3.3 Metode Penelitian
3.3.4 Uji Kelompok Senyawa Kimia
Pengujian untuk mengetahui kelompok senyawa kimia yang terdapat pada ekstrak aktif meliputi uji ninhidrin untuk menentukan adanya asam amino bebas, Molish untuk menentukan adanya karbohidrat dalam suatu bahan, Lieberman Burchard untuk menentukan adanya steroid dalam suatu bahan, Bradford untuk mengetahui adanya protein dalam suatu bahan. Uji ini dilakukan dengan terlebih dulu masing-masing ekstrak ditimbang sebanyak 0,1 gr kemudian dilarutkan dalam masing-masing pelarut sebanyak 5 ml (Bintang, 1999). Selain itu juga dilakukan uji alkaloid, saponin, flavonoid, steroid (Harborn 1987).
3.3.4.1 Uji Ninhidrin
Uji ninhidrin dilakukan untuk menentukan adanya asam amino bebas dalam suatu bahan. Ninhidrin bereaksi dengan asam amino bebas (gugus amida) membentuk senyawa berwarna ungu, sedangkan dengan prolin dan hidroksiprolin ninhidrin berwarna kuning. Cara pengujian adalah sebagai berikut : ekstrak aktif Atactodea striata 1 ml dimasukkan kedalam tabung reaksi dan dibubuhi larutan ninhidrin 1 ml, lalu dipanaskan dalam penangas air mendidih selama 5 menit. Bila terlihat warna ungu berarti positif. Uji ini dilakukan secara duplo.
Pada prinsipnya asam amino bebas akan terhidrolisis melalui proses pemanasan dengan terputusnya ikatan karbon yang mengikat gugus amida (-NH2) dan gugus karbonil (-COOH) sehingga ninhidrin akan mengisi kekosongan elektron (bereaksi) pada gugus amida dan membentuk senyawa berwarna ungu sebagai indikasi adanya asam amino bebas pada bahan yang diuji.
3.3.4.2 Uji Molish
Uji ini adalah uji umum untuk menentukan adanya karbohidrat dalam suatu bahan. Karbohidrat akan dipecah oleh asam sulfat pekat menjadi gugus furfural yang akan bereaksi dengan sulfonat alfa-naftol membentuk senyawa berwarna ungu. Pereaksi Molish terdiri atas alfa-naftol 5% dalam etanol 95% yang selalu dibuat segar. Uji ini dilakukan secara duplo. Cara pengujiannya kedalam 1 ml ekstrak dibubuhi 2 tetes pereaksi Molish lalu ditambahkan asam sulfat pekat
melalui dinding tabung secara hati-hati. Bila terbentuk lapisan berwarna ungu, berarti positif mengandung karbohidrat karena terjadi reaksi kondensasi antara furfural dengan alfa-naftol. Bila tidak ada karbohidrat maka akan berwarna hijau.
Pada umumnya monosakarida stabil dalam larutan asam yang encer walaupun dipanaskan, tetapi apabila dipanaskan dengan asam kuat yang pekat seperti asam sulfat pekat, monosakarida membentuk gugus furfural sebagai reaksi dehidrasi atau pelepasan molekul air dari senyawanya. Gugus furfural yang terbentuk akan memberikan warna ungu bila bereaksi dengan alfa naftol, sehingga reaksi ini dapat dijadikan sebagai reaksi pengenal untuk karbohidrat.
3.3.4.3 Uji Bradford
Uji ini untuk mengetahui adanya protein dalam suatu bahan. Cara pengujiannya adalah ekstrak 1 ml dimasukkan kedalam tabung kemudian ditambah dengan 1 ml pereaksi Bradford. Tabung ditutup rapat dengan parafilm dan dikocok dengan cara membalikkan tabung perlahan-lahan beberapa kali. Kemudian didiamkan selama lima menit atau paling lama satu jam. Bila terbentuk warna biru, berarti positif mengandung protein.
Protein merupakan molekul kompleks yang terdiri dari asam-asam amino dan dihubungkan dengan ikatan peptida. Secara umum, rumus molekul protein terdiri atas sebuah atom karbon (C) yang mengikat sebuah gugus ami da (-NH2), sebuah gugus karboksil (COO-), sebuah atom hidrogen (H) dan sebuah gugus alkil (R). Apabila sebuah molekul protein diberi pereaksi bradford yang terdiri dari larutan kupriasetat dan asam asetat dalam air maka ion logam (Cu) akan direduksi oleh protein (gugus COO-) sehingga terbentuk Cu2O yang diindikasikan dengan terbentuknya warna biru.
