BAB III METODOLOGI PENELITIAN
3.5 Prosedur Penelitian
3.5.7 Uji Antimikroba
59
3.5.6 Uji Stabilitas Sediaan Formulasi Gel Hand Sanitizer
Formulasi gel dilakukan pengujian stabilitas sediaan gel setelah
diuji mutu fisiknya. Metode pengujian yang dipakai adalah metode
freezethow yaitu sediaan disimpan dalam suhu 4ºC selama 48 jam,
kemudian sediaan dipindahkan kedalam suhu 40ºC selama 48 jam juga dan
inilah yang dinamakan 1 siklus pengujian stabilitas. Pengujian dilanjutkan
sampai 5 siklus dan saat minggu ke-4 formulasi gel dibuat, setiap satu
siklus selesai, dilihat ada tidaknya pemisahan fase atau perubahan, uji pH,
uji daya sebar, daya lekat, sinersis, organoleptik, homogenitas dan uji
viskositas gel (Priyani et al. 2014).
3.5.7 Uji Antimikroba
a. Antibakteri
1) Pembuatan Media Uji Aktivitas Antibakteri
Media yang digunakan dalam peremajaan bakteri E. coli
adalah Eosin Methylen Blue (EMB), S. aureus pada Mannitol Salt Agar
(MSA) danMedia yang digunakan uji aktivitas antibakteri yaitu media
Mueller Hinton Agar (MHA). Pembuatan media EMB dengan
melarutkan 0,0625 gr EMB dengan 25 ml aquades, lalu dihomogenkan
dan dipanaskan hingga mendidih. Selanjutnya media tersebut disterilkan
menggunakan autoklaf dengan suhu 121ºC selama 15 menit. Pembuatan
media MSA dengan melarutkan 2,775 gr MSA dengan 25 ml aquades,
lalu dihomogenkan dan dipanaskan hingga mendidih. Selanjutnya media
60
menit. Media MSA yang sudah disterilkan dituang ke dalam cawan petri
masing-masing sebanyak 25 ml per cawan petri. Pembuatan media MHA
dilakukan dengan cara menimbang media MHA sebanyak 20,9 gr dan
dilarutkan dalam550 ml aquades dalam erlenmeyer. Kemudian
dihomogenkan dan dipanaskan hingga mendidih. Selanjutnya media
tersebut disterilkan menggunakan autoklaf dengan suhu 121ºC selama 15
menit. Media MHA yang sudah disterilkan dituang ke dalam cawan petri
masing-masing sebanyak 25 ml per cawan petri (Fatmawati, 2019).
2) Peremajaan dan Pembuatan Suspensi Bakteri Uji
Peremajaan koloni bakteri uji dilakukan dengan mengambil 1 ose
bakteri uji dari inokulum kultur bakteri, kemudian diinokulasikan
kedalam Media Eosin Methylen Blue (EMB) untuk E. coli dan Mannitol
Salt Agar (MSA) untuk S. aureus, lalu kemudian diinkubasi selama 48
jam pada suhu 37˚C dalam inkubator. Selanjutnya, pembuatan suspensi bakteri dengan cara mengambil 1 ose koloni bakteri uji dari kultur koloni
murni, dimasukkan kedalam larutan NaCl FIsiologis 0,9% sebanyak 5 ml
pada tabung reaksi. Lalu, divortex hingga homogen selanjutnya
kekeruhan suspensi bakteri uji disesuaikan dengan standar 0,5 Mac
Farland (1,5 x 106 CFU/mL) (Angnes, 2016). Jika suspensi melebihi Mac
farland maka dapat diencerkan 100x pada media NaCl FIsiologis 0,9%
sehingga diperoleh konsentrasi fungi 106 sel/ml
61
3) PengujianAktivitas Antibakteri Formulasi Gel Hand sanitizer
Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan dengan
menuangkan suspensi bakteri uji pada cawan petri, kemudian
ditambahkan media MHA dalam cawan petri kondisi aseptis dengan suhu
45-50˚C, cawan petri digoyang angka 8 sehingga pertumbuhan bakteri uji
merata lalu didiamkan sampai memadat. Media kemudian dibuat sumuran
sebanyak 8 sumuran dengan menggunakan boor prop. Sumuran A, B, dan
C diisi dengan gel ekstrak daun sirih hijau (P. betle) dan ekstrak daun
kelor (M. oleifera). Sumuran D digunakan sebagai kontrol positif yakni
menggunakan produk hand sanitizer X. Sumuran E digunakan sebagai
Kontrol negatif diisi dengan pelarut etanol 70%, sumuran nomor F di isi
ekstrak ekstrak daun sirih hijau (P. betle) dan ekstrak daun kelor
(M.oleifera), dan sumuran G diisi sediaan formulasi gel tanpa ekstrak.
Kemudian di inkubasi selama 24 jam pada suhu 37 ºC. Kemudian
dilakukan pengamatan terhadap penghambatan bakteri yakni dengan
menghitung diameter zona bening dengan jangka sorong. Setiap
perlakuan dilakukan sebanyak 5 kali ulangan
b. Antifungi
1) Pembuatan Media Uji Aktivitas Antifungi
Media peremajaan fungi uji adalah Saboraud Dektrosa Agar (SDA)
dan Media yang digunakan dalam uji aktivitas antijamur adalah Mueller
Hinton Agar (MHA). Pembuatan media SDA adalah menimbang 1,625
62
media dihomogenkan dan dipanaskan. Kemudian, media disterilisasi
dalam autoklaf pada suhu 121 ºC, tekanan 2 atm selama 15 menit. Setelah
itu media SDA dituang kedalam tabung reaksi masing-masing 10 ml.
Selanjutnya pembuatan media MHA yaitu menimbang media MHA
sebanyak 10,45 gr dan dilarutkan dalam 275 ml aquades dalam
erlenmeyer. Kemudian dihomogenkan dan dipanaskan hingga mendidih.
Selanjutnya media tersebut disterilkan menggunakan autoklaf dengan
suhu 121ºC selama 15 menit. Media MHA yang sudah disterilkan dituang
ke dalam cawan petri masing-masing sebanyak 25 ml per cawan petri
(Fatmawati, 2019).
2) Peremajaan dan Pembuatan Suspensi Fungi Uji
Peremajaan koloni murni dengan mengambil 1 ose jamur C.
albicansdiinokulasikan kedalam media Saboraud Dektrosa Agar (SDA)
di tabung reaksi, lalu diinkubasi dengan suhu37˚C selama 18-24 jam
(Munawaroh, 2016). Selanjutnya pembuatan suspensi jamur dengan cara
mengambil 1 ose koloni C. albicans dari kultur murni fungi, dimasukkan
kedalam larutan NaCl fisiologis 0,9% sebanyak 5 ml pada tabung reaksi.
Lalu, divortex hingga homogen selanjutnya diukur kekeruhan suspensi
bakteri uji absorbansi 0,12-0,15 (setara dengan 1,5 x 106 CFU/mL) dengan
spektrofotometer pada λ530nm. Jika suspensi melebihi Mac farland maka dapat diencerkan 100x pada media NaCl fisiologis 0,9% sehingga
diperoleh konsentrasi fungi 106 sel/ml (Munawaroh, 2016).
63
Pengujian aktivitas antifungi dilakukan dengan menuangkan
suspensi fungi uji pada cawan petri, kemudian ditambahkan media
Mueller Hinton Agar (MHA) dalam cawan petri kondisi aseptis cawan
petri digoyang angka 8 sehingga pertumbuhan fungi uji merata lalu
didiamkan sampai memadat. Media kemudian dibuat sumuran sebanyak
8 sumuran dengan menggunakan cork borer. Sumuran A, B, dan C diisi
dengan gel ekstrak daun sirih hijau (P. betle) dan ekstrak daun kelor (M.
oleifera). Sumuran D digunakan sebagai kontrol positif yakni
menggunakan produk hand sanitizer X. Sumuran E digunakan sebagai
Kontrol negatif diisi dengan pelarut etanol 70%, sumuran nomor F di isi
ekstrak ekstrak daun sirih hijau (P. betle) dan ekstrak daun kelor (M.
oleifera), dan sumuran G diisi sediaan formulasi gel tanpa ekstrak.
Kemudian di inkubasi selama 24 jam pada suhu 37 ºC. Kemudian
dilakukan pengamatan terhadap penghambatan bakteri yakni dengan
menghitung diameter zona bening dengan jangka sorong. Setiap
perlakuan dilakukan sebanyak 5 kali ulangan.