BAHAN DAN METODE
3.7 Uji Konfirmasi 1 Uji Hematolog
Pemeriksaan darah ikan uji (kontrol dan perlakuan) dilakukan setelah penginfeksian virus dan timbul gejala klinis VNN dengan metode Benjamin (1978). Sampel darah yang telah diberi antikoagulan EDTA diambil untuk pemeriksaan hemoglobin (Hb), hematokrit (PCV), eritrosit dan leukosit serta pembuatan apusan darah. Pengambilan darah dilakukan di caudal pudancle karena dekat dengan tulang yang mengarah ke jantung.
Penentuan hemoglobin dilakukan dengan cara memasukkan Working Reagent ke dalam 2 cuvet sebanyak 2,5 ml. Sampel dimasukkan ke dalam cuvet pertama, dan akuades ke dalam pada cuvet ke dua sebagai blank masing-masing 10 µ l, lalu masing- masing campuran dihomogenkan dan dibiarkan selama tiga menit pada temperatur kamar. Untuk menentukan jumlah hemoglobin digunakan alat spektrofotometer, dimana spektrofotometer terlebih dahulu dinolkan dengan blank, kemudian dimasukkan nilai faktor hemoglobin. Sampel dimasukkan dan dibaca hasilnya pada panjang gelombang 540 nm.
Pemeriksaan hematokrit (PCV) dilakukan dengan memasukkan darah ke dalam hematocrit tube sebanyak 2/3 atau 3/4 tabung dan ujungnya ditutup dengan lilin, disentrifugasi pada 11.000 rpm selama 4 - 5 menit. Setelah selesai, tabung ditempatkan pada microhematocrit reader untuk melihat nilai hematokrit.
Pemeriksaan eritrosit dilakukan dengan mengisap sampel darah dengan menggunakan pipet eritrosit sampai mencapai angka 0,5. Ujung pipet dibersihkan dengan tissue. Setelah dibersihkan larutan Hayem dihisap sampai tanda 101 dengan cepat dan tanpa menimbulkan gelembung udara. Pipa penghisap (aspirator) dilepaskan. Lalu diaduk sampai bagian yang tercampur hanya bagian yang membesar dari pipet. Cairan pada ujung pipet yang tidak ikut terkocok dibuang. Suspensi darah diteteskan pada bagian pinggir gelas penutup kamar hitung, dimana tetes 1 - 2 dibuang terlebih dahulu. Sel darah merah dihitung pada kotak menengah di bagian tengah kamar hitung sebanyak lima kotak, dimana empat kotak di bagian sudut dan satu kotak di bagian tengah. Hasil perhitungan akhir (HPA) yaitu jumlah seluruh sel darah merah dari lima kotak tersebut (n butir) dikalikan 10.000 per ml. (HPA= n x 10.000)
Pemeriksaan leukosit dilakukan dengan mengisap sampel darah dengan menggunakan pipet penghisap (aspirator) sampai mencapai angka 0,5. Ujung pipet dibersihkan dengan kapas. Larutan Turk dihisap sampai tanda 11 dengan cepat dan tanpa menimbulkan gelembung udara. Aspirator dilepaskan, diaduk sampai bagian yang tercampur hanya bagian yang membesar dari pipet. Cairan pada ujung pipet yang tidak ikut terkocok dibuang. Suspensi darah diteteskan pada bagian pinggir gelas penutup kamar hitung, dimana tetes 1 - 2 dibuang terlebih dahulu. Sel darah putih dihitung pada empat kotak besar pada bagian pinggir kamar hitung. Hasil perhitungan akhir (HPA) yaitu jumlah seluruh sel darah putih dari lima kotak tersebut (n butir) dikalikan 40 per ml. (HPA= n x 40)
Gambar 2. Kamar Hitung Improved Neubauer (Zaneveld et al., 1977)
3.7.2 Uji Histopatologi
Perubahan histopatologi (akibat yang ditimbulkan virus VNN terhadap organ otak ikan uji dilihat dengan cara pembuatan preparat/slide jaringan kontrol dan perlakuan). Menurut Suntoro (1983), dengan metode parafin adalah fiksasi, pencucian (washing), dehidrasi, penjernihan (clearing), infiltrasi parafin, penanaman (embedding), pemotongan (sectioning), penempelan (affiksing), deparafinasi, pewarnaan (staining), penutupan dan pemberian label (mounting and labelling).
