Visualisasi Produk PCR DNA Artemia dan Kutu Air

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil

4.1.4 Visualisasi Produk PCR DNA Artemia dan Kutu Air

Produk PCR yang dihasilkan dengan menggunakan primer GFP berukuran 600 bp (Gambar 9). Secara umum pada Artemia, produk ini terlihat di setiap perlakuan. Sementara pada kutu air, produk PCR hanya terlihat pada 6 jam setelah pemberian bakteri. Produk PCR menggunakan primer β-aktin diperoleh pada semua perlakuan Artemia dan kutu air. Hal ini menunjukkan bahwa terdapat DNA genom sebagai cetakan dalam proses amplifikasi PCR.

0,5 kb 0,1 kb 0,2 kb

M A1 A2 A3 A4 A5 A6 NA R

(i) GFP pada perlakuan Artemia

(ii) β-aktin pada perlakuan Artemia

(iii) GFP pada perlakuan kutu air

(iv) β-aktin pada perlakuan kutu air

Gambar 9. Visualisasi hasil PCR dengan target gen GFP pada Artemia (i) dan pada kutu air (iii) serta dengan target β-aktin pada Artemia (ii) dan pada kutu air (iv). M = Marker DNA; A1 = Perlakuan perendaman Artemia 30 menit; A2 = Perlakuan perendaman Artemia 1 jam; A3 = Perlakuan perendaman Artemia 1,5 jam; A4 = Perlakuan perendaman Artemia 2 jam; A5 = Perlakuan perendaman Artemia 2,5 jam; A6 = Perlakuan perendaman Artemia 3 jam; NA = Artemia tanpa perlakuan perendaman; D1 = Perlakuan perendaman kutu air 2 jam; D2 = Perlakuan perendaman kutu air 4 jam; D3 = Perlakuan perendaman kutu air 6 jam; D4 = Perlakuan perendaman kutu air 8 jam; D5 = Perlakuan perendaman kutu air 10 jam; P= Kontrol positif (plasmid pKrt-GFP); R= Hanya mengandung reagen PCR, dan ND= Kutu air tanpa perlakuan perendaman.

M A1 A2 A3 A4 A5 A6 P NA R

0,7 kb 0,5 kb

M D1 D2 D3 D4 D5 P ND R

0,8 kb 0,5 kb 0,4 kb

0,4 kb 0,3 kb 0,2 kb

M D1 D2 D3 D4 D5 R ND

4.1.5 Jumlah Copy DNA Asing dalam Artemia dan Kutu Air

Seperti ditunjukkan pada Gambar 10 bahwa jumlah copy DNA asing yang terdapat dalam Artemia yaitu berkisar antara 1,43 x 10¹³ s.d. 2,37 x 10¹², sedangkan dalam pada kutu air hanya dapat terdeteksi pada jam ke-6 setelah perendaman yaitu berjumlah 0,02x10¹²(Gambar 11). Detil perhitungan jumlah copy DNA asing dalam Artemia dan kutu air ditampilkan pada Lampiran 6.

Gambar 10. Jumlah copy DNA asing yang terdapat dalam Artemia.

Gambar 11. Jumlah copy DNA asing dalam kutu air.

4.2. Pembahasan

Aplikasi protein rekombinan seperti rekombinan growth hormone (rGH) dan DNA rekombinan seperti halnya DNA vaksin, membutuhkan metode pemberian yang tepat. Dalam penelitian ini digunakan pakan alami sebagai vektor penyampaian DNA asing dalam bentuk konstruksi gen keratin-GFP sebagai model bagi vaksin DNA. Metode ini juga telah dibuktikan oleh Lin et al.

(2005) bahwa Artemia mampu mengkonsumsi bakteri E. coli yang membawa konstruksi pET24a-GFP. Lebih lanjut Lin et al. (2005) melaporkan bahwa terdapat 10⁵ bakteri yang terkandung dalam 1 ekor Artemia dan sekitar 80-90%

mengandung antigen setelah 2 jam diberikan bakteri terkonstruksi pET24a-NNV VP. Penelitian ini mengacu kepada penelitian Lin et al. (2005). Pada penelitian ini digunakan 15.000 ekor naupli Artemia diberi bakteri sebanyak 15 x 10⁸ cfu/ml yang membawa konstruksi gen pKrt-GFP (keratin-GFP). Selain itu, pada penelitian ini juga digunakan kutu air (Daphnia dan Moina) yang mewakili pakan alami untuk komoditas ikan air tawar. Jumlah kutu air dalam penelitian ini adalah sebanyak 5.450 ekor dengan cara menyamakan bobot basah dari 15.000 ekor Artemia yaitu 202,17 ± 12 mg, sehingga dapat dikatakan bahwa bobot Artemia berbanding kutu air adalah 1:3.

Hasil isolasi DNA genom dari Artemia dan kutu air termasuk bersih atau kontaminasi dari protein atau fenol sangat rendah, karena rasio λ²⁶⁰/λ²⁸⁰ adalah mendekati 1,800 (Muladno, 2002) dan kemurniannya lebih dari 95%.