3.3.4.4 Uji Alkaloid
Cuplikan sampel ditambah kloroform dan beberapa tetes amonia. Fraksi kloroform dipisahkan dan diasamkan dengan 10 tetes H2SO4 2M. Fraksi asam diambil kemudian ditambahkan pereaksi Dragendorf, Meyer, dan Wagner. Adanya alkaloid ditandai dengan terbentuknya endapan putih untuk pereaksi Meyer, endapan merah untuk pereaksi Dragendorf dan endapan coklat untuk pereaksi Wagner.
Menurut Suradikusumah (1989), alkaloid umumnya dinyatakan sebagai senyawa basa yang mengandung satu atau lebih atom nitrogen yang merupakan bagian dari sistem siklik. Atom nitrogen ini hampir selalu dalam bentuk gugus amina atau amida. Substituen oksigen umumnya dalam bentuk gugus fenol (-OH), metoksil (-OCH3) atau metilendioksi (-O2CH3). Penggunaan pereaksi Dragendorf, Meyer dan Wagner didasarkan pada reaksi oksidasi yang mana logam-logam pada pereaksi merupakan oksidator ya ng membawa elektron sehingga terlepasnya atom H misalnya dari gugus OH dan selanjutnya berikatan dengan gugus amina atau amida yang diindikasikan dengan terbentuknya warna. Warna yang terbentuk tergantung pada logam yang terdapat pada pereaksinya, misalnya Iodida pada pereaksi Dragendorf akan memberikan warna merah.
Beberapa pereaksi pengendapan digunakan untuk memisah-misahkan jenis alkaloid. Pereaksi sering didasarkan pada kesanggupan alkaloid untuk bergabung dengan logam yang memiliki berat atom tinggi seperti merkuri, bismut, tungsten, atau jood. Pereaksi Meyer mengandung kalium jodida dan merkuri klorida, pereaksi Dragendorf mengandung bismut nitrat dan merkuri klorida dalam asam nitrit berair, pereaksi Burchard mirip dengan pereaksi Wagner dan mengand ung kalium jodida dan jood. Berbagai pereaksi tersebut menunjukkan perbedaan yang besar dalam hal sensitivitas terhadap gugus alkaloid yang berbeda (Sastrohamidjojo 1996).
3.3.4.5 Uji Saponin
Sampel sebanyak 1 gr ditambahkan air secukupnya selanjutnya dipanaskan pada air mendidih (water bath) selama 5 menit. Setelah proses pemanasan, larutan didinginkan kemudian dikocok. Jika timbul busa yang bertahan lebih dari 10 menit menunjukkan adanya saponin.
Busa yang terbentuk secara stabil pada larutan cair disebabkan karena bahan yang diekstrak mengandung surfaktan yaitu senyawa glikosida yang berfungsi sebagai detergen alami. Biasanya saponin memiliki satu atau lebih monosakarida yang mudah terhidrolisis dengan panas dan dalam keadaan dingin bila dikocok mudah membentuk busa yang stabil (Rao 1996).
3.3.4.6 Uji Flavonoid
Sampel sebanyak 1 gr ditambahkan metanol 30% sampai sampel terendam kemudian dipanaskan sampai didapatkan filtrat yang pekat. Setelah pemanasan, filtrat yang diperoleh ditaruh ke dalam papan uji (spot plate), kemudian ditambahkan H2SO4. Jika pada penambahan asam sulfat terbentuk warna merah maka positif mengandung flavonoid.
Flavonoid merupakan golongan senyawa yang memiliki kerangka karbon terdiri dari dua gugus C6 (cincin benzena tersubstitusi) disambungkan oleh rantai alifatik tiga-karbon. Penambahan metanol 30 % kemudian dipanaskan akan memudahkan reduksi asam sulfat pekat menghasilkan warna merah pada flavonol, flavanon, flavanonol dan xanton (Robinson 1995).
3.3.4.7 Uji Triterpenoid dan Steroid
Uji Lieberman Burchard dilakukan berdasarkan asetilasi 3 β hidroksi oleh asam anhidrida dalam H2SO4. Ester asetil 3 β hidroksi sterol yang mengandung ikatan ganda didalam asam akan mengalami epimerisasi menjadi bentuk 3α dan reaksi eliminasi yang menimbulkan produk berwarna. Uji triterpenoid ditandai dengan warna ungu atau merah, sedangkan steroid warna hijau atau biru. Sampel sebanyak 2 gr ditambahkan 25 ml etanol 30% kemudian dipanaskan (50oC) dan disaring. Filtrat yang diperoleh diuapkan, selanj utnya ditambahkan eter. Lapisan eter yang terbentuk dipipet dan diletakan pada papan uji (spot plate) kemudian ditambah pereaksi Lieberman Burchard (3 tetes asam asetat anhidrin dan 1 tetes H2SO4 pekat), selanjutnya diamati warna yang terbentuk.