HASIL DAN PEMBAHASAN
F. Uji Angka lempeng Total (ALT)
Uji ALT adalah penghitungan jumlah mikroba dengan caraviable countatau disebut juga sebagai standard plate count didasarkan pada asumsi bahwa setiap sel mikroba hidup dalam suspensi akan tumbuh menjadi satu koloni setelah diinkubasikan dalam media biakan dan lingkungan yang sesuai. Setelah masa inkubasi, jumlah mikroba yang tumbuh dihitung dan merupakan perkiraan atau
dugaan dari jumlah mikroba dalam suspensi tersebut. Penghitungan jumlah mikroba hidup adalah jumlah minimum mikroba. Hal ini disebabkan koloni yang tumbuh pada lempengan agar merupakan gambaran mikroba yang dapat tumbuh dan berbiak dalam media dan suhu inkubasi tertentu. Prinsip dari uji Angka Lempeng Total (ALT) adalah pertumbuhan mikroba aerob mesofilik setelah contoh diinkubasikan dalam media agar pada suhu 35°C ± 1°C selama 24 jam 48 jam ± 1 jam mikroba ditumbuhkan pada suatu media agar, maka mikroba tersebut akan tumbuh dan berkembang biak dengan membentuk koloni yang dapat langsung dihitung.
Uji angka lempeng total dapat digunakan dalam pemeriksaan cemaran mikroba pada bahan baku obat dengan anggapan bahwa setiap sel mikroba yang hidup pada bahan tersebut akan tumbuh menjadi 1 koloni setelah diinkubasikan dalam media biakan dan lingkungan yang sesuai. Setelah masa inkubasi jumlah koloni yang tumbuh dihitung dan merupakan perkiraan atau dugaan dari jumlah mikroba pada bahan tersebut. Metode ini hanya digunakan untuk perhitungan terhadap mikroba yang hidup, yang memungkinkan sel yang hidup dapat membentuk koloni pada kondisi percobaan yang sesuai, oleh karena itu metode ini disebut viable count atau standard plate count. Karena pertumbuhan koloni dan jumlah koloni yang teramati yang dipergunakan dalam perhitungan jumlah, maka
satuan yang digunakan adalah satuan colony forming units (CFU/ml) atau
koloni/ml. Untuk perhitungan jumlah mikroba hidup, sebaiknya pada metode ini hanya lempeng agar yang mengandung jumlah koloni antara 30 –300 koloni saja yang diambil untuk perhitungan. Lempeng agar yang mengandung jumlah koloni
lebih dari 300 koloni akan sangat sulit untuk dihitung, sehingga kemungkinan kesalahan perhitungan sangat besar yang akhirnya akan mengurangi keabsahan penelitian. Pengenceran sampel akan akan membantu dalam memperoleh
perhitungan yang benar, namun pengenceran yang terlalu tinggi akan
menghasilkan jumlah koloni yang rendah (< 30 koloni). Pada jumlah koloni yang terlalu rendah tersebut perhitungan statistik menjadi tidak sah karena terjadi perbedaan mencolok dan tidak bisa digunakan untuk perhitungan. Bila pada seluruh seri pengenceran tidak terdapat jumlah koloni yang memenuhi persyaratan 30-300 koloni, maka tata cara perhitungannya menggunakan cara yang tertulis pada tata cara analisis hasil.
Pada pengujian ini akan diketahui jumlah cemaran bakteri pada sediaan jamu gendong di tiga pasar di DIY. Pengujian cemaran bakteri dari sampel jamu gendong beras kencur dengan metode uji angka lempeng total dilakukan sebanyak 3 kali pengambilan sampel, masing-masing sampel dilakukan replikasi duplo, sebanyak 1 ml suspensi hasil pengenceran sampel dituang ke dalam cawan petri. Ke dalam setiap piring petri tersebut dituangkan media Plate Count Agar (PCA) steril yang telah dicairkan dengan temperatur media berkisar pada 40oC. Plate Count Agar(PCA), (gambar. 1). Pembuatannya Bahan-bahan dilarutkan dalam air suling dan dipanaskan sampai mendidih (sambil diaduk) dinginkan hingga suhu 45-60oC. dituang dalam cawan petri sterilkan pada suhu 121oC selama 15 menit dengan autoklaf dan pH akhir 7,0. Media yang baru disterilkan didinginkan sampai pada suhu 44-45oC kemudian digunakan sesuai dengan kebutuhan, media
yang telah disterilkan jika tidak digunakan disimpan pada suhu 5-15oC, jika akan digunakan lagi dipanaskan lagi dengan penangas air.
