19 IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.2. Uji Spesifisitas
Uji spesifisitas dilakukan dengan membandingkan waktu retensi antara standar kolesterol, sampel telur dan sampel telur yang diberi tambahan standar kolesterol. Berikut adalah gambar hasil injeksi standar kolesterol pada konsentrasi 1014 µg/mL (Gambar 9.). Diketahui bahwa kolesterol terdeteksi dan memiliki waktu retensi pada menit ke 1,53.
20
Gambar 9. Hasil injeksi standar kolesterol 1014 µg/mL.Spesifisitas analisis kolesterol menggunakan instrumen HPLC-ELSD dilakukan dengan mengukur pada sampel telur dan sampel telur yang ditambahkan standar kolesterol. Pengujian sampel telur tanpa penambahan standar kolesterol (Gambar 10.) dan sampel telur dengan penambahan 507 µg/mL kolesterol standar (Gambar 11.), diketahui bahwa pada menit ke 1,5 terbentuk peak. Hal tersebut menunjukkan bahwa kolesterol yang ditandai dengan kemunculan peak yang sama dengan standar kolesterol (pada menit ke 1,5). Peak yang terbentuk memiliki baseline yang tidak merata, dimungkinkan karena adanya komponen sterol lain yang ikut seperti fosfatidiletanolamin, fosfatidilserin,. fosfatidilkolin dan spingomielin.
21
Gambar 11. Hasil injeksi sampel yang ditambahkan kolesterol standar 507 µg/mL.4.3. Linieritas Metode
Pengujian linieritas motede analisis kolesterol menggunakan instrumen HPLC – ELSD menghasilkan kurva linieritas yang proporsional. Semakin tinggi konsentrasi kolesterol standar yang ditambahkan akan semakin tinggi dan luas peak-nya.
Konsentrasi kolesterol standar yang ditambahkan pada pengukuran linieritas ini berkisar antara 50 µg/g sampel hingga 3000 µg/g sampel. Hasil pengukuran linieritas metode dapat dilihat pada Lampiran 1. yang kemudian di plotkan kedalam sebuah kurva linieritas metode pada Gambar 12. Berdasarkan kurva tersebut dihasilkan linieritas dengan persamaan y = 35,85x – 4088 yang mempunya nilai R² sebesar 0,997. Dengan nilai R² tersebut menunjukkan bahwa metode analisis kolesterol menggunakan HPLC-ELSD ini memiliki linieritas yang baik, karena R² telah melebihi 0,99 (EMA 1995).
Gambar 12. Kurva linieritas metode analisis kolesterol dengan adisi standar ke dalam sampel menggunakan HPLC-ELSD.
Hasil uji linieritas metode yang dilakukan, menunjukkan nilai R2 yang lebih baik apa bila dibandingkan dengan dengan metode yang dilakukan oleh Osman dan Chin (2006). Penelitian yang dilakukan Osman dan Chin nilai R2 pada metode ekstraksi Bohac adalah 0,993, metode Beyer & Jensen adalah 0,9897, dan metode Queensland Health Science Institute mencapai 0,9411 (Tabel 10.).
y = 35,58x - 3140, R² = 0,997 0 50000 100000 150000 200000 0 2000 4000 6000 Lu a s A re a ( m V. s)
22
Ketiga metode tersebut menggunakan istrumen HPLC UV-VIS detector dengan 8 kali ulangan. Hal ini menunjukkan bahwa metode yang menggunakan HPLC-ELSD menghasikan nilai linieritas yang lebih baik. Hal ini sejalan dengan penelitian yang dilakukan oleh Avalli dan Contarini (2005), yang menyatakan bahwa HPLC-ELSD dapat menghasilkan respon yang linier untuk mengukur phospholipid di dalam produk susu.Tabel 10. Perbandingan hasil uji linieritas penulis dengan penelitian Osman dan Chin (2006).
