkan organisme yang unggul. Manipulasi gen dapat dilakukan dengan teknik invitro dan invivo. Di Inggris manipulasi gen diartikan sebagai pembentukan kombinasi baru materi yang dapat diturunkan dengan penyisipan (insertion) molekul-molekul asam nukleat, yang dihasilkan dengan cara apapun diluar sel, ke dalam suatu virus, plasmid bakteri atau sistem pembawa lainnya yang memungkinkan terjadinya penggabungan ke dalam organisme inang selanjutnya mampu melakukan penggandaan lagi. Teknik-teknik manipulasi gen secara invitro adalah tranformasi Escchercia coli, pemotongan dan penggabungana molekul-molekul DNA, serta pemotongan reaksi-reaksi pemotongan dan penggabungan.
Transfer DNA atau perpindahan DNA ke dalam bakteri dapat melalui tiga cara, yaitu konjugasi, transformasi, dan transduksi. DNA yang masuk ke dalam sel bakteri selanjutnya dapat berintegrasi dengan DNA atau kromosom bakteri sehingga terbentuk
kromosom rekombinan. Konjugasi merupakan perpindahan DNA dari satu sel (sel donor) ke dalam sel bakteri lainnya (sel resepien) melalui kontak fisik antara kedua sel. Sel donor memasukkan sebagian DNA-nya ke dalam sel resepien. Transfer DNA ini melalui pili seks yang dimiliki oleh sel donor. Sel resepien tidak memiliki pili seks. DNA dari sel resepie berpindah ke sel resipien secara replikatif sehingga setelah proses ini selesai, sel jantan tidak kehilangan DNA. Ke dua sel tidak mengalami peningkatan jumlah sel dan tidak dihasilkan sel anak. Oleh karena itu, proses konjugasi disebut juga sebagai proses atau mekanisme seksual yang tidak reproduktif.
Gambar 1. Proses konjugasi
Transformasi merupakan pengambilan DNA oleh bakteri dari lingkungan di sekelilingnya. DNA yang berada di sekitar bakteri (DNA asing) dapat berupa potongan DNA atau fragmen DNA yang berasal dari sel bakteri yang lain atau organisme yang lain. Masuknya DNA dari lingkungan ke dalam sel bakteri ini dapat terjadi secara alami. Pada tahun 1928 ditemukan strain bakteri yang tidak virulen dapat berubah sifatnya menjadi virulen disebabkan adanya strain yang tidak virulen dicampur dengan sel-sel bakteri strain virulen yang telah dimatikan. Tahun 1944 ditemukan bahwa perubahan sifat atau transformasi dari bakteri yang tidak virulen menjadi virulen disebabkan oleh adanya DNA dari sel bakteri strain virulen yang masuk ke dalam bakteri strain yang tidak virulen.
Gambar 3. Proses transformasi
Transduksi adalah cara pemindahan DNA dari satu sel ke dalam sel lainnya melalui perantaraan bakteriofage. Beberapa jenis virus berkembang biak di dalam sel bakteri. Virus-virus yang inangnya adalah bakteri sering disebut bakteriofag atau fage. Ketika virus menginfeksi bakteri, fage memasukkan DNA-nya ke dalam sel bakteri. DNA tersebut kemudian akan bereplikasi di dalam sel bakteri atau berintegrasi dengan kromosom baketri. DNA fage yang dikemas ketika membentuk partikel fage baru akan membawa sebagian DNA bakteri yang menjadi inangnya. Selanjutnya jika fage tersebut menginfeksi bakteri yang lain, maka fage akan memasukkan DNAnya yang sebagian mengandung DNA sel inang sebelumnya. Jadi,
secara alami fage memindahkan DNA dari satu sle bakteri ke bakteri yang lain. Transduksi adalah cara pemindahan DNA dari satu sel ke dalam sel lainnya melalui perantaraan bakteriofage. Beberapa jenis virus berkembang biak di dalam sel bakteri. Virus-virus yang inangnya adalah bakteri sering disebut bakteriofag atau fage. Ketika virus menginfeksi bakteri, fage memasukkan DNA-nya ke dalam sel bakteri. DNA tersebut kemudian akan bereplikasi di dalam sel bakteri atau berintegrasi dengan kromosom baketri. DNA fage yang dikemas ketika membentuk partikel fage baru akan membawa sebagian DNA bakteri yang menjadi inangnya. Selanjutnya jika fage tersebut menginfeksi bakteri yang lain, maka fage akan memasukkan DNAnya yang sebagian mengandung DNA sel inang sebelumnya. Jadi, secara alami fage memindahkan DNA dari satu sle bakteri ke bakteri yang lain.
