TINJAUAN PUSTAKA
2. Titer antibodi dengan ELISA
Enzyme Linked Immunosorbent Assay atau ELISA / EIA menurut Texas Department of State Health Sevices dibagi menjadi 2 tipe, yaitu ELISA yang digunakan untuk mendeteksi antigen dan ELISA yang digunakan untuk mendeteksi antibodi. ELISA yang digunakan untuk mendeteksi antibodi dibagi menjadi 2 metode, yaitu kompetitif dan nonkompetitif. Walaupun memiliki kesamaan prinsip, yaitu ikatan antara antigen dan antibodi, tetapi keduanya memiliki perbedaan prosedur. Berikut ini adalah perbedaan antara ELISA kompetitif dan non kompetitif .
11 Disebut juga blocking ELISA.Burgess(1995) mengatakan bahwa ELISA kompetitif memerlukan antigen untuk berikatan langsung dengan antibodi spesifik. Antibodi yang terikat kemudian akan berkompetisi dengan antibodi lain yang terikat dengan plate yang ditempeli dengan antigen. Antibodi yang akan dicari kemudian dapat dilabel dengan anti-spesiesnya supaya bisa dideteksi. 2. ELISA Non kompetitif
Pada ELISA non kompetitif molekul yang dideteksi harus memiliki 2 sisi yang bisa berikatan pada waktu yang bersamaan. Sampel yang diuji ditambahkan pada lubang plate kemudian ditambahkan enzim yang dilabel dengan antibodi (disebut konjugat).
Ho Parket al.(2009) telah melakukan penelitian tentang perbandingan kerja vaksin IBD melawan virus VVIBD dan menyajikan data berupa berat badan, lesi bursa dan perbandingan titer antibodi IBD.Data titer diukur sebelum dan sesudah diberi tantangan virus.Marti’nez-Torrecuadrada et al.(2000) juga telah melakukan penelitian dengan membandingkan beberapa antigen dan kit ELISA komersial. Beberapa antigen/kit tersebut adalah VPX, VP3, Idexx dan KPL.Level antibodi yang biasanya diukur dengan ELISA merupakan informasi yang sangat berguna untuk beberapa hal. Pertama adalah mengevaluasi keberhasilan vaksin, kedua mengidentifikasi adanya kemungkinan infeksi dari patogen lingkungan serta melihat strategi vaksinasi yang optimum (Saif, 2003).Ayam akanmeningkat level antibodinya jika terkena patogen dari lingkungan atau dengan dilakukan active-immunity, yaitu dengan vaksinasi. Peningkatan level antibodi ini memerlukan waktu beberapa minggu, sehingga pengukuran antibodi harus mempertimbangkan waktu pasca vaksinasi atau pasca infeksi.
Adanya level tertentu dari antibodi memberikan fungsi proteksi pada ayam, terutama jika ada patogen lingkungan yang homolog menginfeksi. Oleh karena itu jika vaksinasi telah diberikan dan target titer hasil vaksinasi telah tercapai namun masih terjadi outbreak maka dapat dikatakan bahwa ada kegagalan vaksinasi. Hal inilah yang seringkali terjadi pada infeksi IBD strain varian, dimana antibodi telah cukup protektif untuk strain IBD klasik, tetapi masih bisa terjadi outbreak IBD, yaitu IBD strain varian.
12
Proteksi terhadap patogen merupakan peranan antibodi dalam sistem imun.Imunoglobulin atau antibodi merupakan produk yang disekresikan oleh sel B. Antibodi ada di beberapa cairan tubuh tetapi bisa cepat dideteksi dari serum darah. Ada 3 mekanisme bagaimana antibodi berperan dalam pertahanan tubuh terhadap patogen, yaitu :
a. Neutralization : antibodi berikatan dengan patogen dan menetralisir spesifik patogen atau partikel virus, sehingga menghambat penempelan virus pada permukaan organ/sel target dan mencegah replikasi virus. b. Opsonization: patogen bakteri ditempeli oleh antibodi, sehingga bisa
dirusak oleh sel fagosit.
c. Complement activation : antibodi berikatan dengan permukaan patogen sehingga bisa mengaktifkan komplemen.