Gambar. 1 MediaPlate Count Agar (PCA)
Tetrazolium chloride (TTC) ditambahkan ke dalam agar. Untuk menandai kehadiran bakteri di dalam agar dengan warna merah. Warna merah adalah hasil dari metabolisme bakteri. TTC menerima elektron dari bakteri. Ketika dioksidasi, TTC dapat larut dan tanpa mewarnai. ketika direduksi, TTC berwarna merah dan membentuk endapan yang tidak dapat larut( tidak menyebar di luar agar). berarti di mana terdapat warna merah maka di sana terdapat koloni. Warna yang merah
bukan ciri khas bakteri tersebut. Hal itu disebabkan oleh pengurangan
Tetrazolium Klorida secara kimiawi sebagai hasil metabolisme hasil bakteri. Cawan petri selanjutnya diinkubasi pada temperatur 35-37oC selama 24-48 jam dalam posisi terbalik. Penghitungan jumlah koloni bakteri yang tumbuh pada media dilakukan sesuai cara penghitungan yang ditetapkan dalam prosedur operasional baku pengujian mikrobiologi oleh balai POM.
Metode yang digunakan adalah metode uji angka lempeng total, prosedur kerja menggunakan MA PPOMN Nomor : 95/MIK/00, metode ini digunakan untuk menetapkan angka bakteri aerob mesofil yang terdapat dalam sediaan obat tradisional.
Dalam rangkaian pemeriksaan terhadap bahan baku obat dan dalam menjamin mutu kualitas, dan manfaat dari bahan baku obat sebelum dikatakan boleh diproses lebih lanjut, maka salah satu parameter yang harus dipenuhi adalah
pemeriksan bahan baku dari cemaran mikroba. Departemen Kesehatan
menyarankan bahwa baku obat boleh positif mengandung cemaran mikroba tetapi sampai batas tertentu, dan tidak boleh mengandung cemaran patogen
Supaya mikroba yang tumbuh pada cawan Petri adalah benar merupakan cemaran yang berasal dari suspensi serbuk bahan, maka teknik aseptis dalam laboratorium merupakan hal yang sangat penting, ada beberapa cara yang dapat dilakukan untuk mengurangi resiko masuknya cemaran dari luar antara lain mensterilisasikan bahan dan alat yang dipakai dalam penelitian, penggunaan
laminar air flow (LAF), dan pembuatan blangko dari media dan pengencer yang dipakai dalam penelitian agar memastikan cemaran tidak berasal dari media dan pengencer. Pada sterilisasi media, media yang tahan panas disterilkan dalam autoklaf selama 15 menit pada suhu 121oC. Pada keadaan suhu seperti ini maka bakteri thermofil yang tahan terhadap suhu sampai 80oC sekalipun akan mati.
Setelah dituang dalam cawan Petri, dibiarkan beberapa saat supaya memadat, kemudian dibalik dan diinkubasi pada suhu 35-37oC selama 24-48 jam. Cawan petri harus dibalik supaya uap air yang terkondensasi pada tutup cawan
tidak menetes pada media yang dapat mengacaukan perhitungan koloni, karena koloni tidak memisah. Suhu inkubasi pada 35-37oC karena sebagian besar bakteri terutama golongan mesofil mempunyai suhu optimum pertumbuhan sekitar 20-40oC.
Setelah diinkubasi selama 24-48 jam pada suhu 35-37oC, koloni bakteri yang tumbuh dapat dihitung. Sebagai blanko digunakan media PCA, PCA+LB, PCA+PDF, dan dipakai untuk mengurangi angka lempeng total jika terdapat kontaminasi pada media.
Gambar 3. BlankoStandard Plate Count(SPC) agar
Gambar 4. BlankoStandard Plate Count(SPC) danPepton Dilution Fluid
Dari penghitungan jumlah koloni bakteri kemudian dipilih koloni seri pengenceran yang memiliki jumlah 30-300 koloni, dan dihitung sesuai dengan cara penghitungan ALT menurut MA PPOMN Nomor : 95/MIK/00. Dari perhitungan ALT diperoleh hasil.
