BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
G. Uji Potensi Antibakteri Ekstrak Etanol Daun M. tanarius
Uji potensi antibakteri ekstrak etanol daun M. tanarius dilakukan dengan metode difusi sumuran. Ekstrak dilarutkan dalam aquadest steril dengan seri konsentrasi 5%, 10%, 20%, 40%, dan 80% yang. Penentuan seri konsentrasi ekstrak mengacu pada penelitian yang sudah dilakukan oleh Lim, et al., (2009). Dalam penelitian tersebut, digunakan ekstrak daun M. tanarius yang disari
menggunkan metanol 100% dengan konsentrasi ekstrak 1%. Pada penelitian ini konsentrasi ekstrak yang digunakan dimulai dari konsentrasi 5%. Perbedaan metode pengeringan, ekstraksi dan jenis penyari dengan penelitian sebelumnya dapat memberikan hasil yang berbeda, oleh karena itu konsentrasi pada penelitian ini ditingkatkan. Berdasarkan hasil orientasi, konsentrasi 80% adalah konsentrasi tertinggi ekstrak dapat larut dalam aquadest, sehingga konsentrasi 80% digunakan sebagai konsentrasi tertinggi.
Media yang digunakan dalam penelitian ini adalah media NA. Media NA dipilih karena memiliki kandungan nutrisi yang lengkap bagi pertumbuhan bakteri. Kandungan nutrisi tersebut antara lain pepton, NaCl, yeast extract, dan beef extract. Media ini dapat digunakan untuk berbagai jenis mikroorganisme (Atlas, 1996). Pada penelitian ini digunakan kontrol negatif aquadest yang merupakan pelarut ekstrak dan kontrol positif amoxicillin 25 mg/ml. Kontrol negatif digunakan untuk melihat apakah aquadest sebagai pelarut turut memberikan pengaruh pada zona hambat yang terbentuk. Sedangkan kontrol positif yang digunakan Amoxicilin dipilih karena sering digunakan dalam pengobatan kasus radang tenggorokan yang disebabkan oleh bakteri. Selain itu, menurut teori Amoxicilin dapat menghambat pertumbuhan bakteri S. pyogenes (Finch, Greenwood, Norrby, and Whitley, 2010). Antibiotik ini merusak lapisan peptidoglikan yang menyusun dinding sel bakteri Gram positif maupun Gram negatif. Mekanisme kerjanya dengan mencegah ikatan silang peptidoglikan pada tahap akhir sintesis dinding sel, yaitu dengan menghambat protein pengikat penisilin yang terlibat dalam penambahan asam amino yang berikatan dengan
peptidoglikan dinding sel bakteri dan mencegah aktivitas enzim transpeptidase yang membungkus ikatan silang polimer gula yang membentuk dinding sel sehingga dinding sel menjadi rapuh dan mudah lisis (Pratiwi, 2009).
Dalam penelitian ini dilakukan replikasi sebanyak tiga kali, dari setiap replikasi tersebut dilakukan repetisi tiga kali. Dari hasil pengamatan didapatkan zona hambat yang diukur menggunakan jangka sorong dengan satuan milimeter (mm). Pengukuran dilakukan secara vertikal, horizontal dan diagonal, kemudian dari tiga kali pengukuran tersebut hasilnya dirata-rata. Hasil pengukuran zona hambat ekstrak etanol daun M. tanarius terhadap bakteri S. pyogenes disajikan secara lengkap dalam Lampiran 9.
Gambar 24. Hasil uji difusi ekstrak daun M. tanarius terhadap Streptococcus pyogenes dengan metode difusi sumuran
Keterangan : A = Konsentrasi 80% B = Konsentrasi 40% C = Konsentrasi 20% D = Konsentrasi 10% E = Konsentrasi 5% + = Amoxicilin 25mg/ml - = aquadest steril
Hasil pengukuran zona hambat ekstrak etanol daun M. tanarius terhadap bakteri S. pyogenes diringkas dalam Tabel IV.