3. Imunohistokimia
Metode Imunohistokimia adalah suatumetode yang digunakan untuk mendeteksi ikatan antigen-antibodi pada jaringan dengan menggunakan antibodi yang homolog.Antigen yang dideteksi bisa berupa virus atau bakteri ataupun suatu protein tertentu. Ada 2 macam imunohistokimia berdasarkan reaksi yang diterapkan, yaitu Direct immunohistochemistry atau imunohistokimia langsung dan Indirect immunohistochemistry atau imunohistokimia tak langsung.
Gambar 3Skema imunohistokimia langsung dan tak langsung (Ramos-Vara, 1999)
Imunohistokimia tak langsung berbeda dengan imunohistokimia langsung karena adanya antibodi sekunder yang berikatan dengan antibodi primer dan
13 dilabel dengan enzim. Kemudian komplek ini berikatan dengan kromogen dalam proses pewarnaan.
Gambar 4Skema imunohistokimia tak langsung dengan metode ABC (Avidin Biotin Complex),
(Vector Laboratories, 2010)
Diagnosa IBD dengan menggunakan imunohistokimia telah dilakukan oleh Hamoudet al.pada tahun 2007. Mereka menggunakan blok parafin dan DAKO Envision System, yaitu kit yang berisi antibodi sekunder, yaitu peroxide yang dilabel konjugat antimouse atau antirabbit. Para peneliti juga melakukan berbagai variasi pH formalin, suhu formalin, variasi durasi fiksasi formalin dan konsentrasi formalin. Hasil penelitian ini mereferensikan berbagai hal teknis imunohistokimia. Suhu fiksasi optimal dilakukan pada 4º C, dan pH yang optimal adalah pada kisaran 5 – 9. Dan diluar kisaran pH tersebut bisa menyebabkan tissue alteration dan reactive epitope.
4.PCR
Teknik PCR (Polymerase Chain Reaction) menurut Yuwono (2006) adalah teknik pelipatgandaan DNA secara eksponensial. Untuk melakukan teknik ini ada beberapa komponen yang harus ada, yaitu : pertama DNA cetakan, kedua oligonuklotida primer, ketiga dNTP (deoksiribonukleotida trifosfat), yang terdiri atas dATP, dCTP, dGTP dan dTTP, dan yang keempat adalah enzim DNA polymerase, yaitu enzim yang melakukan katalisis reaksi sintesis rantai DNA.
Dalam perkembangannya, PCR tidak hanya dilakukan pada DNA saja, tetapi juga dilakukan untuk RNA.Pada reaksi ini terlebih dahulu dilakukan
14
transkripsi balik (reverse transcriptation) terhadap molekul mRNA sehingga diperoleh cDNA. Molekul cDNA inilah yang digunakan sebagai cetakan pada proses PCR.
Deteksi virus IBD dengan PCR telah dilakukan oleh Dittal et al. (2005).Mereka melakukan deteksi virus dari infeksi lapangan di India.Hamoud et al. (2007) juga melakukan deteksi IBD dengan PCR, bersamaan dengan imunohistokimia.
PCR telah digunakan oleh Barlic-Maganja et. al. (2002) bersamaan dengan metode ELISA dari produk amplifikasi. Mereka menggunakan virus IBD strain vaksin dan isolat lapangan untuk optimalisasi produk PCR dan untuk determinasi kondisi dari hibridisasi mikroplate.Selanjutnya dipakai deteksi colorimetric dari amplikon.MetodePCR juga telah dikembangkan oleh Kusk et al. (2005) untuk membedakan beberapa strain spesifik dari virus IBD. Mereka telah membuat membuat susunan nukleotida untuk primer multiplek PCR. Strain yang dipakai adalah 2 strainvirus tantang(DK01 dan F52/70) serta 3 strain virus vaksin (Bursine-2, 228E dan D78).
Vaksin dan Vaksinasi IBD
Sampai saat ini vaksin yang ada di pasaran dibedakan ke dalam 4 kategori menurut jenis virus dan efek patologi yang dihasilkan. Berikut ini adalah pembagian golongan vaksin menurut Segal (2009):
1. Mild vaccine: tingkat invasive rendah, dinetralisir ketika level maternal antibodi rendah.
2. Intermediate vaccine : tingkat invasive sedang, merangsang antibodi IBD ketika titer maternal antibodi rata-rata adalah 200 (ELISA Idexx) dan <= 6 log 2 (VN). Kadang-kadang tidak efektif untuk melindungi akut IBDV.
