HASIL DAN PEMBAHASAN A.Determinasi Tanaman
F. Uji Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba
Uji sitotoksisitas dilakukan untuk mengetahui layak atau tidaknya suatu senyawa digunakan sebagai senyawa antikanker. Dipilih metode MTT karena metode ini cukup baik, mudah, cepat, akurat, tidak menggunakan bahan radioaktif, dan sensitif karena mampu menghitung jumlah sel yang sedikit.
32
sel Myeloma sel Vero Gambar 1. Sel Myeloma dan Sel Vero tanpa perlakuan
Pada penelitian ini, seri kadar yang digunakan sebanyak 11 konsentrasi dengan konsentrasi tertinggi 200 µg/ml dan konsentrasi terendah 0,20 µg/ml. Absorbansi dari sel diukur pada panjang gelombang 550 nm. Semakin banyak sel yang masih hidup maka akan semakin banyak intensitas warna ungu yang dihasilkan. Hal ini akan berbanding lurus dengan nilai absorbansi yang terbaca pada ELISA Reader.
i i
ii ii
sel Myeloma sel Vero
Gambar 2. Sel Myeloma dan sel Vero yang diberi perlakuan fraksi protein daun mimba
keterangan: (i) sel myeloma yang hidup (ii) sel myeloma yang mati
Pada penelitian dilakukan pula pengukuran absorbansi pada perlakuan tanpa sel yang akan digunakan sebagai faktor koreksi untuk mengurangi adanya pengaruh fraksi protein yang berwarna terhadap absorbansi. Dengan adanya faktor koreksi ini diharapkan absorbansi yang terbaca merupakan absorbansi yang sebenarnya yang dihasilkan oleh sel yang tetap hidup setelah pemberian senyawa uji tanpa adanya pengaruh dari warna senyawa uji yang digunakan. Hasil uji sitotoksisitas yang diperoleh yaitu berupa persen kematian sel yang didapatkan dengan menggunakan modifikasi rumus Abbot, tampak pada tabel berikut ini.
Tabel II. Hasil uji sitotoksisitas fraksi protein terhadap sel Myeloma Rata-rata Persen Kematian Sel ( % ) Konsentrasi fraksi protein daun mimba (µg/ml) FP30 FP40 FP50 FP60 0,20 46,88 40,40 52,67 48,13 0,39 52,49 45,83 50,62 50,09 0,78 49,76 44,92 47,79 47,26 1,56 51,84 43,84 46,65 48,34 3,13 57,22 49,08 47,48 48,45 6,25 69,25 43,22 45,10 47,95 12,5 52,51 51,70 47,23 50,29 25 62,46 63,85 50,71 55,62 50 82,07 76,51 52,92 69,37 100 91,64 86,99 67,84 75,75 200 90,20 89,52 82,60 85,66
34
Grafik konsentrasi vs % Kematian Sel Myeloma 30 40 50 60 70 80 90 100 0.20 0.39 0.78 1.56 3.13 6.25 12.50 25.00 50.00 100.00 200.00
Konsentrasi fraksi protein % Kematian fp 30% fp 40% fp 50% fp 60% FP30 FP60 FP50 FP40
Gambar 3. Persen kematian sel myeloma vs konsentrasi fraksi protein daun mimba
Dari tabel II dan gambar 3 dapat dilihat bahwa terdapat hubungan yang linier antara konsentrasi fraksi protein daun mimba dengan persen kematian sel Myeloma. Hal tersebut dapat dibuktikan dengan semakin tingginya konsentrasi fraksi protein daun mimba maka semakin tinggi pula persen kematian sel Myeloma. Namun pada grafik FP30, terlihat persen kematian sel yang naik turun seiring dengan kenaikan konsentrasi fraksi protein daun mimba. Terdapat banyak kemungkinan yang bisa menyebabkan hal tersebut antara lain yaitu digunakannya subyek uji berupa sel yang pertumbuhan dan kematiannya dipengaruhi oleh banyak faktor. Kematian sel tidak hanya disebabkan karena perlakuan dengan fraksi protein daun mimba, akan tetapi dapat pula disebabkan karena proses kematian alami sel. Kemungkinan lain yang dapat terjadi yaitu karena pengaruh kondisi penelitian dimana uji ini sangat rentan terhadap kontaminasi lingkungan.
Tabel III. Hasil uji sitotoksisitas fraksi protein terhadap sel Vero Rata-rata Persen Kematian Sel ( % ) Konsentrasi fraksi protein daun mimba (µg/ml) FP30 FP40 FP50 FP60 0,20 63,66 82,75 56,37 59,73 0,39 68,93 79,64 58,01 65,33 0,78 67,71 85,06 52,51 58,44 1,56 69,34 75,84 64,14 59,39 3,13 76,81 77,03 63,26 68,72 6,25 82,06 70,07 75,08 70,29 12,5 78,38 66,81 85,41 72,59 25 85,49 79,22 76,59 75,00 50 90,60 85,14 72,48 75,29 100 79,88 75,42 73,79 85,57 200 89,50 74,41 71,88 84,35
Grafik konsentrasi vs % Kematian Sel Vero 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 0.20 0.39 0.78 1.56 3.13 6.25 12.50 25.00 50.00 100.00 200.00
Konsentrasi fraksi protein % Kematian fp 30% fp 40% fp 50% fp 60% FP30 FP50 FP40 FP60
36
Dari tabel III dan gambar 4 dapat dilihat bahwa persen kematian sel naik turun sehingga tidak dapat ditarik suatu korelasi yang dapat menyatakan aktivitas sitotoksik dari fraksi protein daun mimba yang digunakan. Seperti halnya yang terjadi pada sel myeloma, kematian sel vero yang naik turun tersebut kemungkinan disebabkan karena adanya kematian alami sel dan kondisi penelitian.