Tabel I. Hasil Perhitungan ALT pada Pengambilan Sampel Periode Pertama dari 5 Penjual setelah Pengamatan 24 jam, dan Setelah 48 jam
Kode sampel Jumlah koloni pada Pengamatan ke 1
(24 jam)
Jumlah koloni pada Pengamatan ke 2 (48 jam) ALT (koloni/ml) 34/T/S/07 I. 159 x10-3 II. 36 x 10-4 I. 270 x 10-3 II. 119 x 10-4 14 x 104 35/T/S/07 15 x 10-3 26 x 10-3 13 x 103 36/T/S/07 4 x 10-6 25 x 10-6 13 x 106 37/T/S/07 20 x 10-3 127 x 10-3 64 x 103 38/T/S/07 187 x 10-5 207 x 10-5 10 x 106
Keterangan : Kode sampel melambangkan penjual jamu gendong beras kencur
Hasil pengujian Angka Lempeng Total pada pengambilan sampel periode pertama, cemaran bakterinya melebihi batas yang dipersyaratkan Departemen Kesehatan RI. Pada sampel 34/T/S/07 terdapat cawan dari dua tingkat pengenceran yang berurutan menunjukkan jumlah koloni 30 – 300, digunakan cara perhitungan koloni no.3, dihitung jumlah koloni dari masing-masing tingkat pengenceran kemudian dikalikan dengan faktor pengencerannya. Dari perhitungan yang lebih tinggi didapatkan jumlah koloni rata-rata lebih besar dari 2 kali jumlah koloni rata-rata dibawahya sehingga dipilih jumlah koloni 270 untuk menghitung angka lempeng total.
Tabel II. Hasil Perhitungan ALT pada Pengambilan Sampel Periode Kedua dari 5 Penjual setelah Pengamatan 24 jam, dan Setelah 48 jam Kode sampel Jumlah koloni pada
Pengamatan ke 1 (24 jam)
Jumlah koloni pada Pengamatan ke 2 (48 jam) ALT (koloni/ml) 39/T/S/07 123 x 10-4 163 x 10-4 82 x 104 40/T/S/07 3 x 10-4 282 x 10-4 14 x 105 41/T/S/07 9 x 10-6 132 x 10-6 66 x 106 42/T/S/07 4 x 10-3 65 x 10-3 33 x 103 43/T/S/07 18 x 10-4 50 x 10-4 25 x 104
Keterangan : Kode sampel melambangkan penjual jamu gendong beras kencur
Pada pengambilan sampel periode kedua dengan prosedur pengujian yang sama, pada 5 penjual jamu gendong beras kencur yang sama, kelima sampel jamu gendong beras kencur di tiga pasar di Kotamadya Yogyakarta juga menunjukkan nilai angka lempeng total melebihi batas yang telah ditetapkan oleh Departemen Kesehatan yaitu 104, tetapi ALT yang ditunjukkan berbeda bermakna dengan pada saat pengambilan sampel pertama.
Tabel III. Hasil Perhitungan ALT pada Pengambilan Sampel Periode Ketiga dari 5 Penjual setelah Pengamatan 24 jam, dan Setelah 48 jam
Kode sampel Jumlah koloni pada Pengamatan ke 1
(24 jam)
Jumlah koloni pada Pengamatan ke 2 (48 jam) ALT (koloni/ml) 44/T/S/07 128 x 10-4 148 x 10-4 74 x 104 45/T/S/07 235 x 10-2 272 x 10-2 14 x 103 46/T/S/07 35 x 10-6 177 x 10-6 89 x 106 47/T/S/07 82 x 10-3 198 x 10-3 99 x 103 48/T/S/07 29 x 10-5 83 x 10-5 42 x 105
Keterangan : Kode sampel melambangkan penjual jamu gendong beras kencur
Pada pengambilan sampel periode ketiga dengan prosedur pengujian yang sama, pada 5 penjual jamu gendong beras kencur yang sama, kelima sampel jamu gendong beras kencur di tiga pasar di Kotamadya Yogyakarta juga menunjukkan nilai angka lempeng total melebihi batas yang telah ditetapkan oleh Departemen Kesehatan yaitu 104. ALT yang ditunjukkan berbeda bermakna dengan pada saat pengambilan sampel pertama dan kedua, Angka Lempeng Total dalam jamu gendong beras kencur dari seorang penjual bisa berbeda untuk setiap kali penjualan. Hal ini bisa berarti tidak adanya keseragaman dalam sediaan.
Dari ketiga data hasil uji angka lempeng total diatas yang sangat tinggi menunjukkan kurangnya kebersihan penjual. Dalam koloni yang teramati kemungkinan juga ada bakteri patogen.
Seri pengenceran yang digunakan untuk menghitung jumlah koloni berbeda-beda tergantung pada kepekatan cemaran mikroba dari masing-masing sampel, dari tabel dapat dilihat bahwa sampel 45/T/S/07pengambilan sampel ketiga, pada seri pengenceran 10-2 sudah dapat dihitung koloninya, tetapi ada beberapa sampel yang hingga seri pengenceran 10-6 baru dapat dihitung jumlah koloninya.
Gambar.5 Hasil dari pengujian angka lempeng total, dengan 9 seri pengenceran Keterangan : (1). Seri pengenceran 10-1, (2) seri pengeceran 10-2, (3) seri pengeceran 10-3, (3) seri pengeceran 10-3, (4) seri pengeceran 10-4, (5) seri pengeceran 10-5, (6) seri pengeceran 10-6, (7) seri pengeceran 10-7, (8) seri pengeceran 10-8, (9) seri pengeceran 10-9
Angka lempeng total (ALT) dari sejumlah sampel jamu yang diperiksa melebihi batas cemaran mikroba,di mana batas cemaran yang dipersyaratkan untuk sediaan tersebut sebesar 104koloni/ml.
Pada Tahun 2005 pernah dilakukan penelitian ALT pada jamu gendong oleh Sylviana Tunjung Pratiwi pada 5 produsen jamu gendong di Kotamadya Yogyakarta.
Tabel IV. Perhitungan Angka Lempeng Total Jamu Gendong dari 5 Produsen di Kotamadya Yogyakarta Hasil Penelitian Sylvia
Tahun 2005
Rerata Sampel (CFU) / ml Produsen 1 2 3 A 1.993.000* 220.200 1.798.000* B 2.138.500* 1.806.000* 1.536.500* C 1.061.500* 184.050 138.700 D 133.450 128.600 170.750 E 146.500 168.050 144.700
Keterangan * : melebihi ambang batas kontaminasi bakteri standar SNI 19-2897-1992 sebesar < 106CFU /ml
Dalam penelitian Sylvia tahun 2005 meyatakan bahwa produsen-produsen jamu gendong di DIY terkontaminasi oleh bakteri dengan jumlah kontaminan yang melebihi ambang batas konsumsi, yaitu sebesar <106CFU (Colony Forming Unit) per ml untuk bakteri. Hasil penghitungan angka lempeng total dibandingkan dengan standar uji cemaran mikroba SNI 19-2897-1992. Penelitian yang kami lakukan mengacu kepada Permenkes RI tentang persyaratan obat tradisional yang menyatakan bahwa angka lempeng total tidak boleh lebih dari 104koloni/ml.
Jumlah cemaran melebihi batas, hal ini terjadi kemungkinan karena beberapa faktor, antara lain kondisi air cuci, peralatan yang digunakan, debu, wadah yang digunakan kurang bersih, faktor lingkungan pasar yang mempunyai sanitasi buruk, kebiasaan pedagang, dan simplisia yang digunakan. Untuk mencegah hal tersebut sebaiknya pedagang menggunakan air panas untuk mencuci alat, menggantinya apabila kotor dan pedagang mencuci tangan lebih dulu sebelum menyajikan jamu, karena ada beberapa penjual jamu yang meramu jamunya ditempat berjualan, sedangkan tangannya kontak dengan pembeli.
Perhitungan cemaran bakteri dengan menghitung ALT mempunyai beberapa kelemahan :
1. Hasil perhitungan tidak menunjukan jumlah sel yang sebenarnya, karena beberapa sel yang berdekatan mungkin membentuk satu koloni. 2. Media dan kondisi inkubasi yang berbeda mungkin menghasilkan nilai
yang berbeda.
3. Mikroba yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada media padat dan membentuk koloni yang kompak dan jelas dan tidak menyebar.
4. Memerlukan persiapan dan waktu yang relatif lama
Keberadaan mikroba pada makanan penting artinya karena mikroba tersebut dapat menyebabkan terjadinya kerusakan pada makanan atau dapat memproduksi toksin (racun) yang dapat menimbulkan penyakit pada manusia. Misalnya, 10 sel bakteri Escherichia coli yang bersifat sangat membahayakan (extreme virulent) apabila termakan dapat menyebabkanhemorrhagic colitis yang ditandai dengan gejala diare berdarah, dehidrasi moderat, dan sakit perut yang parah (Taufik, 2004).
BAB V