Tabel IV. Hasil pengukuran zona hambat dalam milimeter (mm)
Konsentrasi Replikasi 1 (Mean±SD) Replikasi 2 (Mean±SD) Replikasi 3 (Mean±SD) Total (Mean±SD) 5 13±0,81 12±0,05 12±0,18 12±0,84 a 10 14±0,95 13±0,68 14±0,24 14±0,50 a 40 18±0,53 17±0,43 18±1,40 18±0,28 b Kontrol + 24±2,40 27±2,84 25±2,97 25±1.61 c Kontrol - 6 6 6 6 d Keterangan:
*Repetisi tiap replikasi sebanyak 3 kali *Diameter lubang sumuran 6 mm
*Angka-angka yang diikuti oleh huruf sama, berbeda tidak bermakna berdasarkan uji T tidak berpasangan pada taraf p<0,05
Berdasarkan data tersebut, zona hambat yang ditunjukkan berasal dari kemampuan ekstrak. Pelarut tidak memberikan pengaruh terhadap zona hambat yang terbentuk, ditunjukkan dengan nilai kontrol negatif yang seluruhnya bernilai nol ketika sudah dikurangi lubang sumuran. Data zona hambat yang didapatkan selanjutnya dilakukan analisis hasil secara statistik. Analisis hasil secara statistik bertujuan untuk melihat adanya potensi antibakteri ekstrak etanol daun M. tanarius terhadap bakteri S. pyogenes. Data dianalisis normalitas distribusi menggunakan uji Shapiro Wilk. Royston (1995), mengatakan bahwa jumlah data antara 3 hingga 5000 dapat dianalisis menggunakan Shapiro Wilk. Dari uji Shapiro Wilk didapatkan hasil data tidak terdistribusi normal (Lampiran 10). Data yang tidak normal, yaitu konsentrasi 20% dan 80% tidak diikut sertakan dalam analisis statistik selanjutnya. Selanjutnya dilakukan uji Levene untuk mengetahui variasi data (Lampiran 11). Pada hasil uji Levene didapatkan variasi data homogen
(p>0,05) sehingga dapat dilanjutkan uji Anava Satu Arah untuk mengetahui berbeda bermakna. Berdasarkan uji Anava Satu Arah didapatkan nilai p<0,05 sehingga terdapat data yang berbeda bermakna secara statistik (Lampiran 12).
Untuk mengetahui kelompok data yang memiliki perbedaan bermakna maka dilakukan uji T tidak berpasangan yang didahului uji varian. Uji varian berguna untuk melihat variansi antar 2 kelompok data. Nilai p<0,05 menunjukkan variansi kedua kelompok tidak homogen sedangkan nilai p>0,05 menunjukkan variansi kedua kelompok homogen (Lampiran 13). Setelah uji varian dilanjutkan uji T tidak berpasangan antar dua kelompok data dimana nilai p<0,05 menunjukkan berbeda bermakna antar dua kelompok data. Berdasarkan hasil uji T tidak berpasangan didapatkan hampir seluruh kelompok data berbeda bermakna, kecuali antara konsentrasi 5% dengan 10% (Lampiran 14).
Berdasarkan hasil analisis statistik tersebut antara kelompok konsentrasi uji dengan kontrol negatif berbeda bermakna. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun M. tanarius memiliki potensi daya antibakteri terhadap S. pyogenes. Selain itu, antar variasi konsentrasi uji juga berbeda bermakna, maka menunjukkan semakin besar konsentrasi uji memberikan aktivitas antibakteri yang berbeda pula. Namun pada konsentrasi 5% dengan 10% menunjukkan hasil statistik berbeda tidak bermakna. Hal ini menunjukkan konsentrasi 5% memiliki kemampuan yang sama dengan konsentrasi 10% dalam penghambatan bakteri S. pyogenes.
Pada perbandingan antara kelompok konsentrasi uji dengan kontrol positif didapatkan hasil statistik berbeda bermakna. Artinya aktivitas antibakteri
yang ditunjukkan ekstrak etanol daun M. tanarius tidak sebesar antibakteri dari Amoxicilin. Hal ini dapat disebabkan karena ekstrak merupakan campuran dari berbagai senyawa, dimana senyawa yang aktif sebagai antibakteri bercampur dengan senyawa yang tidak aktif sebagai antibakteri. Dapat pula senyawa tersebut bercampur dengan senyawa yang bersifat antagonis sehingga meniadakan aktivitas antibakteri atau dapat juga bercampur dengan senyawa yang sinergis namun jumlahnya tidak cukup untuk memberikan aktivitas antibakteri. Perlu penelaahan lebih lanjut untuk mengetahui kandungan senyawa yang memiliki aktivitas antibakteri dan interaksi kandungan senyawa yang terdapat dalam ekstrak. Selain itu, adanya kemungkinan difusi senyawa terhalangi sehingga tidak dapat memberikan aksi penghambatan. Sedangkan Amoxicilin yang merupakan turunan penisilin telah lama terbukti memiliki daya antibakteri dengan spektrum luas. Senyawa yang terkandung didalamnya telah terisolasi menjadi senyawa tunggal serta telah melalui berbagai pengujian sehingga efek penghambatannya teruji.
Menurut David (cit., Moerfiah dan Supomo, 2011), ketentuan antibakteri sebagai berikut :
1. Sangat kuat (diameter zona hambat ≥20 mm) 2. Kuat (diameter zona hambat 10-20 mm) 3. Sedang (diameter zona hambat 5-10 mm) 4. Lemah (diameter zona hambat ≤ 5 mm)
Berdasarkan ketentuan tersebut zona hambat yang terbentuk ketika sudah dikurangi lubang sumuran (6 mm) termasuk dalam kekuatan antibakteri sedang
hingga kuat yakni rata-rata 6 hingga 13 mm. Kontrol positif Amoxicilin termasuk dalam kekuatan antibakteri kuat karena memiliki rata-rata 19 mm (Lampiran 9).
Gambar 25. Diagram rata-rata diameter zona hambat ekstrak etanol daun M. tanarius terhadap bakteri S. pyogenes
Aktivitas antibakteri yang muncul dikarenakan kandungan senyawa fenolik, flavonoid, tanin dan saponin yang terkandung dalam ekstrak daun M. tanarius. Turunan fenol berinteraksi dengan sel bakteri melalui proses adsorpsi yang melibatkan ikatan hidrogen. Pada kadar rendah terbentuk kompleks protein fenol dengan ikatan lemah dan segera mengalami peruraian, diikuti penetrasi fenol ke dalam sel dan menyebabkan prespitasi serta denaturasi protein. Pada kadar tinggi fenol menyebabkan koagulasi protein dan sel membran mengalami lisis (Parwata dan Dewi, 2008). Senyawa fenolik memiliki mekanisme kerja dalam menghambat pertumbuhan bakteri dengan cara inaktivasi protein (enzim) pada membran sel. Fenol berikatan dengan protein melalui ikatan hidrogen sehingga mengakibatkan struktur protein menjadi rusak. Dimana sebagian besar struktur dinding sel dan membran sitoplasma bakteri mengandung protein dan lemak. Ketidakstabilan pada dinding sel dan membran sitoplasma bakteri menyebabkan
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 kontrol - 5 10 40 kontrol + Diameter Zona Hambat (mm±SD)
Konsentrasi Ekstrak Etanol Daun M. tanarius
Rata-rata Diameter Zona Hambat
Rata-rata Diameter Zona Hambat
fungsi permeabilitas selektif, fungsi pengangkutan aktif, pengendalian susunan protein dari sel bakteri menjadi terganggu yang akan berakibat pada lolosnya makromolekul dan ion dari sel, sehingga sel bakteri menjadi kehilangan bentuknya dan terjadilah lisis (Susanti, 2008).
Flavonoid bersifat antibakteri karena mampu berinteraksi dengan DNA bakteri. Hasil interaksi ini menyebabkan terjadinya kerusakan permeabilitas dinding sel bakteri, mikrosom, dan lisosom. Ion hidroksil secara kimia menyebabkan perubahan komponen organik dan transpor nutrisi sehingga menimbulkan efek toksik terhadap sel bakteri (Sabir, 2003). Cincin B pada flavonoid dapat menyebabkan interkalasi atau ikatan hidrogen dengan susunan asam nukleus basa, hal ini menjelaskan aksi penghambatan pada sintesis DNA dan RNA pada bakteri. Aktivitas antibakteri dari flavonoid juga dilakukan dengan pengurangan fluiditas membran pada sel bakteri dan penghambatan metabolisme energi pada bakteri (Cushnie and Lamb, 2005).
Mekanisme tanin menghambat bakteri belum dijelaskan secara jelas, namun Akiyama, et al., (2001) meringkas mekanisme antimikroba dari tanin yaitu, (i) zat astringent pada tanin dapat menginduksi kompleksasi dengan enzim dan substrat, berbagai enzim mikrobial mengalami penghambatan ketika dicampur dengan tanin, (ii) toksisitas tanin erat kaitannya dengan aksi pada membran mikroorganisme, dan (iii) kompleksasi logam ion pada tanin dapat merusak membran sitoplasma dari bakteri. Aktivitas biologis tanin mungkin ditentukan oleh konfigurasi spasial dari gugus ortho- phenolic hydroxyl. Tanin telah terbukti mengganggu integritas membran karena menyebabkan kebocoran
dari liposom. Aktivitas tanin lebih rendah pada bakteri Gram negatif oleh adanya lipopolisakarida pada permukaan sel bakteri Gram negatif. Hal ini menyebabkan bakteri Gram positif lebih sensitif terhadap efek bakterisida tanin dibanding bakteri Gram negatif (Smith, Imlay, and Mackie, 2003).
Saponin memiliki sifat seperti deterjen dan mungkin meningkatkan permeabilitas membran sel bakteri tanpa menghancurkan bakteri tersebut. Secara teori, hal ini mungkin memfasilitasi masuknya zat antibakteri melalui membran dinding sel bakteri Saponin dapat mengganggu permeabilitas pada lapisan terluar membran. Pada bakteri Gram negatif, lapisan terluar membran dilapisi oleh lipopolisakarida. Saponin hanya berikatan pada bagian Lipid A dan dapat meningkatkan permeabilitas membran pada bakteri Gram negatif (Arabski et al., 2012). Hardiningtyas (cit., Pranoto, Ma’ruf, dan Pringgenies, 2012) menambahkan, saponin merupakan golongan senyawa yang dapat menghambat atau membunuh mikroba dengan cara berinteraksi dengan membran sterol. Efek utama saponin terhadap bakteri adalah adanya pelepasan protein dan enzim dari dalam sel.
H. Penentuan KHM dan KBM Ekstrak Etanol Daun M. tanarius