Peneliti Metode Ektraksi Instrumen Hasil uji
Linieritas (R2)
Penulis AOAC 976.26 HPLC -ELSD 0,997
Osman dan Chin Bogac HPLC-UV VIS 0,993
Beyer & Jensen HPLC-UV VIS 0,9897
Queensland Health Science Institute HPLC-UV VIS 0,9411
4.4 Limit Deteksi Instrumen
Limit kuantitatif adalah batas konsentrasi terendah yang dapat dideteksi oleh alat. Pengujian ini pertama-tama dilakukan dengan penginjeksian kolesterol standar dari konsentrasi 10,14 μg/mL hingga 1014 μg/mL. Hasil dari pengukuran ini kemudian di plotkan kedalam sebuat kurva standar hubungan antara konsentrasi kolesterol standar dengan luas area yang dihasilkan persamaan y = 3,195x – 106,8 dengan R2 = 0,997. Diketahui bahwa pada konsentrasi 10,14 μg/mL dan 25,35 μg/mL, tidak dapat dideteksi oleh HPLC-ELSD. Kolesterol dapat dideteksi mulai pada konsentrasi 50,7 μg/mL hingga 1014 μg/mL. Dapat disimpulkan bahwa konsentrasi kolesterol terendah yang dapat dideteksi oleh HPLC-ELSD adalah 50,7 μg/mL. Data selengkapnya dapat dilihat pada Gambar 13 dan terlampir pada Lampiran 2A.
Gambar 13. Kurva standar kolesterol 10,14 – 1014,00 μg/mL tanpa menggunakan matriks telur ayam. Berdasarkan gambar tersebut diketahui bahwa konsentrasi kolesterol terendah yang dapat dideteksi oleh HPLC-ELSD adalah 50 μg/mL. Pengujian LDI dilanjutkan dengan 7 kali penginjeksian standar kolesterol pada konsentrasi 50 μg/mL yang hasilnya dapat dilihat pada Tabel 11.
y = 3,195x - 106,8 R² = 0,997 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 0 200 400 600 800 1000 1200 Lu a s A re a ( m V .s )
23
Tabel 11. Hasil pengukuran LDI* pada konsentrasi kolesterol 50 μg/mL.Ulangan Konsentrasi Kolesterol Standar (μg/mL) Konsentrasi Kolesterol yang Terbaca (μg/mL) 1 50 49,1201 2 50 49,6587 3 50 49,7881 4 50 49,0934 5 50 49,5216 6 50 49,5988 7 50 48,8351 Rata-Rata 49,3737 SD 0,36 RSD (%) 0,72 LDI (µg/mL) 1,07 LOQ** hitung (µg/mL) 3,57
Ket : * LDI = Limit Deteksi Instrumen ** LOQ = Limit of Quantitation
Limit Kuantitasi (LOQhitung) merupakan batas terendah konsentrasi kolesterol yang dapat
dilaporkan, di bawah konsentrasi ini disebut sebagai ‘tidak terdeteksi’ (Harmita 2004). Nilai LOQhitung
ini bila dibandingkan dengan penelitian Oasman dan Chin (2006) (Tabel 12.), jauh lebih baik. Data- data tersebut memiliki nilai RSD yang cukup besar dibandingkan dengan penggunaan instrumen HPLC-ELSD.
Tabel 12. Perbandingan hasil uji LDI dan LOQ penulis dengan Osman dan Chin (2006).
Peneliti Instrumen LDI (µg/mL) LOQhitung (µg/mL)
Penulis HPLC-ELSD 1,07 3,57
Osman dan Chin (2006) Spektrofotometer 14 15
HPLC-UV 0,08 0,60
GC 4,00 13
4.5. Rekoveri dan Ripitabilitas
Rekoveri dilakukan pada tiga konsentrasi spiking yang berbeda yaitu rendah (50 µg/g sampel), sedang (250 µg/g sampel) dan tinggi (3000 µg/g sampel). Hasil uji rekoveri pada analisis kolesterol ditampilkan pada Tabel 13, Tabel 14, dan Tabel 15. Nilai rekoveri ini diperoleh dengan menggunakan persamaan dari kurva linieritas spiking standar pada Lampiran 3, dimana persamaan yang diperoleh adalah y = 35,58x – 3140 dengan nilai R² sebesar 0,997.
Rekoveri menunjukkan keakuratan hasil analisis yang diperoleh adalah 122,13% untuk konsentrasi spiking rendah. Dimana nilai ini tidak sesuai dengan AOAC (1993) yang tertera pada Tabel 5. ialah antara 80 hingga 110%. Untuk rekoveri pada konsentrasi spiking sedang memperoleh keakuratan sebesar 108,23% dan telah sesuai dengan AOAC (1993) yang tertera pada Tabel 5. ialah antara 90 hingga 107%. Uji rekoveri konsentrasi spiking tinggi hanya memperoleh keakuratan sebesar 44,71%, dimana nilai ini berada dibawah AOAC (1993) yang tertera pada Tabel 5 ialah antara 95
24
hingga 105%. Adanya perbedaan hasil yang diperoleh dengan nilai perhitungan yang seharusnya didapat (sistematik error). Pengukuran kolesterol dengan menggunakan HPLC-ELSD, hanya dapat dilakukan untuk sampel yang memiliki konsentrasi dibawah 3000 µg/g sampel.Tabel 13. Hasil uji rekoveri pada konsentrasi spike rendah (50 µg/g).
Ulangan Kolesterol yang
Ditambahkan (μg/g)
Jumlah Kolesterol Standar
yang Terbaca (μg/g) Rekoveri (%)
1 50 57,53 115,14 2 50 61,11 122,33 3 50 62,86 125,90 4 50 63,34 126,87 5 50 57,84 115,83 6 50 65,90 131,97 7 50 58,39 116,87 Rata-Rata 60,9957 122,1302 SD 3,21 RSD (%) 5,26
Tabel 12. Hasil uji rekoveri pada konsentrasi spike sedang (250 µg/g).
Ulangan Kolesterol yang
Ditambahkan (μg/g)
Jumlah Kolesterol Standar
yang Terbaca (μg/g) Rekoveri (%)
1 250 275,77 109,31 2 250 253,28 100,33 3 250 263,85 104,60 4 250 270,61 107,29 5 250 277,42 110,03 6 250 288,37 114,31 7 250 282,07 111,77 Rata-Rata 273,0542 108,2354 SD 11,72 RSD (%) 4,29
Tabel 13. Hasil uji rekoveri pada konsentrasi spike tinggi (3000 µg/g).
Ulangan Kolesterol yang
Ditambahkan (μg/g)
Jumlah Kolesterol Standar
yang Terbaca (μg/g) Rekoveri (%)
1 3000 1569,52 52,58 2 3000 1392,04 46,63 3 3000 1147,45 38,47 4 3000 1341,82 44,97 5 3000 1381,48 46,32 6 3000 1251,98 41,95 7 3000 1253,92 42,06 Rata-Rata 1334,0306 44,7118 SD 134,84 RSD (%) 10,11
25
Ripitabilitas ditunjukkan dengan hasil RSD analisis yang diperoleh adalah 5,26% untuk konsentrasi spiking rendah. Dimana nilai ini telah sesuai dengan AOAC (1993) yang tertera pada Tabel 6. adalah maksimal 7,3%. Untuk ripitabilitas pada konsentrasi spiking sedang memperoleh nilai RSD sebesar 4,29% dan telah sesuai dengan AOAC (1993) yang tertera pada Tabel 6. adalah maksimal 5,3%. Uji ripitabilitas konsentrasi spiking tinggi hanya memperoleh nilai RSD sebesar 10,11%, dimana nilai ini berada diatas AOAC (1993) yang tertera pada Tabel 6 adalah maksimal 3,7%.Tidak memenuhinya persyaratan uji ripitabilitas pada konsentrasi spiking tinggi, dimungkinkan karena adanya kesalahan acak analisis. Penelitian yang dilakukan oleh Osman dan Chin (2006), pengukuran uji rekoveri hanya dilakukan pada satu konsentrasi spiking yaitu pada konsentrasi 300 µg/mL kolesterol standar. Dengan nilai konsentrasi yang terbaik dicapai pada metode Bohac dengan instrumen HPLC UV-VIS yang mencapai nilai rekoveri 96,67% dengan RSD 7,50%. Hal ini menunjukkan bahwa metode HPLC-ELSD yang telah dilakukan oleh peneliti memiliki nilai rekoveri yang lebih baik yang ditunjukkan dengan nilai RSD yang lebih rendah dari metode yang telah dilakukan oleh Osman dan Chin (2006).
4.6.
Method Detection Limit (MDL)
Uji MDL merupakan kelanjutan dari uji rekoveri dengan memplotkan nilai SD pada setiap konsentrasi kedalam sebuah kurva hubungan antara konsentrasi standar kolesterol yang ditambahkan dengan SD. Hasil uji MDL pada tiga konsentrasi yang berbeda dapat dilihat pada Gambar 13. Dari hasil persamaan y = 0,042x + 0,741 dengan nilai R2 sama dengan 1, diperoleh SD0 (x = 0) yaitu 0,741 µg/g. Nilai MDL dihitung sebesar tiga kali SD0 ialah 2,30 µg/g, dimana nilai ini lebih rendah dari
LOQhitung (3,57 µg/mL). Hal ini menunjukkan bahwa metode yang digunakan memiliki tingkat
sensitivitas yang baik karena dapat mendeteksi kolesterol dalam maktriks hingga pada konsentrasi 2,30 µg/g.
Gambar 14. Kurva uji MDL dalam analisis kolesterol menggunakan instrumen HPLC-ELSD.
4.7. Intra Reprodusibilitas
Hasil uji intra reprodusibilitas dapat dilihat pada Tabel 14. Berdasarkan tabel tersebut diketahui bahwa RSD yang dihasilkan adalah 0,04%, nilai ini telah memenuhi batas keterimaannya
y = 0,044x + 0,768 R² = 1 0 20 40 60 80 100 120 140 0 1000 2000 3000 S D ( µ g/ g)
26
adalah ≤ 5,30%. Hasil ini menunjukkan ba hwa metode yang telah dilakukan memiliki nilai keterulangan yang baik pada selang waktu tertentu. Setelah di uji T, diketahui bahwa andar kedua ulangan tersebut tidak berbeda nyata.Tabel 14. Hasil uji intra reprodusibilitas analisis kolesterol pada telur dengan HPLC-ELSD. Bulan ke- Hasil analisis (μg/g)* Rata-rata hasil analisi
(μg/g) SD RSD Thitung
1 564,27 562,68 2,25 0,40 0,4079**
2 561,09
Ket: * = rata-rata dari 3 ulangan analisis ** = tidak berbeda nyata
27
V. KESIMPULAN DAN SARAN
5.1. Kesimpulan
Hasil validasi metode analisis kolesterol menggunakan HPLC–ELSD dengan matriks sampel telur yaitu uji linieritas pada rentang 0 – 5000 µg/g sampel menghasilkan R2 sebesar 0,997; LDI dan LoQhitung yang dihasilkan adalah 1,07 µg/mL dan 3,56 µg/mL; hasil uji rekoveri pada konsentrasi spiking rendah (50 µg/g sampel) adalah 122,13%, konsentrasi spiking sedang (250 µg/g sampel) adalah 108,23%, dan konsentrasi spiking tinggi (3000 µg/g sampel) adalah 44,71%; hasil uji ripitabilitas pada konsentrasi spiking rendah (50 µg/g) adalah 5,26%, konsentrasi spiking sedang (250 µg/g) adalah 4,29%, dan konsentrasi spiking tinggi (3000 µg/g ) adalah 10,11%; nilai MDL yang diperoleh adalah 2,30 µg/g; dan hasil uji intra reprodusibilitas adalah 0,04 %.
Berdasarkan hasil tersebut di atas dapat disimpulkan bahwa metode analisis kolesterol menggunakan HPLC–ELSD dengan matriks sampel telur adalah valid untuk konsentrasi kolesterol uji ≤ 3000 µg/g sampel. Metode tersebut dapat digunakan untuk analisis rutin di laboratorium pengujian.
5.2.
Saran
Validasi metode perlu dilakukan dengan menggunakan matrik sampel telur yang berasal dari hewan yang berbeda ataupun dengan sumber matriks sampel lainnya seperti daging dan ikan. Pemisahan antar peak belum sempurna, hal ini dapat diatasi dengan menurunkan laju alir fase gerak, sehingga memisahan antar peak akan lebih sempurna.
28
DAFTAR PUSTAKA
Agullós E., Gelós S. 1996. Gas-liquid chromatographic determination of total and free cholesterol in egg pastas. Bromatology, Department of Chemistry and Chemical Engineering, Universidad National de1 Sur, Avenida Alem 1253, 8000 Bahia Blanca, Argentina.
Almatsir S. 2001. Prinsip Dasar Ilmu Gizi. Jakarta: PT. Gramedia Pustaka Utama. Anton M. 2007. Bioactive Egg Compounds. Berlin: Springer.
Arifin MB. 2005. Kandungan Lemak, Kolesterol Daging serta Penampilan Ayam Broiler Umur 3 Minggu sampai 8 Minggu yang diberi Makan Daun Katuk (Sauropus androgynus) dalam Ransumnya [skripsi]. Bogor: Departemen Ilmu Nutrisi dan Teknologi Pakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor.
Astawan M. 2008. Telur Asin, Aman dan Penuh Gizi
[26 Desember 2010].
Avalli A., Contarini G. 2005. Determination of phospholipids in dairy products by SPE/HPLC/ELSD. Journal of Chromatography A, 1071: 185-190.
Bender AE., Bender DA. 2001. Food Tables & Labeling. London: Oxford.
Bischoff. 2011. HPLC Analysis.
2011)
Cunha SC., Oliveira MBPP. 2006. Discrimination of vegetable oils by triacylglycerols evaluation of profile using HPLC/ELSD. Journal Food Chemistry, 95: 518-524.
[EMA] The European Agency for the Evaluation of Medical Products. 1995. ICH. Topic Q2B.
Validation of Analytical Procedures: Methodology.
Pharmacontract.ch/support/pdf-support/Q2a.pdf [2 November 2010]
[EURECHEM] Working Group. 1998. The Fitness for Purpose of Analytical Methods –A Laboratory Guide to Methods Validation and related Topics.
Graeve M., Janssen D. 2009. Improved separation and quantification of neutral and polar lipid classes by HPLC-ELSD using a monolithic silica phase: Application to exceptional marine lipids. Journal of Chomatography B, 877: 1815-1819.
Hadi, A.2007. Pemahaman dan Penerapan ISO/IEC 17025:2005. PT Gramedia Pustaka Utama: Jakarta
Harmita. 2004. Petunjuk pelaksanaan validasi metode dan perhitungannya. Majalah Ilmu Kefarmasian, 1(3): 117-135.
Hart H. 2003. Kimia Organik suatu Kuliah Singkat. Jakarta: Erlangga.
Huber L. 2001. Validation of Analytical Methods. www. Labcompliance.com. [8 Oktober 2010] Letter WS. 1992. A Rapid Method for Phospholipid Class Separation by HPLC using an Evaporative
Light-Scattering Detector. Journal of Liquid Chrommatography, 15 (2): 253-266.
Megoulas NC, Koupparis MA. 2005. Development and validation of a novel HPLC/ELSD method for the direct determination of tobramycin in pharmaceuticals, plasma, and urine. Anal Bioanal Chem 382: 290-296.
29
Min DB., Steenson DF. 1998. Crude Fat Analysis. Di dalam Food Analysis 3rd Editions. SS. Nielsen(ed). Maryland: Aspen Publisher, Inc.
Meyer LH. 1966. Food Chemistry, 4th ed. New York: Reinhold Publishing Corp.
Muchtadi D, Palupi NS, Astawan M. 1993. Metabolisme Zat Gizi. Jilid II. Jakarta: Pustaka Sinar Harapan.
Osman H., Chin YK. 2006. Comparative Sensitivities of Cholesterol Analysis using GC, HPLC and Spectrophotometric Methods. The Malaysian Journal of Analytical Sciences, 10 (2): 205- 210.
Pasaribu N. 2004. Minyak Buah Kelapa Sawit. Universitas Sumatera Utara, Jurusan Kimia, Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan.
Rahayu IHS. 2003. Karakteristik Fisik, Komposisi Kimia dan Uji Organoleptik Telur Ayam Merawang dengan Pemberian Pakan Bersuplemen Omega-3. Jurnal Teknologi dan Industri Oangan, XIV (3): 199-205.
Ranganna S. 1979. Manual of Analysis of Fruit and Vegetable Produck. New York: Tata Mc. Graw Hill Publ. Co., Ltd.
[SNI] Standar Nasional Indonesia. 2002. 01-3741-2002 Minyak Goreng. Badan Standar Nasional. Soeka YS., Sulistyo J., Naiola E. 2008 Analisis Biokimia Minyak Kelapa Hasil Ekstraksi Secara
Fermentasi. BIODIVERSITAS, 9(2): 91-95.
USDA. 2011. Cholesterol High Avoid. http: www.dietaryfiberfood.com/cholesterol_high_avoid.php . [10 Feb 2011].
Wardiny TM. 2006.Kandungan Vitamin A, C dan Kolesterol Telur Ayam yang Diberi Mengkudu (Morindra citrifolia) dalam Ransum [tesis]. Bogor: Program Pasca Sarjana, Institut Pertanian Bogor.