Sampel organ (otak) yang telah dicuci dengan larutan NaCl 0,95%. Kemudian sampel dimasukkan ke dalam larutan fiksatif Buffer Neutral Formalin (BNF) 10% selama 2 - 10 jam tergantung dari macam jaringan dan tebal/tipisnya jaringan. Setelah otak difiksasi, otak dicuci (washing) dengan menggunakan alkohol 70% yang berguna untuk menghilangkan larutan fiksasi dari jaringan. Proses dehidrasi, otak dimasukkan ke dalam alkohol secara bertahap, dengan alkohol 30, 50, 60, 70, 80, 90, 96% dan alkohol absolut masing-masing selama 1 jam. Botol yang berisi otak tersebut digoyang-goyangkan terus menerus (shaker) agar proses dehidrasinya lebih cepat. Setelah dehidrasi, segera dilakukan proses penjernihan (clearing), dengan menggunakan perbandingan alkohol:xylol yaitu dengan perbandingan 1:3, 1:1, 3:1 masing-masing 1 jam, berakhir di xylol murni. Proses infiltrasi parafin seluruhnya dikerjakan di dalam oven dengan suhu 56-60 0C, menggunakan perbandingan xylol:parafin 3:1, 1:1, 1:3 dan berakhir di parafin murni masing-masing selama 1 jam. Proses ini dimaksudkan untuk menghindari perubahan lingkungan yang sangat
mendadak terhadap jaringan tersebut. Sebelum melakukan penanaman (embedding), otak dimasukkan ke dalam parafin cair yang mempunyai titik cair yang sama dengan parafin yang digunakan untuk infiltrasi selanjutnya kotak-kotak karton yang disediakan untuk tempat penanaman, ukurannya sesuai dengan besar/kecil jaringan. Parafin cair dituang ke dalam kotak tersebut, lalu otak diambil dengan pinset dan diletakkan ke dalam kotak yang telah berisi parafin tadi, selanjutnya parafin dibiarkan hingga menjadi keras (blok parafin). Setelah terbentuk blok parafin, blok tersebut ditempel/dilekatkan pada holder yang terbuat dari kayu yang berbentuk persegi.
Penyatan blok parafin dilakukan dengan menggunakan mikrotom putar. Biasanya untuk jaringan hewan pada umumnya tebal irisan adalah 6 µ m. Penyayatan dari blok parafin akan diperoleh berupa pita-pita parafin. Pita parafin yang diperoleh kemudian ditempatkan pada gelas benda yang telah ditetesi albumin-meyer. Selanjutnya pita parafin ditetesi beberapa tetes akuades agar pita parafin merentang. Gelas benda diletakkan pada hot-plate, dan dibiarkan hingga kering. Proses penempelan (affiksing) ini telah selesai dan dapat dimulai dengan pewarnaan (staining). Deparinasi dilakukan dengan gelas benda yang telah berisi irisan jaringan tadi direndam ke dalam xylol sekurang-kurangnya 15 menit. Selanjutnya jaringan dicelupkan ke dalam alkohol absolut, 96, 80, 70, 50, 30% dan akuades masing-masing selama 1 menit. Jaringan dimasukkan ke dalam larutan Hematoxylin-Eosin Ehrlich selama 3 - 7 detik selanjutnya jaringan dicuci dengan air mengalir selama 10 menit, lalu jaringan dicuci dengan akuades. Jaringan dimasukkan ke dalam larutan pewarna eosin 0,5% dalam alkohol 70% selama 1 - 3 menit, preparat jaringan dimasukkkan berturut-turut ke dalam alkohol 60, 70, 80, 90, 96%, dan alkohol absolut, selama 1 menit. Selanjutnya preparat dimasukkan ke dalam xylol selama 10 menit. Preparat diangkat dari xylol dan diolesi dengan Canada balsam, yang selanjutnya jaringan ditutup dengan gelas penutup. Sediaan histologis diberi label dan ditulis nama jaringan, potongan, pewarnaan yang digunakan ataupun tanggal pembuatan, kemudian diamati di bawah mikroskop.
3.7.3 Uji Reverse Transcriptase Polimerase Chain Reaction (RT-PCR)
Sampel ikan (20 mg sampel otak, atau 20 mg sampel mata) dimasukkan ke dalam tabung mikro 1,5 ml kemudian sampel dilarutkan dengan 500 µl RNA Extraction Solution. Sampel digerus sampai hancur, diamkan pada suhu kamar selama 5 menit. Sampel ditambahkan 100 µl CHCl3, kemudian vortex 20 detik. Sampel dibiarkan pada suhu kamar selama 2 - 3 menit, lalu sentrifugasi pada 12000 rpm selama 15 menit. Sampel dipipet 200 µl dari fase atas (bagian jernih) ke dalam tabung mikro 0,5 ml dengan 200 µl 2-propanol (isopropanol, IPA). Vortex sebentar, lalu sampel disentrifugasi pada 12000 rpm selama 10 menit, isopropanol tersebut dibuang. Sampel dicuci dengan 0,5 ml etanol 75%, kemudian spin down 9000 rpm selama 5 menit untuk mendapatkan pelet RNA, kemudian tuang etanol dan pelet dikeringkan. Pelet dilarutkan dengan 200 µl air DEPC (dd H2O).
Amplikasi dilakukan dengan menyiapkan campuran RT-PCR dan Nested PCR dibutuhkan sesuai jumlah sampel. Untuk setiap campuran reaksi, perlu mempertimbangkan 3 standar positif (103, 102 dan 101) dan 1 kontrol negatif (ddH2O atau ragi tRNA). Pipet 8 µl campuran reaksi reagen RT-PCR ke masing-masing tabung reaksi (0,2 ml). Masing-masing campuran reaksi ditambahkan 2 µl ekstrak sampel RNA atau standar, lalu dimasukkan ke dalam thermal cycle untuk proses amplikasi tahap 1 (RT-PCR). Setelah tahap 1 selesai, reagen Nested PCR ditambahkan sebanyak 15 µl untuk setiap tabung, lalu dilakukan proses amplikasi tahap 2 (Nested PCR). Setelah selesai, Nested PCR tambahkan 5 µl 6X loading dye untuk masing-masing tabung reaksi dan aduk rata. Setelah pencampuran, sampel siap untuk elektroforesis.
Gel agarose 2% (2 gram agarose dilarutkan dengan 100 ml TAE 1x) dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer. Larutan dipanaskan menggunakan microwave, sampai mendidih dan berubah menjadi bening. Gel agarose didinginkan pada temperatur kamar sampai temperatur sekitar 50 oC dan perlahan-lahan gel dituangkan ke dalam kotak gel dengan ketinggian gel agarose sekitar 0,5 - 0,3 cm, dan total ketebalan disarankan untuk tidak lebih besar dari 0,8 cm. Sisir plastik (blocker)
dimasukkan ke dalam gel agarose. Blocker diangkat pada kedua sisi kotak gel saat gel agarose di dalam benar-benar memadat, kemudian dapat dilakukan proses elektroforesis. Buffer elektroforesis 1X dimasukkan ke dalam kotak gel sampai tuas penyangga hanya menutupi gel. Sampel ditambahkan 8 µl ke dalam sumur satu per satu. Marker dimasukkan ke sumur pertama sebanyak 5 µl, dan kontrol negatif ke sumur kedua, diikuti dengan sampel dan terakhir kontrol positif (IQ 2000, 2003). Running pada tegangan 100 - 150 Volt. Elektroforesis dihentikan bila warna biru gelap mendekati 1/2 untuk 2/3 dari gel. Kemudian, gel dikeluarkan dari kotak gel untuk mempersiapkan prosedur EtBr pewarnaan.
Pewarnaan dilakukan dengan memasukkan 10 µl Ethidium Bromida (EtBr) ke dalam 100 ml akuades. Agarose hasil elektroforesis direndam dengan larutan EtBr ke dalam wadah plastik selama 10 menit dan sesekali digoyang. Agarose dikeluarkan dan dicuci dengan akuades steril di dalam wadah plastik selama 10 menit. Gel diletakkan pada pertengahan transilluminator gelombang UV untuk membaca akhir hasil.