Tahapan Penelitian Kegiatan Luaran
4.1 Validasi Metode Ekstraksi PAH dengan Tandem SPE dan HPLC
Validasi metode merupakan salah satu penunjang dalam mendapatkan data hasil penelitian yang valid. Hal ini dikarenakan dengan melakukan validasi metode, atribut-atribut dalam suatu metode seperti ketelitian, ketepatan, sensitivitas, dan keterulangan dapat terlihat dan dapat dioptimalkan. Validasi metode biasa dilakukan apabila metode yang digunakan dalam suatu pengujian atau penelitian merupakan metode yang benar-benar baru atau apabila telah dilakukan modifikasi pada metode yang telah divalidasi. Selain itu, validasi metode juga dilakukan pada pengujian senyawa dengan konsentrasi trace (seperti PAH) untuk melihat validitas dari data yang dilaporkan.
Pada penelitian ini dilakukan modifikasi pada metode ekstraksi polisiklik aromatik hidrokarbon (PAH) yang telah dikembangkan oleh Janoszka et al. (2004). Modifikasi dilakukan pada jumlah sampel yang digunakan serta jumlah pelarut yang digunakan dimana pada penelitian ini jumlah sampel yang digunakan hanya 1 gram dengan jumlah pelarut yang telah disesuaikan. Selain itu digunakan instrumen High Performance Liquid Chromatography (HPLC) dengan detektor UV untuk mendeteksi keberadaan PAH, berbeda dengan metode Janoszka et al. (2004) yang menggunakan HPLC dengan detektor fluoresens dan kromatografi gas dengan detektor mass spectrophotometer. Detektor UV dipilih karena detektor ini merupakan detektor yang umum terdapat pada lembaga pengujian pangan di Indonesia sehingga metode ini diharapkan dapat diaplikasikan oleh lembaga pengujian di Indonesia untuk pengukuran PAH dalam pangan.
Validasi metode yang dilakukan pada penelitian ini mengikuti standar EURACHEM (1998) yang meliputi uji kesesuaian sistem, linieritas, LOD dan LOQ instrumen, uji recovery dan uji keterulangan. Hasil validasi metode ekstraksi PAH dengan menggunakan tandem SPE dan HPLC-UV terdapat pada Tabel 6.
Tabel 6 Hasil validasi metode ekstraksi PAH dengan tandem SPE dan HPLC-UV Kriteria Nilai untuk BAP Nilai Untuk DBA Linearitas injeksi standar PAH
murni (R2), range konsentrasi 0.05-10 µg/mL
0.999 0.999
Linearitas metode dengan standar adisi dalam sampel (R2), range spiking 0.1-10 µg/g sampel
0.968 0.960
Uji Kesesuaian Sistem (RSD < 2%) - RSD luas area - RSD waktu retensi 0.78% 1.44% 0.57% 1.60% Limit Deteksi (LOD) 7.4 ng/g sampel 6.6 ng/g sampel Limit Kuantifikasi (LOQ) 24.7 ng/g sampel 22.0 ng/g sampel Rekoveri dengan spiking
5 µg/g sampel
104.21% 101.18%
Repeatability atau Presisi 23.66% 20.85%
Hasil uji kesesuaian sistem untuk benzo(a)piren (BAP) dan dibenzo(a,h)antrasen (DBA) ditunjukkan pada Tabel 6. Rata-rata waktu retensi untuk BAP dan DBA masing-masing adalah 11.448 menit dan 13.232 menit dengan RSD di bawah 2%. Sementara rata-rata luas area BAP dan DBA adalah 179.5855 dan 347.9346 dengan RSD di bawah 2%. Hasil ini sesuai dengan standar RSD yang disarankan oleh JECFA untuk prosedur analisis trace.
Kromatogram hasil analisis PAH dapat dilihat pada Gambar 6. Peak dari BAP tampak pada 12.634 menit dan DBA pada 13.511 menit. Peak dari kedua jenis PAH ini tampak sebagai peak yang terpisah sehingga analisis dari kedua PAH dapat dilakukan secara simultan.
Uji linearitas dilakukan dengan injeksi standar benzo(a)piren dan dibenzo(a,h)antrasen ke dalam sampel ikan rebus. Hasil uji linearitas untuk BAP dan DBA ditunjukkan pada Tabel 6. Luas area peak meningkat secara proporsional seiring dengan meningkatnya konsentrasi BAP dan DBA yang di-spike ke dalam matriks sampel daging ikan rebus. Hasil uji linearitas metode
analisis BAP dan DBA dengan adisi standar ke dalam sampel pada range konsentrasi spike 0.1-10 µg/g sampel memiliki nilai koefisien determinasi (R2) di bawah 0.990. Sementara koefisien regresi injeksi langsung standar BAP dan DBA di atas 0.990. Nilai uji linearitas injeksi langsung standar PAH sesuai dengan yang disarankan EURACHEM (1998), yaitu nilai koefisien determinasi (R2) > 0.990.