3. Intermediate plus vaccine :invasive tinggi, merangsang antibodi IBD ketika titer rata-rata maternal antibodi masih tinggi, yaitu 500 (ELISA Idexx) dan <= 8 log 2 (VN). Tidak disarankan untuk diaplikasikan sebelum umur 10 hari (broiler) dan 15 hari (breeder layer). Hal ini untuk mencegah kerusakan pada bursa. Sangat cocok untuk mencegah tipe akut klinis IBDV
15 4. Hot vaccine :invasive sangat tinggi dan juga memberikan residu patogenisitas tinggi pula. Sangat jarang digunakan.
Juranovaet.al. (2001)menyebutkan beberapa strain virus vaksin dan menggolong-golongkannya. Vaksin yang termasuk dalam golongan mild menurut Juranovayaitu Z 2037, OP 23 dan V2.Sedangkan vaksin golongan intermediate yaitu golongan S706. Vaksin strain V 877, V3 dan LC 75 merupakan vaksin golongan virulen.Vaksin V3 merupakan vaksin intermediate plus, artinya bahwa vaksin ini merupakan vaksin golongan hot tetapi dibuat lebih aman menyerupai vaksin intermediate. Keunggulan dari vaksin golongan intermediate yaitu memiliki efek samping yang kecil, sedangkan golongan hot memiliki efek yang kuat dan sangat agresif terhadap bursa. Maka dari itu vaksin golongan hot jarang digunakan.
Pada umumnya vaksinasi IBD dilakukan pada umur muda, mulai telur/embrio sampai ayam berumur 5 minggu.Vaksinasi dilakukan dengan tujuanmencegah atau menurunkan masalah infeksi dari lapangan.Tujuan yang kedua adalah untuk menaikkan status kebal dari ayam.Umumnya anak ayam mendapatkan perlindungan sampai umur 2-5 minggu dari antibodi maternal seiring dengan perkembangan sistem imun menjadi lebih matang (Saif, 2003). Titerantibodi maternal akan turun hingga 0 secara alamiah mulai dari DOC-ayam berumur 2-5 minggu. Kondisi inilah yang dinamakan dengan decline maternal antibody. Berikut ini adalah grafik yang menjelaskan penurunan maternal antibodi IBD mulai dari DOC sampai ayam berumur 35 hari yang diperoleh dari pemeriksaan serum darah dengan metode ELISA dan VN (Gambar 5).
16
Gambar 5Perbandingan hasil tes ELISA dan VN dari DOC sampai ayam umur 35 hari, ayam tidak divaksinasi (Dewell, 2008)
Dari grafik tersebut nampak bahwa dengan menggunakan ELISA jenis apapun, pada umur kira-kira 21 hari antibodi maternal akan habis. Sedangkan dengan VN, titer mendekati 4.Mengingat adanya penurunan titer antibodi maternal ini maka dilakukan vaksinasi pada umur muda. Vaksinasi dilakukan supaya seiring dengan turunnya maternal antibodi maka tubuh ayam akan membentuk antibodi hasil vaksinasi.
Moura et al. 2007 telah melaporkan aplikasi dari vaksin IBD secara in ovo.Pada aplikasi ini vaksin diinjeksikan pada telur ayam di hatchery umur 18 hari.Vaksin yang digunakan pada penelitian ini adalah D78 dan GLS. Kemudian ayam ditantang dengan virus IBD strain klasik dan strain varian. Hasil dari aplikasi in ovo ini adalah bahwa tidak ada efek hatchability(persentase telur yang menetas di hatchery) dan tidak menimbulkan kematian.Selain itu juga tidak menimbulkan kerusakan Bursa.