Adapun perangkat yang digunakan dalam teknik DNA rekombinan diantaranya enzim restriksi untuk memotong DNA, enzim ligase untuk menyambung DNA dan vektor untuk menyambung dan mengklonkan gen di dalam sel hidup, transposon sebagai alat untuk melakukan mutagenesis dan untuk menyisipkan penanda, pustaka genom untuk menyimpan gen atau fragmen DNA yang telah diklonkan, enzim transkripsi balik untuk membuat DNA berdasarkan RNA, pelacak DNA atau RNA untuk mendeteksi gen atau fragmen DNA yang diinginkan atau untuk mendeteksi klon yang benar. Vektor yang sering digunakan diantarnya plasmid, kosmid dan bakteriofag.
Gambar 6. Plasmid bakteri sebagai vektor
Enzim restriksi digunakan untuk memotong DNA. Enzim mengenal dan memotong DNA pada sekuens spesifik yang panjangnya empat sampai enam pasang basa. Enzim tersebut dikenal dengan nama enzim endonuklease restriksi. Berikut ini adalah macam-macam enzim endonuklease restriksi.
Tabel 1. Enzim restriksi yang sering digunakan pada proses rekombinasi DNA
Enzyme Source Recognition
Sequence Cut
EcoRI Escherichia coli 5'GAATTC
EcoRII Escherichia coli 5'CCWGG 3'GGWCC 5'--- CCWGG---3' 3'---GGWCC ---5' BamHI Bacillus Amyloliquefaciens 5'GGATCC 3'CCTAGG 5'---G GATCC--- 3' 3'---CCTAG G--- 5' HindIII Haemophilus Influenza 5'AAGCTT 3'TTCGAA 5'---A AGCTT---3' 3'---TTCGA A---5' TaqI Thermus aquaticusThermus aquaticus 5'TCGA
3'AGCT 5'---T CGA---3'3'---AGC T---5' NotI Nocardia otitidis 5'GCGGCCGC
3'CGCCGGCG 5'---GC GGCCGC---3' 3'---CGCCGG CG---5' HinfI Haemophilus Influenza 5'GGCC 3'CCGG 5'---GG CC---3' 3'---CC GG---5' Sau3A Staphylococcus aureus 5'GATC 3'CTAG 5'--- GATC---3' 3'---CTAG ---5'
PovII* Proteus vulgaris 5'CAGCTG
3'GTCGAC
5'---CAG CTG---3' 3'---GTC GAC---5' SmaI* Serratia marcescens 5'CCCGGG
3'GGGCCC 5'---CCC GGG---3' 3'---GGG CCC---5' HaeIII* Haemophilus Aegyptius 5'GGCC3'CCGG 5'---GG CC---3'3'---CC GG---5' HgaI[33] Haemophilus Gallinarum 5'GACGC3'CTGCG 5'---NN NN---3'3'---NN NN---5' AluI* Arthrobacter luteus 5'AGCT
3'TCGA
5'---AG CT---3' 3'---TC GA---5'
EcoRV* Escherichia coli 5'GATATC
3'CTATAG
5'---GAT ATC---3' 3'---CTA TAG---5'
EcoP15I Escherichia coli 5'CAGCAGN25NN
3'GTCGTCN25NN 5'-CAGCAGN25NN ---3' 3'---GTCGTCN25 KpnI[34] Klebsiella
pneumonia 5'GGTACC3'CCATGG 5'---GGTAC C---3'3'---C CATGG---5' PstI[34] Providencia stuartii 5'CTGCAG
3'GACGTC 5'---CTGCA G---3' 3'---G ACGTC---5' SacI[34] Streptomyces Achromogenes 5'GAGCTC 3'CTCGAG 5'---GAGCT C---3' 3'---C TCGAG---5' SalI[34] Streptomyces albus 5'GTCGAC
3'CAGCTG 5'---G TCGAC---3' 3'---CAGCT G---5' ScaI[34] Streptomyces Caespitosus 5'AGTACT 3'TCATGA 5'---AGT ACT---3' 3'---TCA TGA---5' SpeI Sphaerotilus natans 5'ACTAGT
3'TGATCA 5'---A CTAGT---3'3'---TGATC A---5' SphI[34] Streptomyces
StuI[35][36] Streptomyces Tubercidicus 5'AGGCCT 3'TCCGGA 5'---AGG CCT---3' 3'---TCC GGA---5' XbaI[34] Xanthomonas badrii 5'TCTAGA
3'AGATCT
5'---T CTAGA---3' 3'---AGATC T---5' Ada beberapa bagian terpenting yang selalu digunakan dalam rekayasa genetika.Yang pertama adalah enzim seluler dan yang kedua adalah vektor. Hal tersebut akan dibahas sebagai berikut:
Enzim seluler
Enzim yang dipakai oleh orang-orang bioteknologi dalam memanipulasi DNA diantaranya adalah enzim Endonuklease, yaitu enzim yang mengenali batas-batas sekuen nukleotida spesifik dan berfungsi dalam proses restriction atau pemotongan bahan-bahan genetik. Penggunaan enzim ini yang paling umum antara lain pada sekuen palindromik. Enzim ini dibentuk dari bakteri yang dibuat sedemikian rupa sehingga dapat menahan penyusupan DNA, seperti genom bacteriophage.Ada juga DNA polimerisasi, yaitu enzim yang biasa dipakai untuk meng-copy DNA. Enzim ini mengsintesis DNA dari sel induknya dan membentuk DNA yang sama persis ke sel induk barunya. Enzim ini juga bisa didapatkan dari berbagai jenis organisme, yang tidak mengherankan, karena semua organisme pasti harus meng-copy DNA mereka. Selain DNA polimerisasi, ada juga enzim RNA polimerisasi yang berfungsi untuk ’membaca’ sekuen DNA dan mengsintesis molekul RNA komplementer.
Seperti halnya DNA polimerisasi, RNA polimerisasi juga banyak ditemukan banyak organisme karena semua organisme harus ’merekam’ gennya.Selanjutnya yang akan dibahas adalah enzim DNA ligase. Enzim DNA ligase merupakan suatu enzim yang berfungsi untuk menyambungkan suatu bahan genetik dengan bahan genetik yang lain. Contohnya saja, enzim DNA ligase ini dapat bergabung dengan DNA (atau RNA) dan membentuk ikatan phosphodiester baru antara DNA (atau RNA) yang satu
dengan lainnya.Kemudian, ada pula enzim reverse transcriptases yang berfungsi membentuk blue-print dari molekul RNA membentuk cDNA (DNA komplementer). Enzim ini dibuat dari virus RNA yang mengubah genom RNA virus menjadi DNA ketika virus menginfeksi inangnya. Enzim ini biasa dipakai ketika bertemu dengan gen eukariotik yang biasanya terpisah-pisah menjadi potongan kecil dan dipisahkan oleh introns dalam kromosom.
Vektor Natural
Sebagai salah satu cara untuk memanipulasi DNA di luar sel, para ilmuwan dalam bioteknologi harus bisa membuat suatu tempat yang keadaannya stabil dan cocok dengan tempat DNA yang dimanipulasi. Sekali lagi, alam telah memberikan solusi dari masalah ini. Vektor disini bisa diartikan sebagai alat yang membawa DNA ke dalam sel induk barunya. Agar suatu metode dalam rekayasa genetika dianggap berhasil, di dalam vektor, DNA hasil rekombinan seharusnya benar-benar hanya dibawa setelah sebelumnya DNA rekombinan digabungkan dengan DNA vektor melalui enzim ligase. Namun di dalam vektor, DNA rekombinan tidak termutasi lagi membentuk DNA dengan sifat baru. Contoh dari vektor natural dari alam adalah plasmid dan virus atau bacteriophage.
Manfaat teknologi rekombinan DNA
Aplikasi teknik DNA rekombinan dalam bioteknologi diantaranya adalah produksi vaksin, insulin, antibodi dan sebagainya. Misalkan saja insulin yang digunakan untuk mengatasi diabetes diproduksi dengan menggunakan teknik DNA rekombinan. Gen insulin yang berasal dari sapi kemudian ditentukan urutan DNA-nya setelah itu direkombinasikan di dalam suatu vektor misal plasmid kemu dian dimasukan dalam sel bakteri. Selanjutnya bakteri ini mengalami transformasi dan bisa menghasilkan
insulin. Ini adalah salah satu contoh aplikasi teknik DNA rekombinan dalam bioteknologi. Beberapa produk DNA rekombinan yang digunakan dalam terapi manusia, diantaranya :
Insulin untuk penderita diabetes
Faktor VIII untuk laki-laki menderita hemofilia a Faktor IX untuk hemofilia b
Hormon pertumbuhan manusia (hgh)
Erythropoietin (epo) untuk mengobati anemia Beberapa jenis interferon
Beberapa interleukin
Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (gm-csf) untuk menstimulasi sumsum tulang setelah transplantasi sumsum tulang
Granulocyte koloni-stimulating factor (g-csf) untuk merangsang neutrofil produksi, misalnya, setelah kemoterapi dan untuk memobilisasi sel induk hematopoietik dari sumsum tulang ke dalam darah.
Aktivator plasminogen jaringan (tpa) untuk melarutkan gumpalan darah
Adenosin deaminase (ada) untuk mengobati beberapa bentuk severe combined immunodeficiency (scid)
Hormon paratiroid
Beberapa antibodi monoclonal
Antigen permukaan hepatitis B untuk vaksinasi terhadap virus hepatitis B
C1 inhibitor (c1inh) digunakan untuk mengobati edema angioneurotic turun-temurun. severe combined immunodeficiency (scid)
2.3 Tanaman Transgenik
Tanaman transgenik adalah merupakan aplikasi bioteknologi pada tanaman yang telah direkayasa bentuk maupun kualitasnya melalui penyisipan gen atau DNA binatang, bakteri, mikroba, atau virus untuk tujuan tertentu. Organisme transgenik adalah organisme yang mendapatkan pindahan gen dari organisme lain.
Gen yang ditransfer dapat berasal dari jenis (spesies) lain seperti bakteri, virus, hewan, atau tanaman lain. Untuk membuat suatu tanaman transgenik, pertama-tama dilakukan identifikasi atau pencarian gen yang akan menghasilkan sifat tertentu (sifat yang diinginkan). Gen yang diinginkan dapat diambil dari tanaman lain, hewan, cendawan, atau bakteri. Setelah gen yang diinginkan didapat maka dilakukan perbanyakan gen yang disebut dengan istilah kloning gen. Pada tahapan kloning gen, DNA asing akan dimasukkan ke dalam vektor kloning (agen pembawa DNA), contohnya plasmid (DNA yang digunakan untuk transfer gen).Kemudian, vektor kloning akan dimasukkan ke dalam bakteri sehingga DNA dapat diperbanyak seiring dengan perkembangbiakan bakteri tersebut. Apabila gen yang diinginkan telah diperbanyak dalam jumlah yang cukup maka akan dilakukan transfer gen asing tersebut ke dalam sel tumbuhan yang berasal dari bagian tertentu, salah satunya adalah bagian daun.
Teknologi transfer gen dibedakan menjadi dua, yaitu langsung dan tidak langsung (Herman, 1996). Contoh transfer gen secara langsung adalah penembakan eksplan gen dengan gene gun atau divortex dengan silicon carbide (karbid silikon) dan perlakuan pada protoplas tanaman dengan elektroporasi atau dengan polyethylene glycol (PEG). Sedangkan transfer gen secara tidak langsung adalah melalui vector Agrobacterium.
Transfer gen secara langsung Penembakan Partikel
Metode ini sering digunakan pada spesies jagung dan padi.Untuk melakukannya, digunakan senjata yang dapat menembakkan mikro-proyektil berkecepatan tinggi ke dalam sel tanaman. Mikro-proyektil tersebut akan mengantarkan DNA untuk masuk
ke dalam sel tanaman. Penggunaan senjata gen memberikan hasil yang bersih dan aman, meskipun ada kemungkinan terjadi kerusakan sel selama penembakan berlangsung. Teknik paling modern dalam transformasi tanaman adalah penggunaan metode penembakan partikel atau gene gun. Metode transfer gen ini dioperasikan secara fisik dengan menembakkan partikel DNA-coated langsung ke sel atau jaringan tanaman (Klein et al., 1988). Dengan cara demikian, partikel dan DNA yang ditambahkan menembus dinding sel dan membran, kemudian DNA melarut dan tersebar dalam sel secara independen. Telah didemonstrasikan bahwa teknik ini efektif untuk mentransfer gen pada bermacam-macam eksplan. Penggunaan penembakan partikel membuka peluang dan kemungkinan lebih mudah dalam memproduksi tanaman transgenik dari berbagai spesies yang sebelumnya sukar ditransformasi dengan Agrobacterium, khususnya tanaman monokotil seperti padi, jagung, dan turfgrass.