Selanjutnya, dengan menggunakan DNA genom hasil isolasi tersebut, produk PCR menggunakan primer β-aktin juga berhasil diperoleh dengan ukuran fragmen DNA sesuai dengan yang diprediksi yaitu sekitar 240 bp pada Artemia. Namun demikian pada kutu air terdapat tiga pita DNA yaitu sekitar 240 bp, 300 bp, dan antara 300-400 bp. Jumlah pita DNA lebih dari 1 ini diduga disebabkan karena primer didisain dari penyejajaran sekuen β-aktin dari Daphnia magna dan Daphnia pulex, sementara DNA yang digunakan berasal dari kutu air yang merupakan campuran antara Daphnia dan Moina. Diduga bahwa primer β-aktin yang digunakan mempunyai situs annealing berbeda antara Daphnia dan Moina.

Semua perlakuan waktu perendaman pada Artemia mengandung bakteri yang membawa DNA asing, sedangkan pada kutu air hanya terdapat pada

perlakuan 6 jam (Gambar 9i dan Gambar 9iii). Selain itu, waktu yang diperlukan oleh Artemia untuk memakan bakteri dalam jumlah tinggi lebih cepat dibandingkan dengan kutu air. Perbedaan ini diduga berhubungan dengan perilaku makan dari kedua spesies tersebut. Artemia bersifat non selective filter feeder sehingga mampu memakan apapun yang terdapat disekitarnya yang berukuran

<50 mikron (Isnansetyo & Kurniastuty, 1995), sedangkan kutu air bersifat selective filter feeder artinya ukuran suspensi bahan organik yang dilalui dan masuk ke dalam tubuhnya adalah sama dengan ukuran mulutnya atau organ penyaringnya (Djarijah, 1996). Dengan demikian, dari segi jumlah bakteri atau dengan kata lain jumlah copy DNA asing yang dapat dimakan, maka Artemia lebih potensial digunakan sebagai pembawa DNA vaksin dibandingkan dengan kutu air.

Jumlah copy DNA asing yang terdapat dalam Artemia mencapai nilai tertinggi pada perendaman 1,5 jam (2,37x10¹² copy DNA dalam 100 ekor Artemia). Jumlah copy DNA ini sebanding dengan 22,19 µg DNA (Lampiran 6).

Zheng et al. (2006), melaporkan dosis yang digunakan pada uji ekspresi vaksin DNA terhadap ikan Japanese flounder Paralichthys olivaceus adalah 15µg. Begitu pula dengan penelitian Zahro (2010), mengatakan bahwa dosis vaksin DNA terbaik yang digunakan pada uji tantang terhadap sintasan ikan mas yang diinfeksi koi herpes virus (KHV) adalah 12,5 µg (dengan jumlah copy DNA yaitu 13 x 10¹²).

Jika dikaitkan dengan hasil penelitian Zahro (2010) tersebut, dapat dikatakan jumlah copy DNA pada 100 ekor Artemia belum cukup dibanding dengan injeksi vaksin KHV sebesar 12,5 µg per ekor ikan mas dengan bobot rata-rata 15-20 gram. Hasil yang sebanding diperoleh jika 1 ekor ikan mas dengan umur dan ukuran yang sama, memakan 500 ekor Artemia atau sekitar 5 kali lipat dari jumlah copy DNA yang ada. Namun, dalam penelitian ini penyampaian konstrusksi DNA pKrt-GFP cukup efektif mengingat pakan alami dapat diberikan pada larva yang berumur lebih dari 2 minggu. Hal ini sesuai dengan Kordi (2004), menyatakan bahwa vaksin DNA kurang efektif diberikan pada ikan yang digunakan kurang dari 2 minggu dan berat badannya kurang dari 1 gram. Hal ini karena organ tubuh yang merespon kekebalan belum sempurna memproduksi

antibodi. Organ tubuh ikan yang berfungsi merespon kekebalan, akan tercapai sempurna setelah 2 minggu. Kordi (2004), juga menganjurkan melakukan vaksinasi pada umur tersebut dan kemudian dapat diulangi pada saat ikan berumur 2 bulan. Lin et al. (2005) melakukan pemberian vaksin VNN VP pada larva ikan kerapu melalui Artemia. Artemia yang telah disisipkan vaksin VNN VP diberikan pada larva kerapu yang berumur 18 hari. Pemberian Artemia tersebut dilakukan selama 17 hari sampai terbentuk sistem imun. Sehingga penelitian menggunakan konstruksi pKrt-GFP ini dengan perendaman 1,5 jam bisa dikatakan cukup sebanding untuk menginduksi sistem imun ikan mas.

Selanjutnya, Artemia diduga berhenti sementara untuk makan setelah 1,5 jam. Sebagian dari bakteri dilisis dan plasmid DNA dirusak oleh enzim restriksi endogenus sehingga jumlah copy DNA menurun menjadi 1,67 x 10¹² copy pada perlakuan 2 jam perendaman. Dugaan tersebut diperkuat dengan munculnya pola yang sama apabila perendaman dilanjutkan, meskipun rentang waktunya lebih singkat dibandingkan dengan perlakuan 30 menit - 1,5 jam. Jumlah copy DNA meningkat kembali pada perlakuan 2,5 jam (2,27 x 10¹²copy DNA) dan menurun pada perlakuan 3 jam (2,16 x 10¹²copy DNA). Dalam hubungannya dengan vaksinasi melalui Artemia, lama waktu perendaman dan tingkat pemberian pakan yang efektif dalam arti memberikan induksi imunitas terbaik masih perlu diteliti.

Pada kutu air, keberhasilan dalam uptake bakteri yang mengandung DNA dengan konstruksi pKrt-GFP muncul pada 2 jam ketiga atau pada 6 jam setelah perendaman yaitu sebanyak 0,02 x 10¹² copy DNA dengan konsentrasi 0,15 µl.

Hal ini karena kutu air memiliki proses pencernaan internal yang mampu melisiskan sel bakteri (Hadas, 1983) dan diduga memotong DNA pKrt-GFP.

V. KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Berdasarkan hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa Artemia memiliki kemampuan uptake bakteri lebih tinggi dibandingkan dengan kutu air.

Jumlah copy DNA asing tertinggi dalam tubuh Artemia diperoleh pada perendaman selama 1,5 jam yaitu 2,37 x 10¹² copy DNA sedangkan pada kutu air muncul pada 2 jam ketiga dengan jumlah copy DNA 0,02 x 10¹².

5.2 Saran

Daya tahan ikan uji terhadap infeksi patogen setelah diberi makan Artemia yang mengandung vaksin DNA hasil perendaman selama 1,5 jam perlu diteliti.

Selain itu, penggunaan Artemia berukuran lebih besar dan frekuensi pemberian Artemia ke ikan perlu diteliti untuk mengetahui metode efektif menginduksi imunitas ikan uji.

DAFTAR PUSTAKA

Barnes RD. 1963. Invertebrate zoology. W. B. Saunders Company, Philadelphia, PA.

Brown TA. 1995. Gene cloning and introduction. London: Chapman and Hall.

Dale JW, Schantz MV. 2002. From genes to genomes: Concepts and application of DNA technology. Jhon Willey & Sons Ltd, England

Delbare D and Dhert. 1996. Cladocerans, nematodes and trochophora, larvae.

Manual on the production and use of live food for aquaculture laboratory of aquaculture and Artemia. Reference Center University of Ghent, Belgium. P.283-295. In p. Lavens and p. Sorgeloos (ed.).

Dinges RRS. 1973. Ecology of Daphnia in stabilization ponds. Texas States Department of Health, Division of Wastewater Technology and Surveylance, USA. 453p.

Djarijah AS. 1996. Pakan Ikan Alami. Yogyakarta: Kanisius.

Dunham RA. 2004. Aquaculture and Fisheries Biotechnology: Genetic Approaches. CABI Publishing. Cambridge, MA, USA.

Effendi I. 2004. Pengantar Akuakultur. Jakarta: Penebar Swadaya.

Ellis AE. 1988. Fish Vaccination. San Diego: Academic press.

Erlich HA. 1989. PCR technology principles and application for DNA amplification. New York: M Stockton Press.

Felts K, Rogers B, Chen K, Ji H, Sorge J and Vaillancourt P. 2001. Recombinant Rennila reniformis GFP displays low toxicity. Stratagene 13:85-87.

Hadas O, Yehuda K, Uriel B, and Benzion C. 1983. Ability of Daphnia cell-free extract to damage Escherichia coli cells. Applied and Environmental Microbiology vol.45. No. 4 :1242-1246.

Iyengar A, Muller F and Maclean N. 1996. Regulation and expression of transgenes fish – A review. Transgenic Research 5: 147-166.

Kordi MGH. 2004. Patologi Ikan Teleostei. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press.

Lin CC, Jhon HYL, Ming SC, and Huey LY. 2007. An oral nervous necrosis virus vaccine that induced protective immunity in larvae of grouper Epinephelus coioides. Aquaculture 268: 265-273.

Giordano S, Hall C, Quitshke W, Glasgow E, and Schechter N. 1990. Keratin 8 of simple ephitelia is expressed in glia of the goldfish nervous system.

Differentiation 44: 163-172

Gong Z, Ju B, Wang X, Sudha PM, and Yan T. 2002. Green fluorescent protein expression in germ line transmitted transgenic zebrafish under a stratified ephitelial promoter from keratin8. Developmental Dynamics 223: 204-215 Glick BR and Pasternak JJ. 2003. Molecular Biotechnology: Principles and

application of recombinant DNA. Third ed. ASM Press. Washington DC.

Griffith AFJ, Gelbert WM, Miller JH, and Lewontin RC. 2005. Modern gebetic analysis. New York: WH freeman & company.

Hirono I, Aoki T, Shimizu N, and Takashima F. 2003. Immunorelated-genes of the Japanese Flounder Paralichthys olivaceus. Aquatic genomics in Hirono I, Aoki T, Shimizu, and Takashima F (eds.) pp: 286-300.

Isnansetyo A dan Kurniastuty. 1995. Teknik Kultur Phytoplankton dan Zooplankton; Pakan Alami untuk Pembenihan Organisme Laut.

Yogyakarta: Kanisius.

Karp G. 1984. Cell Biology, Second ed. Mc Graw Hill, Inc. USA.

Mudjiman A. 1989. Makanan Ikan. Jakarta: Penebar Swadaya.

Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Bogor: Pustaka Wirausaha Muda dan USESE Foundation.

Onodera K. 2007. Selection for 3-End Triplets for Polymerase Chain Reaction Primers. in Yuryev A. (editor). 2007. Methods in Molecular Biology: PCR Primer Design. Humana Press, Totowa, NJ. 402: 415 p.

Quitschke WW, Lin Z-Y, DePoti-Zilli L and Paterson BM. 1989. The β-actin promoter. Journal of Biology and Chemistry 264: 9539-9546.

Rasmussen R and Reed G. 1992. Optimizing Rapid Cycle DNA amplification reactions. www.idahotechnology.com/pdfs/RapidCycler/ [28 Maret 2010]

Saunders, Ginny C, Parkers, and Helen C. 1999. Analytical molecular biology:

Quality and validation. Laboratory of the Government Chemis. Teddinton.

UK.

Suwignyo SB. Widigdo, Y. Wardiatno, dan M. Krisanti. 1998. Avertebrata Air jilid 2. Hal 143-183. Jakarta: Penebar Swadaya.

Treece GD. 2000. Artemia production for marine larval fish culture. Southern Regional Aquaculture Center Publication No.702.

Volckaert FA, Hellemans BA, Galbusera P, and Ollevier F. 1994. Replication, expression and fate of foreign DNA during embryonic and larval development of the African catfish Clarias gariepinus. Molecular Marine Biology and Biotechnology 3: 57-69

Walker JM and Rapley R. 2002. Molecular Biology and Bio technology Fourth Edition. The Royal Society of Chemistry. 555 p.

Wallace RB, Shaffer J, Murphy RF, Bonner J, Hirose T, and Itakura K. 1979.

Hybridization of synthetic oligodeoxynucleotides to fX174 DNA: the effect of single base pair mismatch. Nucleic Acids Res. 6: 3543–3557.

White T and Kazlev MA. 2008. Palaeos: The history of life on earth.

http://www.palaeos.com/invertebrates/crustacea/crustacea.html.

[30 Maret 2010].

Yazawa R, Hirono I, and Aoki T. 2005. Characterization of promoter activities of four different Japanese Flounder promoters in transgenic Zebrafish.

Marine Biotechnology 7: 625-633

Yuwono T. 2005. Biologi Molekular. Jakarta: Erlangga.

Yuwono T. 2006. Teori dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction. Yogyakarta:

Andi.

Yuwono T. 2008. Bioteknologi Pertanian. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press.

Zahro ASG. 2010. Efektivitas Pemberian Vaksin DNA Terhadap Kelangsungan Hidup Ikan Mas (Cyprinus carpio). Skripsi. Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor.

Zheng RZ, Xiu QS, Hong ZL, and Jin XZ. 2006. Study on distribution and expression of a DNA vaccine against lymphocystis disease virus in Japanese flounder. Aquaculture 261: 1128-1134.

Lampiran 1. Pengenceran serial pencawanan kuantitatif (bakteri terkonstruksi pKrt-GFP)

Persamaan perhitungan jumlah sel bakteri mengandung keratin GFP:

Keterangan:

C : Jumlah sel bakteri per ml biakan bakteri (cfu/ml)

A : Rerata jumlah koloni bakteri pada media kultur dalam cawan petri FP : Faktor pengenceran (1x10^-5, 1x10^-6, 1x10^-7, dan 1x10^-8)

60 ml biakan 0,9 ml PBS

0,1 ml biakan 1 : 10¹

PBS 0,9 ml 0,1 ml

0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml

0,01 ml 0,01 ml 0,01 ml 0,01 ml

Ulangan 1

Ulangan 2

1 : 10² 1 : 10³ 1 : 10⁴ 1 : 10⁵ 1 : 10⁶ 1 : 10⁷

1 : 10⁸

Lampiran 2. Jumlah sel bakteri yang tumbuh pada media dan contoh perhitungan

No Pengenceran

(FP) Media I Media II Rata-Rata

(A) Jumlah Sel (cfu/ml)

1 1 x 10^-5 98 92 95 0,95 x 10⁸

2 1 x 10^-6 4 20 12 1,2 x 10⁸

3 1 x 10^-7 0 0 0 0

4 1 x 10^-8 0 0 0 0

Contoh Perhitungan:

Pengenceran 1 x 10^-5: Pengenceran 1 x 10^-6: C = (A/FP) x 10

C = (95/ 1x10^-5) x 10 C = 95 x 10⁵ x 10 C = 95 x 10⁶

C = 0,95 x 10⁸ cfu/ml

C = (A/FP) x 10 C = (12/ 1x10^-6 x) 10 C = 12 x 10⁶ x 10 C = 12 x 10⁷

C = 1,2 x 10⁸ cfu/ml

Lampiran 3. Konstruksi DNA keratin-GFP

Konstruksi DNA Keratin-GFP (Yazawa et al., 2005)

GFP SV40 keratin Lysozyme SV40

keratin

keratin-GFP / keratin-Lysozyme

AgeI

NotI

Lampiran 4. Sekuen basa nukleotida dalam pembuatan primer β-actin Artemia

1. Sekuen Artemia franciscana mRNA for beta-actin (act gene), isolated from Great salt lake, Utah (GenBank: AM850110.1)

1 ctaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtatcaacgc agagtacgcg gggaagatta 61 gtccaaaagt cggcacagtg caaaccagga gtccatagtt tacttcaagg gtcaaatatt 121 taaaaaggat taatcatgtg tgacgatgat gtagcggctt tggttgtgga caatggctcc 181 ggtatgtgca aggccggctt tgccggagat gatgccccac gtgctgtctt tccctcaata 241 gttggccgac ctcgtcatca gggtgtcatg gtcggtatgg gtcaaaaaga tagctacgtc 301 ggtgatgaag cacagagcaa aagaggtatc ctcactttga aatatcctat tgaacatggt 361 attatcacaa actgggatga catggaaaag atctggcatc acacatttta caatgaactc 421 cgtgttgcac cagaagaaca cccaatattg ctcactgaag ccccccttaa cccaaaagct 481 aaccgtgaga agatgactca gattatgttt gagaccttca acagcccagc catgtatgtt 541 gccatccaag ccgtactttc actctacgct tccggtcgta caactggtat tgtcctcgac 601 tctggtgatg gtgtttctca caccgttccc atctatgaag gttatgccct tcctcatgcc 661 attctccgtc ttgaccttgc tggccgtgac ttgactgatt atttgatgaa aatcttgact 721 gaacgaggtt actctttcac caccactgct gagcgtgaaa ttgtccgtga cataaaggaa 781 aaactttgct atgtcgccct tgacttcgaa caggaaatgg caactgcagc tgcttctact 841 tctctagaaa aatcatatga attaccggac ggtcaagtta ttacaatcgg taacgagcgt 901 ttccgctgtc ccgaagccct cttccagcca tcattcctgg gcatggaatc ctgcggtatc 961 cacgagactg tctacaactc aattatgaag tgtgatgtcg acattcgtaa agacttgtat 1021 gccaacacgg ttctttctgg tggtaccacc atgtacccag gtattgctga taggatgcaa 1081 aaggaaataa ctgccctagc tccatcaaca atcaagatta agatcattgc cccacctgag 1141 cgtaaatact cagtttggat cggtggttcc attttggctt ctctgtccac cttccaacag 1201 atgtggatct caaaacagga atatgatgaa tctggaccag gaattgttca ccgcaaatgc 1261 ttttaaattt cttcactcct tctatattga tgtgatattt ttgctggagt cctcagaaaa 1321 ataaattggc cacatttgag caccatgttg cctatttata catagggctc ctgtatctag 1381 atcatatctt gttttgtttt aaatatgaga aataaaatgc ttgatgcaaa aaaaaaaaaa 1441 aaaaaaaaaa aaaaaa

2. Sekuen Artemia mRNA for actin (clone pArAct403) (GenBank: X52605.1) 1 aaataaaaat gtgtgacgac gaagttgccg cattggtcgt tgacaatggc tctggcatgt 61 gcaaagctgg atttgcagga gatgatgccc ctcgtgccgt tttcccctcc attgtcggcc 121 gtcctagaca ccagggtgtc atggtgggta tgggtcagaa agacagttat gttggagatg 181 aagctcaatc taagagaggt atcctcaccc tcaaataccc cattgaacat ggtatcgtca 241 ccaactggga cgatatggag aagatctggc atcatacctt ctacaatgaa cttcgcgttg 301 ccccagaaga gcacccagtt ttactcacag aagcacccct taacccaaaa gccaacagag 361 aaaaaatgac tcagatcatg ttcgaaacat tcaacacccc tgccatgtat gttgccatcc 421 aagccgtgct ttccctctac gcatctggta gaactactgg tatcgttctt gattcaggcg 481 atggtgtctc acataccgta cccatctacg aaggctacgc tcttccacac gcaattttga 541 gattggatct tgctggtcga gatttaaccg attatttgat gaaaatccta accgagcgag 601 gatattcctt taccaccact gctgaaagag aaattgttcg tgatatcaaa gaaaaacttt 661 gttatgtcgc tttggacttt gagcaggaga tggcaactgc ggccagctca acgtctcttg 721 aaaagagcta tgagctgcct gatggtcagg taatcactat tggcaatgag cgattcagat 781 gcccagaagc ccttttccag ccatccttcc tcggtatgga atcttgcggc attcatgaaa 841 ctacctacaa tagtattatg aaatgcgatg tcgacatcag aaaggacctt tacgccaaca 901 ccgttttgtc tggtggtacc accatgtacc ctggcattgc cgacagaatg cagaaggaaa 961 tcactgccct tgcaccatcc accatgaaaa tcaaaatcat tgccccgcct gagcgtaaat 1021 actctgtatg gatcggtgga tctatcctag cttccctctc aacattccaa cagatgtgga 1081 tttctaaaca ggaatacgac gaatctggac catccattgt tcacagaaaa tgcttttaat 1141 ctgcttatgt ccaagagtga acatgccacc aaatgtgatc tttgttaaag aaattgagtt 1201 gaaagatgat taacggccat catcatttat gtttaaccaa attaaacccg ttttttgcta 1261 agtcattgaa cgattaataa atttcttaat acaaaaaaaa aaaaa

3. Sekuen Calanus finmarchicus actin mRNA, partial cds (GenBank: U21222.1)

1 tgggacgata tggaaaaaat ttggcatcac accttctaca atgaactccg tgttgcccct 61 gaggaactgc ccgtcctcct cactgaggct cccctcaacc ccaaggctaa tcgtgagaag 121 atgacccaga tcatgttcga gaccttcaac atgcccgcca tgtatgttgc catccaggct 181 gtcctctccc tctatgcttc cggccgtacc actggtatcg tcatggactc tggagatggt 241 gtctcccacg gtgtccccgt ctatgaaggt tatgcccttc cccatgccat tgtccgtctt 301 gatcttgctg gacgtgagct caccaactac ctgatgaaga tcctcactga gcgtggctac 361 tctttcacca ccactgctga gcgcgagatt gtccgtgaca tcaaggagaa gctttgctat 421 gaagcccttg acttcgagca ggagatgtcc actgccgccg cctccacctc ccttgagaag 481 tcttatgagc ttcccgacgg tcaggtcatc accattggta atgagcgttt ccgttgccca 541 gaggctctct tccagccttc cttccttgga atggaagcct gtggcatcca tgagaccacc 601 tacaactcca tcatgaagtg cgatgttgac atccgtaagg atctctatgc caacactgtc 661 atgtccggag gtaccaccat gtaccccggt attgctgacc gtatgcagaa ggagatcact 721 gctcttgctc catccaccat caagatcaag atcattgctc ccccagagag gaaatactct 781 gtctggatcg gaggatccat ccttgcctct ctctccacct tccaacagat gtgga

Lampiran 5. Sekuen basa nukleotida dalam pembuatan primer β-actin Daphnia

1. Sekuen Daphnia magna mRNA for actin (GenBank: AJ292554.1)

1 aagcgtggta acaacccaga gtacgcgggg acaccagacc gtccccagtc ggttagctca 61 acagagcaaa cgtacctgtt tttttccagt tcactcgccc ccagacttaa ttcatcaaca 121 tgtgtgacga tgatgttgcg gctttggttg tggacaacgg atccggtatg tgcaaggctg 181 gattcgccgg agatgacgcc ccccgtgccg tcttcccctc cattgtcggc cgtcctcgcc 241 accagggtgt catggtgggt atgggacaga aagactcgta cgtcggtgac gaggcccaat 301 ccaaacgtgg tattttgact ctgaaatacc caattgagca cggcatcatc accaactggg 361 atgacatgga aaagatctgg caccacacct tctacaacga gttgcgcgtg gctcccgagg 421 aacaccccat cctcttgact gaggcccccc ttaaccccaa ggctaatcgt gagaagatga 481 cccagatcat gttcgagacc ttcaactgcc cggccatgta cgttgccatc caggccgtcc 541 tctccctcta tgcctccggt cgtaccactg gtatcgtcct cgactccggt gatggtgtct 601 cccacactgt ccccatttat gaaggttacg ccctgcccca cgccatcctc cgtctggatt 661 tggctggtcg cgacttgact gactacttga tgaagatctt gactgaacgc ggttacagct 721 tcaccaccac cgctgagcgt gaaatcgtcc gtgacatcaa ggagaaattg tgctatgtcg 781 cccttgactt tgaacaggaa atggccactg ctgctgcctc cacctctttg gagaaatcct 841 atgaattgcc cgatggtcag gtcatcacca ttggcaacga gcgattccgc tgccccgagg 901 ccctcttcca gccctcattc ttgggtatgg aatcttgcgg tatccacgag accgtctaca 961 actcgatcat gaagtgcgac gtcgacatcc gtaaggatct gtacgccaac actgtcttgt 1021 ccggaggcac caccatgtac cccggtattg ctgatcgtat gcaaaaggaa atcaccgccc 1081 ttgccccatc caccatcaag atcaagatca ttgctccccc tgagcgcaaa tactccgtct 1141 ggatcggtgg ctccatcttg gcctctctgt ccaccttcca acagatgtgg atctccaagc 1201 aggaatacga cgagtccggc cctggcattg tccaccgcaa gtgcttctaa atcatctggc 1261 gctttccgat gggggcgaga ctcgttttcg actcctatcg tcccaattct tttcaatttt 1321 tattcttctc ttcttcgtct tttcttccat tttcctgtct tttctttact ctttttcgtc 1381 tctcttgacg ttttcacttc ccagttctta tttatttact cattgtctct gtcgacactt 1441 cttgcaagaa atattgattg atgatgggtt tttcttctct ttgcctagtt ttgaacacag 1501 ctaaaaacac ccgcccaccc tatttttcac ttcgaagtca attaattggc cgttctcttg 1561 attccttaat accaaactat cttcacgcca tactgtttct ctgttaaacc cttttcattt 1621 attttgaaaa aagctgttga cgtctgtgcc ttaattgaat acatgcaaac ggacttggaa 1681 gtgacatgat tcaaaaatac atattctcat ttcaaattca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1741 aaaaaaaaaa

2. Sekuen Daphnia pulex partial mRNA for actin, isoform 1 (GenBank:AJ245730.1)

1 catcacacct tctacaacga gttgcgtgtc gcccctgagg aacaccccgt cctcttgacc 61 gaagctcctc ttaatcccaa ggccaatcgc gagaagatga ctcagatcat gttcgagacc 121 ttcaacaccc cggccatgta cgtcgccatt caggccgtac tttccctgta cgcttctggt 181 cgtaccactg gtatcgtgtt ggactctggt gatggtgttt cccacactgt tccaatttac 241 gaaggttacg ctctgcccca tgccatcctt cgtttggact tggctggacg tgacttgacc 301 gattacttga tgaagatttt gactgaacgc ggttactcct tcaccaccac tgccgagcgt 361 gaaatcgttc gtgacatcaa ggagaaactt tgctatgtcg ctttggactt cgaacaagag 421 atggccactg ctgcctcctc cacttcattg gagaagtctt acgaactccc cgacggtcag 481 gtcatcacca ttggcaatga gcgattccgt tgcccagagg ccctcttcca gccttcattc 541 ttgggtatgg agtcttgcgg tctgcatgag actacctaca actcgatcat gaagtgcgat 601 gtcgacatcc gtaaggatct gtacgccaac actgtccttt ccggtggcac caccatgtac 661 cccggcattg ctgatcgtat gcaaaaggag atcactgctc ttgctccatc taccatgaag 721 atcaagatca ttgctcc

3. Sekuen Daphnia pulex partial mRNA for actin, isoform 2 (GenBank: AJ245731.1)

1 ccctaatcaa tcaacatgtk tkacgatkat gttgccgctt tggttgtkga caacggatcc 61 ggtatgtkcw aggytggatt ckccggakat gacgcccctc gtkccgtctt cccatctwty 121 gtyggccgcc cgctccacca gggtgtcatg gtgggtatkg gtcawahaka ctcgtacgtc 181 ggtkacgaag cccagtccaa ackttgtatt ttyactttta watacccgat tgatcacggw 241 atcatcacca actggkacga catggagawk atctggcatc acaccttcta caacgagttt 301 cgtgthgccc cttatgagca ccccattctc ctgaytgaag ctcccctcaa ccccaaggct 361 aaccgtgaaa aggtgaccca gatcatgttc gagaccttca actgcccggc catgtacgtc 421 gccatccagg ctgtgctctc cctgtacgct tccggtcgta ccaccggtat cgttttggac 481 tctggtgatg gtgtctctca caccgttccc atctatgaag gttacgctct gccccacgcc 541 atcctccgtc tggacttggc cggccgtgac ttgactgact acttgatgaa gatcttgact 601 gagcgcggtt acagcttaac caccaccgcc gagcgtgaaa tcgttcgtga catcaaggag 661 aaattgtgct acgtcgccct agacttcgaa caggaaatgg ccaccgccga tgcctccacc 721 tccttggaga aatcctacga attgcccgat ggccaggtca tcaccatcgg taacgaacgt 781 ttccgttgcc ccgaagccct cttccaaccc tcattcttgg gtatggaatc ttgcggcata 841 cacgagacgg tctacagctc gatcatgaag tgtgacgtcg acatccgtaa ggatctgtac 901 gccaacaatg tcctctccgg tggcaccacc atgtaccccg gtattgctga tcgtatgcaa 961 aaggaaatca ctgccctcgc cccatccacc atcaagatca agatcattgc tcc