Juranovaet al. (2001) juga melaporkan penggunaan beberapa vaksin IBD dan efeknya.Beberapa vaksin golongan mild, beberapa lagi golongan intermediate dan beberapa lagi gologan hot (high virulent).Dari golongan mild, didapatkan bahwa titer antibodi bisa lebih tinggi serta timbulnya atropi bursa.Pada vaksin
Decline of Maternal Antibodies as measured by ELISA and VN Assay 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000 1 4 7 11 14 18 21 25 29 35 Age in Days E L IS A G M T 0 2 4 6 8 10 12 14 V N ( L o g 2 ) C-IBD IBD-XR C-IBD IBD+ E/Dl8903 GLS
17 golongan intermediate didapatkan adanya titer yang lebihrendah tetapi tidak signifikan terhadap index bursa.Sementara itu pada vaksin golongan high-virulent menimbulkantiter antibodi yang tinggi dan atropi bursa.
19
MATERI DAN METODE
Waktu Dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan di laboratorium riset Bagian Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor, Balai Besar Pengujuan Mutu dan Sertifikasi Obat Hewan (BBPMSOH) dan di Animal Health Laboratory PT CPJF, Ancol, Jakarta. Waktu pelaksanaan penelitian adalah dari bulan April sampai Oktober 2010.
Alat Dan Bahan a. Hewan percobaan
Penelitian ini menggunakan ayam broiler yang dibagi menjadi 8 kelompok percobaan.Selain itu juga menggunakan kelinci untuk produksi poliklonal antibodi untuk imunohistokimia.
b. Peralatan
Delapan set kandang kawat lengkap dengan tempat pakan dan minum. Kemudian satu set peralatan nekropsi (pisau bedah, gunting bedah, pinset, formalin 10%). Selain itu juga satu set peralatan histologi dan imunohistokimia, yaitu mikrotom, gelas obyek, cover glass, kit DAB, antibodi primer, hematoksilin, entelan, serta mikroskop dan kameral.
Peralatan elisa meliputi satu set kit elisa, komputer yang dilengkapi dengan software, reader dan pipet dengan tipnya. Sedangkan peralatan untuk persiapan virus dan vaksin berupa satu set peralatan kultur jaringan, telur ayam berembrio 9 hari, antibiotik, telur ayam SPF yang berembrio 8-9 hari, dan media kultur.
Metode Penelitian
Ayam dibagi menjadi 8 kelompok percobaan :
Kelompok I(Infected) :kontrol positif, tidak divaksin tetapi diinfeksi. Kelompok NI(Not Infected) :kontrol negatif, tidak divaksin dan tidak diinfeksi.
20
Kelompok V1NI (Vaccine 1 + Not Infected): divaksin IBD strain V1, tidak diinfeksi.
Kelompok V2I (Vaccine 2 + Infected) :divaksin IBD strain V2, diinfeksi. Kelompok V2NI (Vaccine 2 + Not Infected): divaksin IBD strain V2, tidak diinfeksi.
Kelompok V3I (Vaccine 2 + Infected) :divaksin IBD strain V3, diinfeksi. Kelompok V3NI (Vaccine 2 + Not Infected): divaksin IBD strain V3, tidak diinfeksi.
Vaksin strain V1 adalah strain W2512, golongan intermediate plus yang diaplikasikan di hatchery. Vaksin strain V2 adalah strain D78, golongan intermediate yang diaplikasikan pada umur 13 hari. Sedangkan Vaksin strain V3 adalah strain 228E, golongan intermediate plus yang diaplikasikan pada umur 13 hari.
Setiap kelompok diambil 2 macam sampel untuk selanjutnya dilakukan pemeriksaan di laboratorium, yaitu sampel darah dan organ.Organ yang diambil meliputi bursa Fabricius, limpa, timus, seka tonsil dan proventrikulus. Sampel darah diambil 3 kali, yaitu pada DOC, sebelum diinfeksi pada umur 21 hari dan setelah diinfeksi yaitu pada umur 29 hari. Ayam dinekropsi dan diambil organ-organnya pada umur 29 hari dan kemudian difiksasi untuk selanjutnya dipersiapkan sebagai preparat histologi/imunohistokimia.
Persiapan Antibodi Primer
Antibodi primer dibuat dengan mengimunisasikan virus IBD strain Kediri dan vaksin V3 pada dua kelinci, sementara satu ekor kelinci digunakan sebagai kontrolnegatif. Setelah 3 minggu kemudian kelinci dibooster dengan mengimunisasikan ulang virus/ vaksin yang sama. Enam minggu kemudian kelinci diambil darahnya untuk diperiksa serumnya, diukur titernya.Pengukuran titer antibodi dilakukan dengan metode SN (serum neutralization).
21 Persiapan Virus dan Vaksin
Persiapan virus dilakukan dengan cara mempropagasi isolat virus IBD strain Kediri-Jawa Timur, kemudian diukur titernya dengan titrasi pada telur dan dengan kultur jaringan. Virus diinokulasikan pada telur ayam bertunas, dan diamati adanya infeksi sampai 7 hari.Infeksi ditandai dengan adanya kematian embrio, bintil-bintil pox dan kekerdilan embrio. Langkah berikutnya adalah menghitung titer dengan melalui angka EID50 dari virus tersebut, dengan rumus :
PD = % > 50 – 50/ % > 50 - % < 50 EP50 = - Log pengenceran > 50% + PD EP50 = - Log EID50
Titer virus = EID50/ 1 inokulum
Pada kultur jaringan dapat dilakukan dengan menanam virus pada embrio ayam SPF berumur 8-9 hari dan diamati selama 5 hari. Kultur kemudian diamati adanya CPE-nya (Cytopathic effect).Titer didapatkan dengan menghitung angka TCID50 dari virus.
Pemeliharaan, Vaksinasi dan Infeksi Broiler
Pemeliharaan ayam dilakukan pada tempat terpisah antara kelompok yang diinfeksi dan yang tidak. Infeksi dilakukan terhadap kelompok I, V1I, V2I dan V3I pada hari ke 21 dengan virus IBD strain Kediridengan dosis infeksi : 105EID50 (Suwarno, 2010, Komunikasi pribadi). Kemudian ayam dinekropsi pada umur 29 hari, untuk kemudian diambil beberapa organnya.
Pengambilan darah dilakukan pada umur 1 hari, umur 21 hari sebelum ayam diinfeksi dan 29 hari sebelum ayam dinekropsi. Darah kemudian diamati titer antibodi IBDnya.Pemeriksaan imunohistokimia dilakukan 2 kali, dengan menggunakan 2 macam antibodi primer yang berbeda. Antibodi primer pertama adalah dari strain virus yang sama dengan yang digunakan untuk menginfeksi (virus tantang). Sedangkan antibodi primer kedua adalah dari virus vaksin (V3).
22
Gambar 6Skema pemeliharaan ayam percobaan dari DOC sampai umur 29 hari. Pemeriksaan ELISA dan Imunohistokimia
ELISA dilakukan mengikuti prosedur kit ELISA tersebut. Dalam hal ini kit yang digunakan adalah Biochek (Babiker, 2008b). Serum diencerkan dengan perbandingan 1:500 dengan buffer diluent.Kontrol negatif dimasukkan pada lubang A1 dan A2 pada plate yang sudah ditempeli dengan antigen, kemudian diteruskan kontrol positif pada A3 dan A4.Sedangkan Reference Kontrol pada lubang A5. Serum yang telah diencerkan dengan perbandingan1 : 500 kemudian dimasukkan pada lubang A6, A7, A8 dan seterusnya. Plate tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 22-270 C selama 30 menit. Plate kemudian dicuci selama 3-5 kali dan kemudian ditambahkan konjugat pada semua lubangnya. Inkubasi juga dilakukan selama 30 menit pada suhu yang sama. Setelah itu plate dicuci 3-5 kali, dan diteruskan dengan penambahan substrat dan diinkubasi selama 15 menit. Pada saat inkubasi tepat 15 menit, ditambahkan stop solution untuk menghentikan reaksi pada plate. Selanjutnya plate dibaca OD-nya, yang kemudian dikonfersikan ke dalam titer.
Imunohistokimia digunakan dengan mengikuti prosedur dari Biocare dan dengan menggunakan DAB (Diamino Benzidine) sebagai kromogen. Ayam yang telah dinekropsi diambil organ-organnya, kemudian difiksasi dengan buffered Neutral Formalin 10%. . Kemudian dilanjutkan dengan
23 proses deparafinisasi dan blocking endogenous activitydengan 3% H2O2
dalam methanoldan snipper block.Penambahan antibodi primer ditambahkan sesudah blocking dan diteruskan dengan antibodi sekunder. Langkah berikutnya adalah dengan penambahan label, dan terakhir dengan pewarna DAB. Untuk memberikan latar belakang maka diwarnai dengan hematoksilin. Langkah terakhir dari pewarnaan ini yaitu dengan cara hidrasi, yaitu dengan mencelupkan slide ke dalam alkohol bertingkat dan kemudian ke dalam xylol.
Pengamatan terhadap organ yang telah diwarnai dengan DAB dilakukan secara kualitatif dan kuantitatif.Secara kualitatif dengan menyatakan negatif atau positif. Penilaiankuantitatif dinyatakan dengan :
1. – (tidak ditemukan antigen pada semua lapang pandang) 2. + (jumlah antigen 1-10pada satu lapang pandang) 3. ++ (jumlah antigen 11-30pada satu lapang pandang) 4. +++ (jumlah antigen > 30pada satu lapang pandang)
25
HASIL DAN PEMBAHASAN
Titer antibodi IBD
Pemeriksaan serum darah terhadap ayam umur sehari (DOC) dilakukan terhadap ayam penelitian yang berasal dari hatcherydan breeder yang sama. Sampel DOC yang diambil ada 2 macam, yaitu DOC kelompok Vaksin 1 (V1I dan V1NI) dan DOC yang tidak divaksin di hatchery. Titer yang terukur merupakan titer dapatan dari induk (antibodi maternal). Karena keduanya berasal dari breeder yang sama maka hasilnya tidak terlalu berbeda jauh dari kedua kelompok. Tabel 1 menunjukkan hasil titer IBD yang diperoleh dengan metode ELISA (indirectELISA, dengan menggunakan kit Biochek).
Tabel1Hasil Titer ELISA IBD dari semua kelompok
Kelompok ELISA
DOC 21 hari 29 hari
I 9464.5±67.2a 456±214a 220±295a NI 173±215a V1I 442±252a 127±90a V1NI 123±47a V2I 510±317a 84±64a V2NI 62±18a V3I 386±137a 190±116a V3NI 100±35a
Keterangan : Huruf superscribe yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan beda nyata.
Pengambilan darah yang kedua adalah pada umur 21 hari yang merupakan 21 hari pasca pemberian vaksinV1dan 8 hari pasca pemberian vaksinV2maupunV3.Hasil dari keempat kelompok masih belum menunjukkan perbedaan titer yang mencolok.Pada umur ini masih ada titer antibodi maternal, sementara titer pada kelompok V2I/V2NI dan V3I/V3NI belum meningkat maksimal.Analisa statistik menunjukkan bahwa pada umur 21 hari titer antibodi tidak berbeda nyata dari semua kelompok, baik dari
26
kontrol positif, kontrol negatif dan dari kelompok yang menggunakan V1, V2 dan V3.
Seluruh kelompok kemudian dipecah menjadi 2, dan dipelihara secara terpisah. Kelompok I, V1I, V2I dan V3I yang diinfeksi dengan virus tantang IBD strain Kediri dan kelompok NI, V1NI, V2NI dan V3NI yang tidak dinfeksi. Infeksi dilakukan pada umur 21 hari, dan titer antibodi diperiksa 8 hari sesudah uji tantang.Kelompok I dengan titer 220 nampak lebih tinggi dari kelompok NI dengan titer 173. Namun pada analisa statistik tidak diperoleh perbedaan nyata baik pada kelompok kontrol maupun kelompok-kelompok lain. Hasil ini tetap sama baik dengan mengikut sertakan data pencilan (outlayer) atau tidak.
Pada umur 21 dan 29 hari nampak titer tidak beda nyata diantara semua kelompok. Pada umumnya, infeksi akibat pemberian virus tantang pada ayam yang telah divaksin akan menyebabkan meningkatnya titer antibodi . Namun dalam penelitian ini, sampai dengan umur 29 hari masih belum ada perbedaan mencolok pada ayam yang diinfeksi dan ayam yang tidak diinfeksi (Tabel 1 dan Gambar 7).
Gambar 7Grafik titer ELISA IBD dari 8 kelompok percobaan. Sumbu vertikal adalah titer IBD dan sumbu horisontal adalah umur ayam. Dari delapan kelompok menunjukkan kemiripan garis.
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000
DOC 21 hari 29 hari
IBD T it e r Age