Selanjutnya ditentukan nilai LC50 yang dilakukan dengan analisa probit menggunakan SPSS 13. Penentuan nilai LC50 ini bertujuan untuk mengetahui ketoksikan fraksi protein daun mimba terhadap sel myeloma dan sel vero. Dari hasil pengolahan data, diperoleh harga LC50 sebagai berikut ini.
Tabel IV. Harga LC50 fraksi protein daun mimba pada sel myeloma
Fraksi protein Harga LC50 (µg/ml)
FP30 0,714
FP40 2,040
FP50 1,885
FP60 1,486
Tabel V. Harga LC50 fraksi protein daun mimba pada sel vero
Fraksi protein Harga LC50 (µg/ml)
FP30 0,014
FP40 > 1 g/ml
FP50 0,033
Semakin kecil harga LC50 maka senyawa semakin bersifat toksik, sebaliknya semakin besar harga LC50 maka semakin bersifat tidak toksik (Meyer
et al, 1982). Dari data di atas dapat dilihat bahwa pada sel myeloma, nilai LC50
paling kecil dimiliki oleh FP30, yang berarti FP30 bersifat sangat toksik. Suatu senyawa dikatakan memiliki aktivitas sebagai antikanker bila memiliki nilai LC50 lebih kecil dari 20 µg/ml (Suffness and Pezzuto, 1991). Apabila dilihat dari nilai LC50; FP30, FP40, FP50 dan FP60 memiliki nilai LC50 lebih kecil dari 20 µg/ml, sehingga bisa dikembangkan sebagai senyawa antikanker.
Sedangkan untuk sel vero, nilai LC50 paling kecil juga dimiliki oleh FP30, yang berarti fraksi protein tersebut bersifat sangat toksik. Namun pada FP50
dan FP60 juga memberikan nilai LC50 yang tidak jauh berbeda dengan nilai LC50 FP30. Dari data di atas dapat dilihat bahwa fraksi protein daun mimba juga bersifat toksik pada sel vero. Hal ini dapat menjadi penghambat untuk mengembangkan fraksi protein daun mimba sebagai senyawa antikanker. Dilakukan pula uji Kolmogorov-Smirnov yang bertujuan untuk membandingkan tingkat kesesuaian sampel dengan suatu distribusi tertentu. Hasil dari uji Kolmogorov-Smirnov menunjukkan bahwa semua fraksi protein baik pada sel myeloma maupun sel vero memiliki distribusi normal (α > 0,05).
Selanjutnya dilakukan penghitungan nilai r pada taraf kepercayaan 95%. Untuk sel myeloma diperoleh hasil bahwa pada semua fraksi (FP30, FP40, FP50 dan FP60) memiliki kolerasi yang linier antara konsentrasi dengan persen kematian (rhitung > rtabel), sedangkan pada sel vero hanya FP40 saja yang tidak memiliki kolerasi yang linier antara konsentrasi dengan persen kematian (rhitung < rtabel).
38
Dilakukan pengolahan data dengan statistik uji T sampel independen (independent-samples T Test) untuk melihat perbedaan antara persen kematian sel Myeloma dengan sel Vero karena pemaparan fraksi protein daun mimba. Pada FP30, FP50, dan FP60 menunjukkan bahwa LC50 sel Myeloma berbeda bermakna dengan LC50 sel Vero (sig. < 0,05), yang berarti terdapat perbedaan respon antara sel Myeloma dengan sel Vero karena adanya fraksi protein daun mimba. Hal tersebut memungkinkan FP30, FP50, dan FP60 untuk dikembangkan sebagai senyawa antikanker. Akan tetapi apabila membandingkan nilai LC50 antara sel Myeloma dengan sel Vero, FP30, FP50, dan FP60 tidak memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai senyawa antikanker. Hal tersebut dapat dibuktikan dengan melihat nilai LC50 pada sel vero yang nilainya lebih kecil daripada pada sel myeloma yang berarti bahwa FP30, FP50, dan FP60 bersifat lebih toksik terhadap sel vero (sel normal) daripada terhadap sel myeloma (sel kanker).
FP40 menunjukkan bahwa LC50 sel Myeloma berbeda tidak bermakna dengan LC50 sel Vero. Hal ini berarti fraksi protein daun mimba FP40 memiliki kemampuan yang sama untuk menginduksi kematian sel Myeloma dan sel Vero sehingga FP40 diduga tidak dapat dikembangkan sebagai antikanker.
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN