I. Mempelajari potensi pemanfaatan bahan obat alam asli Indonesia, yaitu kulit kayu
Kluwih(Artocarpus communis J.R.)
menjadi obat herbal terstandar antitumor payudara, yang nantinya dapat dipromosikan & dimanfaatkan dalam membantu pengobatan tumor/kanker payudara di masyarakat.2 . Mendapatkan data ilmiah yang kuat, HKI dan produk OHT antitumor payudara yang berkualitas dari ekstrak kulit kayu
Kluwih,
yang nantinya dapat diproduksi oleh mitra industri jamu/farmasi & dipasarkan kepada masyarakat.3. Untuk lebih menggali & memanfaatkan potensi kekayaan hayati (tumbuhan obat) asli Indonesia menjadi produk-produk herbal yang berkualitas & bermanfaat bagi kehidupan dan kesehatan masyarakat, sehingga memberikan pemanfaatan yang lebih baik secara ekonomi maupun medis.
4.
Hasil-h!lsil riset yang diperoleh dapat dijadikan sarana peningkatan & penguatan keijasama lembaga, baik Fakultas Farmasi, LPPM maupun UMS dengan mitra-mitra industri, lembaga riset lain, maupun stakeholder yang lain.B.Maofaat penelitian
1. Membantu masyarakat terutama bagi penyandang kanker payudara untuk mendapatkan pengobatan yang efektif dengan efek samping yang ringan.
2 . Membantu masyarakat terutama bagi penyandang kanker payudara untuk mendapatkan pengobatan yang efektif dan murah.
1 9
-Bab V. Hasil dan Pembahasan
A.
Uji Aktivitas Sitotoksik Ekstrak Metanol Kulit Kayu Kluwih dengan Metode MITArtonin E yang merupakan senyawa aktifa yang terkandung dalam Kluwih memiliki aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker T47D (Arung, et al., 2010). Walaupun artonin E merupakan senyawa yang aktif terhadap sel kanker T 4 70 tapi belum diteliti bagaimana aktivitas dari ekstrak kulit kayu Kluwihnya. Pengujian ekstrak penting untuk dilakukan mengingat di lapangan para produsen obat tradisional memproduksi dalam bentuk ekstrak. Oleh karena itu untuk memberikan landasan ilmiah yang kuat terhadap aktivitas sitotoksiknya maka perlu diuji pada set kanker. Pengujian ekstrak kulit kayu kluwih dilakukan pada sel kanker MCF7 yang juga merupakan sel kanker payudara.
Metode awal untuk penentuan aktivitas sitotoksik dari ekstrak kulit kayu kluwih yang peneliti usulkan adalah dengan metode
direct counting.
Namun berdasarkan evaluasi di lapangan bahwa metode ini memiliki reliabilitas yang rendah dan subjektivitas yang tinggi. Oleh karena itu yang dipakai untuk mengukur proliferasi sel secara kolorimetri adalah MTT (Doyle and Griffiths, 2000 cit Anggrianti, 2008). Prinsip dari metode MTT adalah terjadinya reduksi garam kuning tetrazolium MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromid) oleh sistem reduktase (Gambar 1).NADH +H*
NAO' + H8t
Gambar 1. Reaksi reduksi MTT menjadi formazan oleh enzim suksinat dehidrogenase (Mosmann,
1983)
Suksinat tetrazolium yang termasuk dalam rantai respirasi dalam mitokondria sel-sel yang hidup membentuk kristal formazan berwama ungu dan tidak larut air Gambar 2).
Penambahan reagen stopper (bersifat detergenik) akan melarutkan kristal berwama ini yang
•
kemudian diukur absorbansinya menggunakan ELISA reader. lntensitas warna ungu yang terbentuk proporsional dengan jumlah sel hidup. Sehingga jika intensitas warna ungu semakin besar, maka berarti jumlah sel hidup semakin banyak (Meiyanto, E, 2000.). Hasil dari pengujian ini adalah IC50, yang menggambarkan konsentrasi dari suatu senyawa yang dapat membunuh 50% sel hidup.
Gambar
2.Krista! formazan. Krista! berwarna ungu hasil reduksi garam
MTToleh sistem reduktase suksinat tetra.zolium mitokondria
selhidup. Jumlah kristal formazan yang terbentuk berbanding lurus dengan jumlah sel hidup
Pelarut yang digunakan dalam uji sitotoksik ini adalah dimetil sulfoksida (DMSO) merupakan pelarut yang baik untuk ion anorganik maupun organik (Fessenden dan Fessenden, 1993), selain itu DMSO juga tidak toksik terhadap sel (Ojajanegara dan Wahyudi, 2009).
Menu rut Astirin et al. (2009) penggunaan DMSO dengan konsentrasi 0, 7% tidak mempengaruhi persentase sel hidup dan morfologi sel T470. Konsentrasi DMSO yang digunakan sebagai kontrol pelarut adalah konsentrasi DMSO tertinggi yang terdapat dalam sampel yaitu 0,5%.
Tujuan digunakan kontrol pelarut DMSO adalah untuk melihat apakah pelarut mempengaruhi kehidupan sel. Untuk mengurangi kesalahan pembacaan absorbansi digunakan kontrol media sebagai faktor koreksi .
Set kanker payudara yang digunakan adalah sel MCF7. Sel MCF7 yang hidup memiliki bentuk epitelia seperti daun memanjang dan bergerombol, melekat pada sumuran. Sel yang hidup dapat meneruskan cahaya sehingga akan terlihat terang, sedangkan sel yang mati akan berubah menjadi bulat-bulatan tidak beraturan, mengapung pada media dan terlihat gelap karena tidak bisa meneruskan cahaya. Morfologi sel dapat dilihat dari fotomikroskopik sel MCF7 setelah perlakuan dengan ekstrak metanol kulit kayu kluwih (Gambar 3).
21
-f
f.': '
A B c
Gambar 3. Fotomikroskopik Sel MCF7 setelah Perlakuan dengan Ekstrak Metanol Kulit Kayu Kluwih 10 JJg/
ml(B) dan 40 10 ..,g/ ml (C) dibandingkan dengan kontrol sel (A). Tanda
-+menunjukkan sel MCF7 yang hidup dan
-+sel MCF7 yang mati. Peningkatan konsentrasi ekstrak yang diberikan berbanding lurus dengan jumlah kematian sel MCF7
Pengamatan efek sitotoksik setetah pemberian pertakuan ditakukan dengan cara menghitung persentase set hidup (Tabet 1). Setanjutnya dibuat grafik ( Gambar 4) dan persamaan regresi tinier antara prosentase sel hidup dengan log konsentrasi untuk menghitung IC50. microplate 96 ditaoam 5.000 sel/sumuran, kemudian diberi perlakuan deogao (A) ekstrak kulit kayu kluwih dan (B) Doksorubisin diiokubasi 24 jam.
Grafik di atas memperlihatkan hubungan yang linier antara persen sel hidup dengan log konsentrasi. Artinya pada range kadar senyawa tersebut memberikan respon yang tinier.
Sehingga persamaan regresi yang dihasitk.an dapat diaplikasikan untuk menghitung IC50.
·-·
Senyawa Konsentrasi rata-rata % sel
Persamaan Regresi Nilai R2 ICSO hid up
1 89.Z08
Ekstrak Kulit 1.477 74.797
Kayu Kluwih
(�
1.602 27.337Y =
-60.73x + 147.4 0.861 40,16Hasil penelitian didapatkan bahwa ICso dari ekstrak metanol kulit kayu kluwih adalah 40, 16 IJg/mL dan doksorubisin adalah 0,11 1Jg/ml. Aktivitas sitotoksik dari ekstrak metanol kulit kayu kluwih karena ada senyawa aktif yaitu Artonin E. Aktivitas sitotoksik doksorubisin masih lebih kuat dan pada ekstrak. Walaupun demikian ekstrak kulit kayu kluwih masih mempunyai kesempatan untuk dikembangkan menjadi senyawa anti kanker karena menurut Meiyanto, dkk (2008) suatu senyawa berpotensi sebagai agen sitotoksik jika nilai IC5o di bawah 100 J.Jg/ml.
B. Standardisasi Ekstrak metanol Kulit kayu Kluwih 1 . Penyiapan Simplisia & Ekstraksi Kulit Kayu Kluwih
Pada penetapan standardisasi ekstrak, terdiri dari tahap penyiapan ekstrak, penetapan parameter non spesifik dan spesifik. Penyiapan ekstrak dilakukan dengan menggunakan metode maserasi dengan pelarut metanol. Pnnsip dan maserasi itu sendin adalah difusi pelarut organik yang menembus dinding set dan masuk ke dalam rongga set yang mengandung zat aktif, sehingga zat aktif akan larut sampai terjadi kesetimbangan.
