Metode residu pada daun. Ekstrak atau fraksi dilarutkan dalam campuran pengemulsi metanol, aseton, dan Tween 80 (5:5:2) kemudian diencerkan dengan akuades hingga volume yang diinginkan (konsentrasi akhir metanol + aseton + Tween 80 1,2%). Pada pemantauan fraksinasi ekstrak P. retrofractum dan T. vogelii dengan KVC, setiap fraksi diuji pada konsentrasi 0,1%–0,5% dan pada pemisahan fraksi aktif T. vogelii dengan KK, setiap fraksi diuji pada konsentrasi 0,01%- 0,1%.
Daun brokoli berukuran 4 cm x 4 cm dicelupkan dalam emulsi ekstrak perlakuan dan kontrol (campuran akuades, pelarut, dan pengemulsi) hingga basah
* KVC, CH2Cl2; CH2Cl2: EtOAc (9:1); EtOAc; MeOH *KLT, kloroform:dietil eter (19:1) * Penggabungan bercak dengan Rf sama
Gambar 1 Skema prosedur ekstraksi dan fraksinasi ekstrak buah P. retrofarctum
Serbuk buah
Piper retrofractum (150 g)
+ EtOAc, disaring, diuapkan
Fraksi CH2Cl2 (1,8884 g) Fraksi CH2Cl2: EtOAc (6,9401 g) Fraksi EtOAc (1,2748 g) Fraksi MeOH (1,0149 g) Fr 1 Fr 2 Fr 5 Fr 6 Ekstrak kasar 13 g Ekstrak kasar (15,86 g) Fr 2 Fr 2+ Fr 3 Fr 4 Fr 3
Gambar 2 Skema prosedur ekstraksi dan fraksinasi ekstrak daun T. vogelii
Ekstrak heksana daun
Tephrosia vogelii (9 g) * KVC, CH2Cl2; CH2Cl2: EtOAc (9:1); EtOAc; MeOH Fraksi CH2Cl2 (6,7877 g) Fraksi CH2Cl2: EtOAc (0,3954 g) Fraksi EtOAc (0,4090 g) Fraksi MeOH (1,2867) *KLT, kloroform:dietil eter (19:1) *Penggabungan bercak dengan Rf sama Fr 3 Fr 4 Fr 5 * Kromatografi kolom, CH2Cl2, CH2Cl2:EtOAc (9:1), EtOAc, MeOH
*KLT, kloroform:dietil eter (19:1) *Penggabungan bercak dengan Rf sama Fr 2-4 & Fr 3-3 Fr 1 Fr 2 Fr 2-4 Fr 2-5 Fr 2-1 Fr 2-2 Fr 2-3 Fr 3-4 Fr 3-5 Fr 3-1 Fr 3-2 Fr 3-3
merata. Setelah dikeringanginkan, daun brokoli perlakuan atau kontrol diletakkan dalam cawan petri berdiameter 9 cm yang dialasi tisu, kemudian 15 ekor larva instar II C. pavonana dimasukkan ke dalam cawan tersebut. Setiap perlakuan dan kontrol diulang lima kali. Setelah 48 jam daun perlakuan diganti dengan daun tanpa perlakuan. Jumlah larva yang mati dicatat setiap hari hingga hari ke-3. Fraksi dianggap aktif bila perlakuan dengan fraksi tersebut dapat mengakibatkan kematian larva uji > 80% (kematian kumulatif pada hari ke-3).
Fraksi yang aktif, yaitu fraksi 2 dan 3 KVC P. retrofractum serta fraksi 2-4 KK T. vogelii, diuji lebih lanjut terhadap larva C. pavonana pada lima taraf konsentrasi yang diharapkan dapat menyebabkan kematian serangga uji antara 0% dan 100% (eksklusif). Untuk setiap taraf konsentrasi digunakan 15 ekor larva instar II dengan lima ulangan. Mortalitas larva diamati dan dicatat setiap hari hingga hari ke-3. Hubungan antara konsentrasi bahan uji dan tingkat kematian serangga uji diolah dengan analisis probit (Finney 1971) menggunakan program POLO-PC (LeOra Software 1987).
Uji toksisitas campuran fraksi aktif P. retrofractum dan T. vogelii terhadap larva C. pavonana dilakukan dengan cara yang sama seperti di atas. Campuran yang diuji ialah fraksi 2 + fraksi 3 KVC P. retrofractum (2:5), fraksi 2 KVC P. retrofractum + fraksi 2-4 KK T. vogeliii (8:5), dan fraksi 3 KVC P. retrofractum
+ fraksi 2-4 KK T. vogelii (2:5). Perbandingan konsentrasi dalam campuran berdasarkan perbandingan LC50 komponen masing-masing.
Toksisitas insektisida pembanding profenofos (Curacron 500 EC) terhadap larva C. pavonana juga diuji dengan cara yang sama seperti di atas. Pengujian dilakukan pada lima taraf konsentrasi berdasarkan uji pendahuluan. Untuk pengujian, formulasi profenofos diencerkan dengan akuades yang mengandung Tween 80 0,2% sesuai konsentrasi yang diinginkan. Air yang mengandung Tween 80 0,2% digunakan sebagai larutan kontrol.
Metode kontak. Metode ini dilakukan untuk mengevaluasi lebih lanjut sifat racun kontak ekstrak kasar, fraksi 2, 5, dan 3 KVC P. retrofractum, fraksi
2-4 KK T. vogelii serta insektisida sintetik profenofos terhadap larva C. pavonana. Konsentrasi tertinggi setiap bahan uji dalam pengujian ini setara dengan lima kali konsentrasi yang dapat mengakibatkan kematian larva C. pavonana sekitar 80% pada uji pendahuluan dengan metode residu pada daun.
Setiap bahan uji dilarutkan dalam aseton sesuai konsentrasinya masing-masing. Setiap larutan uji dipipet sebanyak 0,5 ml ke dalam tabung gelas berdiameter 2,2 cm dan tinggi 5,8 cm. Tabung gelas ditutup dan diputar-putar pada posisi miring untuk menyebarkan larutan bahan uji secara merata pada permukaan dalam tabung gelas tersebut. Kelebihan larutan ekstrak dibuang, lalu pelarut diuapkan dengan meletakkan tabung gelas tersebut di dalam kamar asap. Setelah pelarut menguap, tabung dikeluarkan dari dalam kamar asap dan ke dalam setiap tabung dimasukkan 15 larva C. pavonana instar II yang berumur sekitar 3-4 jam setelah ganti kulit. Selanjutnya tabung diletakkan terbalik di atas cawan petri yang bagian permukaannya telah ditetesi dengan bahan uji yang sama serta diuapkan pelarutnya. Sebagai kontrol, larva uji dimasukkan ke dalam tabung gelas yang diberi perlakuan aseton saja. Setelah 2 jam kontak, larva uji dipindahkan ke dalam cawan petri yang dialasi tisu dan berisi potongan daun brokoli (4 cm x 4 cm) tanpa perlakuan. Setiap perlakuan diulang lima kali. Jumlah larva yang mati dihitung pada 24 jam setelah perlakuan (setelah pemindahan ke cawan petri).
Analisis sifat aktivitas campuran. Senyawa aktif ekstrak P. retrofractum
dan T. vogelii memiliki cara kerja yang berbeda sehingga dalam analisis sifat aktivitas campuran digunakan model kerja bersama bebas (Prijono 2002). Hasil analisis probit pada perlakuan fraksi tunggal maupun campuran manghasilkan nilai a (intercept), b (slope), LC50, dan LC95. Untuk campuran, LC50 atau LC95 yang diperoleh disebut LC50 atau LC95 percobaan.
Untuk campuran ekstrak yang berasal dari jenis tumbuhan yang sama, sifat aktivitas campuran dianalisis berdasarkan model kerja bersama serupa dengan menghitung nisbah ko-toksisitas pada taraf LC50 dan LC95 (Wadley 1945 dalam
Kosman & Cohen 1996). LCx(campuran) yang diperoleh dari pengujian campuran ekstrak disebut LCx(campuran) percobaan. LCx(campuran) harapan dihitung dengan rumus berikut (Wadley 1945 dalam Kosman & Cohen 1996):
LCx(campuran) harapan = 1/[(p1/LCx(1)) + (p2/LCx(2))]
p1 dan p2 masing-masing proporsi konsentrasi komponen 1 (fraksi 2 KVC P. retrofractum) dan komponen 2 (fraksi 3 KVC P. retrofractum) dalam campuran; LCx(1) dan LCx(2) masing-masing LCx komponen 1 dan komponen 2. Nisbah ko-toksisitas (NK) campuran komponen tersebut dihitung dengan rumus:
LCx(campuran) harapan NK =
LCx(campuran) percobaan
Kategori sifat interaksi campuran berdasarkan kategori yang dikemukakan oleh Kosman & Cohen (1996) dan Gisi (1996):
(1)bila NK < 0,7, komponen campuran bersifat antagonistik; (2)bila NK 0,7–1,3, komponen campuran bersifat aditif;
(3)bila NK > 1,3–2, komponen campuran bersifat sinergistik lemah; (4)bila NK > 2, komponen campuran bersifat sinergistik kuat.
