Untuk mengetahui kestabilan pigmen terhadap
oksidasi maupun cahaya, maka sebelum pigmen
tersebut dicampurkan dengan madu, ataupun bahan lainnya maka kestabilan pigmen itu sendiri harus diketahui. Setelah uji fotostabilitas dilakukan dengan bersamaan dengan pelarut, maka dalam percobaan ini uji foto stabilitas dan oksidasi akan dilakukan tanpa setelah pelarut diuapkan. Jika memungkinkan, akan lebih efektif bila pigmen diukur secara langsung dalam
bentuk serbuk mengingat spektrometer NIR dapat
mengukur sampel baik padat, cair, gel, tablet ataupun serbuk. Jika pigmen diukur secara langsung akan nampak bahwa spektrum pigmen akan didapatkan tanpa harus melakukan perlakuan lebih lanjut. Sampel NIR akan optimal jika ketebalan sampel sekitar10 mm. Untuk menyediakan pigmen yang setebal 10 cm untuk diameter petri sekitar 10 cm tentu saja membutuhkan
percobaan ini dilakukan dengan bantuan pelarut.
Percobaan dilakukan dengan mencampur 25 mg beta karoten dengan 10 ml heksana. Setelah larutan tercampur secara homogen, larutan tersebut kemudian dituangkan kedalam petri. Larutan diuapkan untuk
mendapatkan endapan betakaroten yang merata
diseluruh permukaan petri. Penguapan membutuhkan waktu sekitar 1 jam. Dan endapan kemudian dicek dengan spektrometer NIR untuk memastikan tidak ada larutan heksana yang tertinggal. Oleh karena pigmen tersebut harus diuapkan sekitar satu jam hingga dapat
dihilangkan seluruh pelarutnya. Hal tersebut
memungkinkan adanya pengaruh oksidasi dan juga degradasi pigmen oleh pelarut. Untuk mengetahui perbedaan nya, campuran heksana dan beta karoten yang lain telah disimpan selama satu hari. Berdasarkan gambar pada lampiran dapat terlihat jelas adanya pemucatan warna larutan yang menunjukkan adanya degradasi pigmen.
Gambar 4.4.1 adalah spektrum dari petri kosong.
Spektrum ini perlu diukur untuk mendapatkan
spektrum beta karoten saja. Dari spektrum tersebut terlihat bahwa puncak spektrum melebar dari 4000-4800 cm-1, tanpa ada tambahan ban pada bilangan gelombang lainnya. Setelah seluruh pelarut menguap, spektrum dari beta karoten kemudian diukur.
0,2
0
-0,2
10000 9000 8000 7000 6000 5000 4000
Bilangan gelombang (cm-1)
Gb.4.4.1Spektrum absorban petri kosong
0,2
0
10000 9000 8000 7000 6000 5000 4000
Bilangan gelombang (cm-1)
Gb.4.4.2 Spektrum absorban beta karoten dan petri
Gambar 4.4.2 berikut merupakan spektrum dari beta karoten. Jika dilihat dari bentuk spektrumnya saja, nampak sama dengan petri kosong. Hal tersebut
6500 4000
menunjukkan bahwa kontribusi pigmen yang diukur sangat lemah konsentrasinya. Namun hal tersebut
tidak berarti spektrum beta karoten tidak dapat
diperoleh, dengan mengurangi spektrum beta karoten dengan petri kosong maka didapatkanlah spektrum pada gambar 4.4.3.
0,2
0,1
10000 9000 8000 7000 6000 5000 4000
Bilangan gelombang (cm-1)
Gb.4.4.3 Spektrum absorban beta karoten dengan pembesaran pada area 4000-6500cm-1
Gambar 4.4.3 menunjukkan spektrum beta
karoten tanpa kontribusi dari petri. Puncak kuat pada 4336 cm-1 berhubungan dengan mode vibrasi C-H pada beta karoten. Selain puncak utama, muncul pula beberapa puncak lain yang lebar dan lemah antara lain
puncak pada 5864 cm-1 yang muncul karena
cm-1 nampak kontribusi dari ikatan 0-H hal tersebut menunjukkan bahwa sampel telah teroksidasi. Selain itu, daerah pada bilangan gelombang sekitar 4625 cm-1
muncul karena kontribusi C-H aromatik dan C-H aril. Hasil yang diperoleh pada percobaan ini selaras dengan hasil yang diperoleh pada percobaan menggunakan
pelarut pada sub bab 4.3 Bahwa kontribusi beta
karoten yang terbesar nampak pada bilangan
gelombang sekitar 4334 yang berkaitan dengan ikatan C-H.
Uji stabilitas sampel untuk mengetahui pengaruh cahaya terhadap kestabilan pigmen dilakukan dalam jangka waktu pendek dan panjang. Pendek berarti kurang dari 24 jam dan panjang berarti 8 hari. Jangka waktu ini merupakan pengukuran maksimal yang bisa dilakukan untuk uji stabilitas karena rangkaian yang digunakan untuk penyinaran tidak bisa digunakan
untuk jangka panjang. Setelah hampir 8 hari
pengukuran nonstop lampu akhirnya padam.
Diperkirakan waktu padamnya adalah malam hari, sehingga telah beberapa jam sampel dibiarkan tanpa
penyinaran, sehingga pengukuran sampel harus
diakhiri. Sampel selalu diekspos cahaya dengan intensitas 1800 lux. Saat tidak diukur, sampel ditutup
dengan plastik untuk meminimalisasi pengaruh
0,1
0
untuk memastikan pengukuran selalu dalam kondisi yang sama dan posisi yang sama. Petri juga ditandai seperti berikut ini untuk memastikan petri selalu dimasukan dalam posisi yang sama.
Perilaku yang sama juga diberikan saat
pengukuran sampel untuk mengukur pengaruh
oksidasi. Pengukuran dilakukan selama 17 hari.
4.4.1 Uji fotostabilitas beta karoten
Uji fotostabilitas dilakukan dengan menyinari sampel dengan intensitas cahaya 1800 lux dalam jangka waktu 0 jam (mula-mula), 1 jam, 2 jam, 3 jam, , 4 jam, , 5 jam, 1 hari, 2 hari, 3 hari, 4 hari, 7 hari dan
8 hari. Spektrum yang diperoleh untuk semua
pengukuran dapat dilihat pada gambar 4.4.4 dibawah ini.
10000 9000 8000 7000 6000 5000 4000
Bilangan gelombang (cm-1)
Gb.4.4.4 Spektrum beta karoten setelah disubtraksi Setelah disubtraksi dengan spektrum petri maka
diperolehlah spektrum hasil uji fotostabilitas beta karoten seperti pada gambar 4.5.5. Spektrum dipilih pada area 4000-6500 cm-1 karena area selain tersebut terdapat puncak-puncak spektrum. Seperti yang telah dijelaskan sebelumnya, daerah yang akan diobservasi adalah 4336, 4625, 5195 dan 4625 cm-1.
1
10000 9000 8000 7000 6000 5000 4000
Bilangan gelombang (cm-1)
Gb.4.4.5 Spektrum beta karoten
Untuk mengetahui pengaruh penyinaran
terhadap pigmen, maka akan dilihat intensitas dari puncak masing-masih pengukuran. Hal ini dilakukan karena intensitas pada spektrum absorban mempunyai hubungan linier dengan kandungan pada sampel. Tabel
berikut ini menunjukkan urutan intensitas pada
masing-masing pengukuran dimulai dari intensitas tertinggi menuju intensitas terendah.
Tabel 1 Urutan intensitas (dari tinggi ke rendah) hasil uji fotostabilitas pada panjang bilangan gelombang tertentu.
Urutan ke
Bilangan gel (cm-1)
4336 4625 5195 5864
1 0 jam 0 jam 0 jam 0 jam
2 1 jam 1 jam 1 jam 1 jam
3 3 jam 4jam 4jam 4jam
4 4jam 5jam 5jam 5jam
5 5jam 3 jam 3 jam 3 jam
6 2 hari 2 hari 2 hari 2 hari
7 4 hari 4 hari 4 hari 4 hari
8 3 hari 3 hari 3 hari 3 hari
9 7hari 7hari 7hari 7hari
10 1 hari 1 hari 1 hari 1 hari
11 8hari 8hari 8hari 8hari
Dari hasil tersebut menunjukkan bahwa urutan intensitas yang diperoleh tidak beraturan. Fotostabilitas pigmen tidak dapat diamati dengan menggunakan cara yang digunakan pada percobaan ini. Dalam usaha untuk uji fotostabilitas nampaknya bahwa terdapat pengaruh oksigen. Oleh karena itu, dalam percobaan selanjutnya akan diuji tentang kestabilan pigmen terhadap pengaruh oksigen.
4.4.2 Uji pengaruh oksidasi beta karoten
Uji oksidasi dilakukan dengan meletakkan
sampel pigmen di ruangan pengukuran sehingga
sampel dapat terekspos dengan udara disekitar nya. Uji pengaruh oksidasi ini dilakukan dalam jangka waktu 1, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 17 dan 18 hari. Spektrum yang diperoleh sebelum dikurangi spektrum petri dapat
dilihat pada gambar 4.4.6. dan spektrum hasil pengurangan dengan petri pada gambar 4.4.7
0,3 0 10000 9000 8000 7000 6000 5000 4000 Bilangan gelombang (cm-1) 0,13 0,10
Gb.4.4.6 Spektrum beta karoten pada uji oksidasi sebelum dikurangi petri
10000 9000 8000 7000 6000 5000 4000
Bilangan gelombang (cm-1)
Gb.4.4.7 Spektrum beta karoten pada uji oksidasi setelah dikurangi petri
Gambar 4.4.7. menunjukkan bahwa spektrum hasil pengaruh oksidasi ini nampak sama dengan uji
fotostabilitas. Puncak-puncak yang sama dengan
antara lain puncak kuat pada 4334 cm-1 (C-H)dan puncak-puncak lemah dan luas pada daerah sekitar 5872 (C-H metil), 5211(0-H) dan 4655 cm-1 (C-H aril). Hal tersebut menunjukkan bahwa uji oksidasi pun tidak lepas dari pengaruh cahaya. Sehingga dalam kedua uji pengaruh satu sama lain tidak terelakkan.
Salah satu yang menjadi alasan adalah ruang
penyimpanan pigmen tidak sepenuhnya ruang gelap. Masih ada beberapa cahaya yang masuk pada sela-sela
ruangan tersebut. Untuk mengetahui pengaruh
oksidasi terhadap pigmen maka intensitas
masing-masing pengukuran akan dibandingkan. Intensitas
diurutkan dari terbesar menuju terkecil. Hasilnya dapat dilihat pada tabel 1 dibawah ini.
Tabel 2Urutan intensitas dari tinggi ke rendah pada uji oksidasi pada panjang gelombang tertentu.
Urutan ke
Bilangan gel (cm-1)
4334 4655 5211 5872
1 1 hari 1 hari 1 hari 1 hari
2 10 hari 10 hari 10 hari 10 hari
3 11 hari 11 hari 11 hari 11 hari
4 14 hari 17 hari 17 hari 17 hari
5 17 hari 7 hari 7 hari 7 hari
6 7 hari 13 hari 13 hari 13 hari
7 13 hari 14 hari 14 hari 14 hari
8 18 hari 18 hari 18 hari 18 hari
Berdasarkan urutan tersebut nampak bahwa pada uji pengaruh oksidasi ini tidak nampak korelasi linier antara penambahan durasi oksidasi dengan kandungan pada spektrum. Secara garis besar dapat
disimpulkan bahwa dengan cara yang digunakan,
pengaruh oksidasi dan cahaya tidak dapat diamati dengan baik. Ada beberapa hal yang menjadi alasan ketidak berhasilan pengukuran ini, antara lain: 1. sampel tidak sepenuhnya terisolasi dari pengaruh
cahaya dan oksigen; 2. Ketebalan sampel dalam
pengukuran kurang dari 10 mm sehingga kontribusi pigmen dalam spektrum dirasa lemah; 3. alat yang digunakan untuk fotostabilitas kurang efektif; 4. Ada
kemungkinan pengaruh panas selain oksigen dan
cahaya.
Langkah berikutnya untuk percobaan ini adalah pencampuran beta karoten dengan madu untuk diuji
fotostabilitas nya. Hasil penelitian sebelumnya
menunjukkan bahwa hasil pencampuran madu dan
pigmen tadi tidak dapat digunakan untuk
mendapatkan spektrum murni pigmen. Salah satu penyebabnya adalah belum ditemukannya cara untuk mencampur madu secara homogen. Selain itu, sistem untuk pengukuran fotostabilitas dan oksidasi perlu diperbaiki. Untuk penelitian lebih lanjut perlu dipikirkan beberapa cara yang lebih efektif untuk
mengekstrak pigmen, pencampuran pigmen dan uji stabilitas maupun oksidasi pigmen. Penelitian yang
telah penulis lakukan adalah suatu percobaan
pendahuluan yang perluuntuk diteruskan dan