Tahap Metode Penembakan Karbid silikon
Metode transfer gen lain yang kurang umum digunakan dalam transformasi tanaman tetapi telah dilaporkan berhasil mentransformasi jagung dan turfgraas adalah penggunaan karbid silikon. Suspensi sel tanaman yang akan ditransformasi dicampur dengan serat karbid silikon dan DNA plasmid dari gen yang diinginkan dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf kemudian dilakukan pencampuran dan pemutaran dengan vortex (Kaeppler et al., 1990). Serat silicon carbide berfungsi sebagai jarum injeksi mikro (microinjection) untuk memudahkan transfer DNA ke dalam sel tanaman. Elektroporasi
Metode transfer DNA yang umum digunakan pada tanaman monokotil adalah elektroporasi dari protoplas, perlakuan poly-ethylene glycol (PEG) pada protoplas dan kombinasi antara dua perlakuan tersebut (Joersbo dan Brunstedt, 1991). PEG memudahkan presipitasi DNA dan membuat kontak lebih baik dengan protoplas, juga melindungi DNA plasmid mengalami degradasi dari enzim nuclease (Mass dan Werr, 1989). Sedangkan elektroporasi dengan perlakuan listrik voltase tinggi menyebabkan permiabilitas tinggi untuk sementara pada membran sel dengan membentuk pori-pori sehingga DNA mudah penetrasi ke dalam protoplas. Integritas membran kembali membaik seperti semula dalam beberapa detik sampai semenit setelah perlakuan listrik. Jagung dan padi telah berhasil ditransformasi melalui elektroporasi dengan efisiensi antara 0,1-1%. Kelemahan penggunaan protoplas sebagai explant untuk transformasi adalah sulitnya regenerasi dari protoplas, dan ekstra komplikasi, serta variasi somaklonal akibat panjangnya periode kultur.
Tahap elektroporasi berikutnya, yaitu dikejutkan dengan listrik tegangan tinggi melalui larutan yang mengandung protoplas. Kejutan listrik ini menyebabkan membran untuk sementara tidak stabil dengan membentuk pori-pori kecil. Melalui
pori-pori sementara ini, DNA gen donor dapat disuntikkan. DNA diinjeksikan dalam bentuk transfer plasmid yang dipindahkan ke kromosom dan menjadi satu dalam DNA tanaman. Tidak lama setelah pemberian kejutan listrik dan injeksi, sel membran terbentuk kembali. Dinding sel juga terbentuk kembali melalui proses pembalikan. Sel-sel yang baru saja diubah tersebut kemudian dikultur untuk menghasilkan jenis sel yang unik yang membentuk organisme. Sel-sel yang dihasilkan kemudian dipindahkan ke dalam lingkungan pertumbuhan biasa di mana gen baru akan diekspresikan.
Pada proses elektroporasi ini, dimana enzim khusus pendenaturasi dinding sel melepaskan dinding sel dari selnya. Kemudian sel-sel akan menjadi protoplas, yaitu sel-sel tumbuhan yang dilucut dinding selnya tetapi masih dilapisi membran selular.