Untuk campuran ekstrak yang komponennya berasal dari jenis tumbuhan yang berbeda, sifat aktivitas campuran dianalisis berdasarkan model kerja bersama berbeda dengan menghitung indeks kombinasi pada taraf LC50 dan LC95. Indeks kombinasi (IK) pada taraf LCx tersebut dihitung dengan rumus berikut (Chou & Talalay 1984):
2 ) ( 2 1 ) ( 1 2 ) ( 2 1 ) ( 1 x cmp x x cmp x x cmp x x cmp x LC LC x LC LC LC LC LC LC IK = + +
LCx1 dan LCx2 masing-masing LCx komponen fraksi 2 atau 3 KVC P. retrofractum dan fraksi 2 KK T. vogelii pada pengujian terpisah; LCx1(cm) dan LCx2(cm) masing-masing LC komponen fraksi 2 atau 3 KVC P. retrofractum dan
fraksi 2 KK T. vogelii dalam campuran yang mengakibatkan mortalitas x (misal 50% dan 95%). Nilai LC tersebut diperoleh dengan cara mengalikan LCx campuran dengan proporsi konsentrasi komponen fraksi 2 atau 6 KVC P. retrofractum dan fraksi 2 KK T. vogelii dalam campuran.
Kategori sifat interaksi campuran diadaptasi dari Kosman & Cohen (1996) dan Gisi (1996) berdasarkan kebalikan nilai nisbah ko-toksisitas:
(1) bila IK < 0,5, komponen campuran bersifat sinergistik kuat; (2) bila IK 0,5–0,77, komponen campuran bersifat sinergistik lemah; (3) bila IK > 0,77–1,43, komponen campuran bersifat aditif;
(4) bila IK > 1,43, komponen campuran bersifat antagonistik.
Percobaan 2. Uji Antifeedant Fraksi Aktif P. retrofractum dan T. vogelii
terhadap Larva C. pavonana
Fraksi tunggal yang aktif pada uji toksisitas diuji pengaruhnya terhadap aktivitas makan larva instar II C. pavonana dengan metode pilihan. Setiap jenis fraksi diuji pada lima taraf konsentrasi yang setara dengan LC10, LC25, LC40, LC55, dan LC70 berdasarkan hasil pengujian dengan metode residu pada daun. Setiap perlakuan diulang lima kali. Cara pemberian perlakuan pada daun pakan sama seperti pada pengujian toksisitas dengan metode residu pada daun.
Potongan daun brokoli (2,5 cm x 2,5 cm) dibuat dari bagian lembaran daun brokoli di kedua sisi tulang daun utama. Potongan daun dari salah satu sisi tulang daun digunakan untuk perlakuan dan potongan daun dari sisi lainnya untuk kontrol. Sebelum diberi perlakuan, semua daun diukur dengan menggunakan milimeter blok untuk mendapatkan luas daun awal. Untuk memperkirakan proporsi bobot epidermis, diambil 10 potongan daun lain dengan ukuran yang sama, kemudian bagian mesofil daun dikelupas hingga tersisa bagian epidermisnya saja. Proporsi bobot epidermis terhadap bobot awal daun sebelum dikelupas digunakan untuk memperkirakan proporsi epidermis bila pada bagian daun yang dimakan tersisa epidermis.
Dua potongan daun perlakuan dan dua potongan daun kontrol diletakkan secara berselang-seling di dalam cawan petri yang dialasi tisu. Selanjutnya 10 ekor larva instar II awal C. pavonana dilepaskan di bagian tengah arena makan. Setelah 24 jam, luas daun yang dimakan dan perkiraan luas total daun akhir diukur dengan menggunakan milimeter blok. Proporsi luas daun yang dimakan kemudian dikalikan dengan luas total daun awal untuk mendapatkan data luas daun yang dimakan. Pengukuran luas total daun awal dan akhir dilakukan untuk memperhitungkan penyusutan luas daun selama periode pengujian (24 jam).
Persentase penghambatan makan (efek antifeedant) dihitung berdasarkan data luas daun perlakuan dan daun kontrol yang dimakan larva menggunakan rumus berikut: % 100 x Dp Dk Dp Dk AF + − = AF : efek antifeedant
Dk : luas daun kontrol yang dimakan larva (mm2) Dp : luas daun perlakuan yang dimakan larva (mm2)
Data perbedaan luas daun kontrol dan daun perlakuan yang dimakan diolah dengan uji-t berpasangan. Pengaruh konsentrasi ekstrak terhadap efek antifeedant
diolah dengan sidik ragam yang dilanjutkan dengan uji selang berganda Duncan untuk pembandingan nilai tengah antarperlakuan.
Percobaan 3. Uji Toksisitas Fraksi Aktif P. retrofractum dan T. vogelii serta