Hasil maserasi diperoleh rendemen ekstrak sebanyak 1 ,7-3,4 % b/b dan berat serbuk simplisia (Tabel 1). Rendemen tersebut diperoleh dari rendemen ekstrak yang berasal dari tiga daerah, yaitu Klaten, Colomadu, dan Blora .
23
-
-�---=.--T abel 8. Rata-rata Rendemen Ekstrak Meta no I Kulit Kayu Kluwih Asal Simplisia Rata-rata Rendemen (n=3)
Klaten 1 ,69 ± 0,29
Blora 2,67 ± 0,86
Colomadu 3,35 ± 0,54
Berdasarkan data di atas maka simplisia yang berasal dari cofomadu memberikan rendemen terbanyak. Namun demikian, belum tentu tingginya rendemen menunjukkan kandungan zat aktif yang tinggi juga.
2. Penetapan parameter non spesifik
Penentuan parameter spesifik dan non spesifik dalam standardisasi ini menggunakan sampel dari 3 daerah yang berbeda. Tujuan dari variasi tempat berbeda adalah agar dapat diketahui pengaruh faktor eksternal, khususnya untuk lokasi asal tumbuhan, terhadap mutu ekstrak. Perbedaan lokasi asal tumbuhan dapat mempengaruhi jenis dan jumlah senyawa kimia yang terkandung di dalam tanaman. Hal tersebut disebabkan karena unsur hara yang terkandung di dalam tanah pada tiap daerah tidak sama, sehingga kandungan unsur hara yang berbeda memuf1gkinkan terbentuk senyawa kimia yang berbeda pula (Anonim, 2000).
Hasil dari penetapan parameter non spesifik dari ekstrak kulit kayu Kluwih, sebagai berikut :
Tabel 9. Rekapitulasi penetapan parameter non spesifik ekstrak kulit kayu Kluwih
Parameter
Hasil (n=3)
S isa pelarut (%) Tidak terdeteksi Tidak terdeteksi Tidak terdeteksiParameter susut pengeringan memberikan batasan maksimal (rentang) tentang senyawa yang hilang pada proses pengeringan. Selama proses pengeringan terjadi proses penguapan dari air maupun senyawa-senyawa lain terutama yang bersifat mudah menguap
(volatile),
sehingga yang tersisa berupa padatan yang merupakan senyawa-senyawa yang tidak teruapkan. Hasil yang didapatkan pada penetapan parameter ini sebesar 3,6-12,8% bib (fabel 2). Berdasarkan Voigt (1 984) bahwa maksimal susut pengeringan ekstrak kering kurang dari15%, maka parameter susut pengeringan memenuhi kriteria standar.
Parameter bobot jenis menggambarkan besarnya massa persatuan vofume untuk memberikan batasan antara ekstrak cair dan ekstrak kental (Anonim, 2000). Hasil yang diperoleh sebesar 1,0034-1,0180 b/v (Tabel 2), menunjukkan bahwa bobot jenis ektrak lebih besar dibanding bobot jenis air (BJ air: 1 ,00 blv). Parameter bobot Jenis juga terkait dengan kemumian ekstrak dan kontaminasi. Ekstrak yang terkontaminasi dengan cemaran seperti logam berat atau ekstrak lain dimungkinkan memiliki bobot jenis yang berbeda dari bobot jenis ekstrak yang sebenamya. Parameter bobot jenis jika dihubungkan dengan parameter kadar senyawa terlarut menunjukkan adanya korelasi, dimana jika volume pengukuran tetap, maka semakin besar bobot jenis yang terukur, kadar senyawa yang tertarut dalam pelarut yang digunakan semakin besar pula. Hal ini disebabkan karena bobot jenis ekstrak diperoleh dari adanya senyawa yang terlarut di dalam pelarut yang digunakan.