Hasil uji LOD dan LOQ PAH menunjukkan nilai LOD dari HPLC untuk BAP adalah 7.4 ng/g sampel dan untuk DBA 6.6 ng/g sampel. Sementara nilai LOQ untuk BAP adalah 24.7 ng/g sampel dan untuk DBA adalah 22.0 ng/g sampel. Nilai ini lebih kecil dibandingkan yang dilaporkan oleh Farhadian et al. (2011) dan Janoszka et al. (2004) untuk analisis BAP menggunakan HPLC dengan detektor fluoresens. Nilai LOD yang dihasilkan peneliti ini untuk BAP adalah 0.01-0.03 ng/g. Hal ini menunjukkan detektor fluoresens lebih sensitif untuk deteksi PAH dalam sampel. Penyebab lainnya adalah tidak digunakannya kolom khusus untuk analisis PAH seperti yang dilakukan oleh kedua peneliti tersebut. Kolom khusus PAH merupakan kolom yang berisi C18 dan ultra-high purity silika yang khusus dibuat untuk kolom PAH. Silika ini memiliki kemampuan sangat baik untuk mereduksi adsorpsi dari molekul polar sehingga jumlah senyawa pengganggu (interferens) sedikit dan resolusi pemisahan masing-masing PAH menjadi lebih baik.
Upaya yang dilakukan untuk meningkatkan deteksi metode pada penelitian ini adalah dengan adisi standar pada tahap akhir ekstraksi PAH. Dalam metode yang dikembangkan oleh Janoszka et al. (2004), pada tahap akhir residu yang mengandung PAH dilarutkan dalam 200 µL Acetonitril : Air (80:20). Modifikasi dilakukan dengan mengganti penambahan Acetonitril : Air dengan standar PAH (BAP dan DBA) dengan konsentrasi 2.5 µg/mL sebanyak 200 µL. Dengan melakukan adisi standar PAH pada ekstraksi jumlah PAH yang terdeteksi akan masuk ke dalam limit deteksi dari sistem HPLC yang digunakan pada penelitian.
Hasil uji recovery dan uji keterulangan untuk analisis BAP dan DBA ditunjukkan pada Tabel 6. Konsentrasi standar BAP dan DBA yang di-spiking ke dalam matriks sampel ikan rebus adalah 5 µg/g sampel. Hasil uji recovery pada standar BAP bervariasi antara 69.32-128.61% dengan rata-rata recovery adalah
104.21%. Sementara hasil uji recovery pada standar BAP bervariasi antara 59.54-121.23% dengan rata-rata recovery adalah 101.19%. Nilai ini sesuai dengan
nilai yang direkomendasikan oleh EURACHEM (1998) yaitu 80-110% untuk analisis kandungan trace dalam sampel dengan konsentrasi 5 µg/mL. Nilai recovery yang dihasilkan pada penelitian ini lebih baik dibandingkan hasil penelitian Riverra et al. (1996) yang menggunakan tandem SPE dan HPLC-UV untuk analisis PAH. Peneliti ini melaporkan nilai recovery untuk analisis BAP dan DBA pada matriks sampel daging bakar masing-masing sebesar 47% dan 64%. Selain nilai recovery yang lebih baik, penggunaan sampel dalam jumlah rendah merupakan keunggulan dari metode analisis yang diterapkan dalam penelitian ini.
Hasil uji keterulangan analisis PAH ditunjukkan oleh nilai RSD dari masing-masing analisis PAH. Nilai keterulangan untuk BAP adalah 23.66% sedangkan untuk DBA adalah 20.85%. Nilai ini di atas batas keberterimaan yang disarankan oleh AOAC untuk analisis trace yaitu nilai RSD ≤ 15%. Untuk mengatasi hal ini optimasi proses ekstraksi SPE dapat dilakukan dengan menggunakan vacuum chamber yang dapat mengatur laju alir pelarut yang digunakan. Riverra et al. (1996) menyebutkan bahwa laju alir yang optimum untuk mendapatkan recovery yang baik adalah 0.5 mL/menit.
Gambar 6 Kromatogram analisis PAH dengan HPLC-UV pada sampel yang
dispike standar campuran BAP dan DBA masing-masing 1 µg/g sampel.