4. Sekuen Daphnia pulex partial mRNA for actin, isoform 3 (GenBank: AJ245732.1)

1 gtccccagtc ggttagctca acagagcaaa cgtacctgtt tttttccagt tcactcgccc 61 ccagacttaa ttcatcaaca tgtgtgacga tgatgttgcg gctttggttg tggacaacgg 121 atccggtatg tgcaaggctg gattcgccgg agatgacgcc ccccgtgccg tcttcccctc 181 cattgtcggc cgtcctcgcc accagggtgt catggtgggt atgggacaga aagactcgta 241 cgtcggtgac gaggcccaat ccaaacgtgg tattttgact ctgaaatacc caattgagca 301 cggcatcatc accaactggg atgacatgga aaagatctgg caccacacct tctacaacga 361 gttgcgcgtg gctcccgagg aacaccccat cctcttgact gaggcccccc ttaaccccaa 421 ggctaatcgt gagaagatga cccagatcat gttcgagacc ttcaactgcc cggccatgta 481 cgttgccatc caggccgtcc tctccctcta tgcctccggt cgtaccactg gtatcgtcct 541 cgactccggt gatggtgtct cccacactgt ccccatttat gaaggttacg ccctgcccca 601 cgccatcctc cgtctggatt tggctggtcg cgacttgact gactacttga tgaagatctt 661 gactgaacgc ggttacagct tcaccaccac cgctgagcgt gaaatcgtcc gtgacatcaa 721 ggagaaattg tgctatgtcg ccctggactt tgaacaggaa atggccactg ctgctgcctc 781 cacctctttg gagaaatcct atgaattgcc cgatggtcag gtcatcacca ttggcaacga 841 gcgatttcgc tgccccgagg ccctcttcca gccctcattc ttgggtatgg aatcttgcgg 901 tatccacgag accgtctaca actcgatcat gaagtgcgac gtcgacatcc gtaaggatct 961 gtacgcaact gtcttgtccg gaggcaccac catgtacccc ggtattgctg atcgtatgca 1021 aaaggaaatc accgccttgg ccccatcacc atcagatcta ratca

5. Sekuen Daphnia pulex partial mRNA for actin, isoform 4 (GenBank: AJ245733.1)

1 ccggcaggaa tagttcgata ccaagggatc ccccctgtcg aatcctttgt tttactttta 61 cgtttcgctc gtctaaagaa aactacccta aaacaaaaat gtgcgacgat gaagtagcag 121 cgttggttgt tgacaacgaa tccggtatgt gcaaggctgg attcgccgga gatgacgccc 181 ctcgcgccgt cttcccatcc attgtcggcc gcccccgtta ccagggcatc atggtcggta 241 tgggtcagaa ggactcgtac gtcggtgacg aggctcaatc caaacgtggt atcttgaccg 301 tcaagtaccc gatcgagcac ggcatcgtca ccaactggga tgacatggaa aagatctggc 361 accacacctt ctacaatgag ttgcgtgtcg ccccagagga acaccccgtc ctcctcactg 421 aagctcccct caaccccaag gctaaccgtg agaagatgac ccagatcatg ttcgagactt 481 tcaacacacc cgccatgtac gttgccatcc aagccgtgct ctccctgtac gcttccggtc 541 gtaccaccgg tatcgtgctg gattccggtg atggtgtctc tcacaccgtc cccatttacg 601 aaggttacgc ccttcctcac gctatcctgc gtctggatct cgctggccgt gatctgaccg 661 attacttgat gaagattctg actgaacgcg gttactcgtt caccaccacc gccgagcgtg 721 aaatcgttcg cgacatcaag gagaagctct gctatgtcgc cctcgacttt gaacaggaga 781 tgcccaccgc cgcctcctcc acctccctgg aaaagtcgta cgagcttccc gacggtcagg 841 tcatcaccat cggcaatgag cgattccgtt gccccgaggc tctcttccag cccagcttct 901 tgggtatgga gtcttgcggc atccacgaga ccacctacaa ctcgatcatg aagtgcgacg 961 tcgacatccg taaggatctg tacgccaaca ctgtcctgtc tggtggcacc accatgtacc 1021 caggcattgc tgaccgcatg cagaaggaaa tcaccgcctt ggctccatcc accatgaaga 1081 tcaagatcat tgctcc

Lampiran 6. Hasil pengukuran pita DNA dan contoh perhitungan jumlah copy DNA

1. Contoh digitasi dan hasil pada bind GFP

Keterangan:

Standar : Acuan pengukuran ketebalan pita pada proses digitasi

A : Hasil digitasi (running elektroforesis 3 μL) pada plasmid mix DNA B : Hasil digitasi (running elektroforesis 3 μL) pada perlakuan

M1 : Marker DNA 5 kbp, standar 10,6 ng, running elektroforesis 4 μL M2 : Marker DNA 3 kbp, standar 5,04 ng, running elektroforesis 4 μL Maka, standar marker DNA berbanding sampel (running elektroforesis):

Dalam dokumen DETEKSI KEMAMPUAN ARTEMIA DAN KUTU AIR DALAM UPTAKE BAKTERI MENGANDUNG DNA ASING MENGGUNAKAN PCR MUHAMMAD FUADI (Halaman 41-0)