Penentuan parameter kadar abu bertujuan untuk memberikan gambaran kandungan mineral internal dan eksternal. Jika ekstrak dipanaskan maka senyawa organik akan terdestruksi. Sebagian besar Senyawa hidrokarbon akan berubah menjadi gas karbon dioksida hidrogen dan oksigen menjadi uap air, dan nitrogen menjadi uap nitrogen, sedangkan sebagian senyawa anorganik akan tertinggal dalam bentuk abu berupa mineral atau garam mineral (Arifin, 2008). K�dar abu total ekstrak yang didapat sebesar 3,06-7,58% bib, sedangkan kadar abu yang tidak larut dalam asam diperoleh hasil sebesar 0,06-0,26% bib (Tabel 2). Hal ini menunjukan bahwa sisa senyawa anorganik berupa mineral atau garam mineral yang terdapat dalam ekstrak sebesar 3,06-7,58 % dan kadar unsur anorganik yang tidak larut dalam asam sebesar 0,06-0,26 % dari bobot awal penimbangan ekstrak. Adanya kandungan abu yang tidak larut dalam asam menunjukkan adanya pasir atau kotoran yang lain (Sudarmadji, 1989).
Parameter lain yang menunjukkan stabilitas dan mtu dari suatu ekstrak adalah kadar air.
Kadar air dalam ekstrak sangat mempengaruhi kualitas dan daya simpan dari ekstrak tersebut.
Ekstrak yang mengandung air lebih dari 30% akan mudah ditumbuhi oleh jamur (Voigt, 1984).
Menurut literatur lain kadar air dalam ekstrak tidak boleh lebih dari 10%, karena ekstrak dengan kadar air lebih dari 10% juga berpotensi ditumbuhi jamur (Soetamo dan Soediro, 1997, cit Helmi et a/., 2006). Oleh karena itu, penentuan kadar air dari ekstrak penting untuk ditetapkan.
Pada penelitian ini penetapan kadar air dalam ekstrak dilakukan dengan metode destilasi toluen. Toluen merupakan suatu pelarut organik yang bersifat non polar dengan bobot jenis 0,87 g/ml, memiliki titik didih 1 1 ooc dan tidak larut dalam air (Moffat, 2005). Bila toluen dicampur dengan air akan terbentuk dua lapisan terpisah, air akan berada pada lapisan bawah karena bobot jenis air lebih besar dibanding toluen. Kadar air dalam ekstrak diperoleh 1,3-7,0 %
(T
abel 2). Kadar air terse but memenuhi persyaratan, dan berdasarkan pembagian jenis ekstrak25
-(Voight, 1984), ekstrak yang berasal dari Klaten dan Colomadu termasuk dalam ekstrak kering, sedangkan ekstrak dari Blora merupakan ekstrak kental.
Penetapan parameter lain yang berpengaruh pada keamanan ekstrakl toksisitas adalah sisa pelarut khususnya pelarut organik. Mengingat metanol sebagai pelarut merupakan senyawa organik yang memiliki toksisitas yang tinggi. Metanol dalam jumlah kecil dapat menyebabkan kebutaan hingga kematian (Moffat, 2005). Oleh karena itu, parameter sisa pelarut harus ditetapkan untuk memberikan jaminan bahwa selama proses tidak meninggalkan sisa peJarut. Penetapan parameter sisa pelarut menggunakan metode destilasi dengan pemanasan pada suhu titik didih metanol (TO metanol:
64,-r'C).
Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa di dalam ekstrak dari tiap daerah tidak terdeteksi adanya sisa pelarut dengan menggunakan metode destilasi. Hal ini karena residu yang kecil tidak dapat terdeteksi oleh prosedur standar biasa tapi harus menggunakan metode yang lebih sensitive seperti kromatografi gas.3. Parameter Spesifik
Parameter spesifik dari suatu ekstrak sangat diperlukan karena mempengaruhi efek farmakologinya. Penetapan parameter spesifik terdiri dari organoleptik, profit kromatogram dan kadar chemical marker. Penentuan organoleptik ditentukan dengan menggunakan panca indera. Tujuannya adalah untuk pengenalan awal secara sederhana dan subjektif. Dari pengamatan didapatkan hasil: ekstrak berkosistensi kering, berwama coklat tua, berbau khas dan rasa pahit (Tabel 3). Wama ekstrak dari tiap-tiap daerah menunjukkan ciri yang berbeda dimana diduga ekstrak dari tiap daerah memiliki kandungan senyawa yang berbeda-beda.
Dugaan tersebut dapat diverifikasi dengan menetapkan parameter pola kromatogram ekstrak.
Tabel 10. Rekapitulasi Penetapan Parameter Spesifik Ekstrak Kulit Kayu Kluwih Parameter
Organoleptis: Warna Bau Rasa Bentuk Parameter pola kromatogram menunjukkan gambaran awal komposisi kandungan kimia