Transfer gen secara tidak langsung
Dari banyak teknik transfer gen yang berkembang, teknik melalui media vektor Agrobacterium tumefaciens paling sering digunakan untuk mentransformasi tanaman dikotil. A. tumefaciens mampu mentransfer gen ke dalam genom tanaman melalui eksplan baik yang berupa potongan daun (leaf discs) atau bagian lain dari jaringan tanaman yang mempunyai potensi beregenerasi beregenerasi tinggi (Hinchee et al., 1988; Mullins et al., 1990). Gen yang ditransfer terletak pada plasmid Ti (tumor inducing). Segmen spesifik DNA plasmid Ti disebut DNA T (transfer DNA) yang berpindah dari bakteri ke inti sel tanaman dan berintegrasi ke dalam genom tanaman. Karena A. tumefaciens merupakan patogen tanaman maka Agrobacterium sebagai vektor yang digunakan untuk transformasi tanaman adalah bakteri dari jenis plasmid Ti yang dilucuti virulen-sinya (disarmed), sehingga sel ta-naman yang ditransformasi oleh Agrobacterium dan yang mampu beregenerasi akan membentuk suatu tanaman
sehat hasil rekayasa genetik. Tanaman tersebut akan menurunkan DNA T yang disarmed dan gen asing (dari sifat yang diinginkan) ke keturunannya. Teknik transformasi melalui media vector Agrobacterium pada tanaman dikotil telah berhasil tetapi sebaliknya tidak umum digunakan pada tanaman monokotil. Meskipun demikian, beberapa peneliti melaporkan bahwa beberapa strain Agrobacterium berhasil mentransformasi tanaman monokotil seperti jagung dan padi.
Ti Plasmid adalah vektor alamiah yang digunakan untuk mentransfer DNA ke dalam sel tanaman. Bakteri yang membawa plasmid Ti (contohnya Agrobacterium tumefaciens) dapat menyebabkan tumor pada tanaman yang disebut crown gall, terutama tanaman dikotil. Pada sebagian besar plasmid Ti, terdapat lima kompleks gen, yaitu T-DNA (bagian yang ditransfer dan menyatu dengan genom tanaman), gen virulen (vir) yang terdiri dari 50 kilo basa untuk mengatur proses transfer T-DNA ke dalam DNA tanaman, gen tra/trb yang mengatur perpindahan plasmid Ti antarbakteri, bagian yang mengatur sistem replikasi plasmid, dan bagian gen yang menyandikan molekul opin. Molekul opin ini akan dihasilkan oleh jaringan tanaman yang terinfeksi bakteri pembawa Ti plasmid . Ti Plasmid dapat digunakan dalam pembuatan Tanaman Transgenik berikut ini tahapan pembuatan tanaman transgenik :
1) Melakukan skuensing pada DNA untuk gen yang akan diubah diidentifikasi dan diperoleh dari organisme donor (bakteri). Skuensing ini dapat dilakukan dengan mengacu pada informasi yang diketahui berkaitan dengan urutan dari gen yang akan dipilih. Selanjutnya diikuti dengan pemindahan gen dari organisme donor. Gen yang diinginkan dikeluarkan dari organisme donor melalui penggunaan enzim spesifik yang dikenal sebagai enzim restriksi. 2) Gen yang diinginkan kemudian dipolimer melalaui polimerase chain
reaction (PCR), yaitu metode untuk memperkuat DNA dan menghasilkan sejumlah gen yang bisa diterapkan.
3) Setelah diperoleh, ada beberapa cara untuk mentransfer gen donor ke dalam sel organisme target. Pada beras, digunakan proses yang lebih canggih.
Metode Transfer Gen melalui Bakteri
1. Ekstraksi DNA dari plasmid Agrobacterium tumafaciens menggunakan teknik PCR (polymerase chain reaction). Pemotongan dan penggabungan/penyisipan DNA yang dipilih melibatkan enzim restriksi dan ligase.
2. Pengklonan gen oleh bacteria vektor sehingga dihasilkan DNA yang diharapkan kemudian klon gen Agrobacterium tumafaciens diintroduksi/ditransformasi ke dalam kultur sel tumbuhan.
3. Multifikasi dan regenerasi bagian-bagian tumbuhan sehingga terbentuk tumbuhan dengan sifat yang baru berikut gambar lain yang bisa mendukung pemahaman tahapan pembentukan tanaman transgenik.
Bakteri dan Proses Perakitan Tanaman Transgenik secara Lengkap 2.4 Gen Ketahanan terhadap Serangga Hama
Gen ketahanan terhadap serangga hama dan sumbernya disajikan pada Tabel 1. Sebagian dari gen tersebut akan diuraikan dalam makalah ini dengan fokus uraian ke gen Bt. Sebagian besar penelitian transformasi untuk memproduksi tanaman tahan serangga difokus-kan pada protein yang mengan-dung kode gen tunggal, seperti Bt