METODE PENELITIAN
3.1. WAKTU DAN TEMPAT PENELITIAN
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi Kesehatan, Bidang Botani, Pusat Penelitian Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) - Cibinong pada bulan Maret sampai bulan Mei 2015.
3.2.ALAT DAN BAHAN 3.2.1. Alat
Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah erlenmeyer, kertas saring, membran penyaring 0.2 µ, corong, cawan petri, tabung reaksi, rak tabung reaksi, pinset, vortex, incubator, mikroplate, miroplate reader, jarum ose, kapas, kain kasa, spatula, batang pengaduk, mikropipet, bunsen, pinset, alumunium foil, plastik wrap, vial, timbangan analitik, autoklaf, oven, Laminar Air flow (LAF), lemari pendingin, seperangkat alat filtrasi, dan spektrofotometer UV-Vis.
3.2.2. Bahan 3.2.2.1.Tanaman
Jeruk nipis (Citrus aurantiolia (Christm.) Swingle) yang diperoleh dari kelurahan Cipondoh Indah, kecamatan Cipondoh - Tangerang. Buah ini dipetik pada tanggal 9 Maret 2015 dan 26 April 2015.
3.2.2.2.Bakteri Uji
Kultur Staphylococcus aureus yang telah diisolasi dari kulit manusia.
3.2.2.3.Bahan Lainnya
Aquadest steril, etanol 96%, NaCl fisiologis, lugol, safranin, kristal violet 1 %, media heterotrof (HTR) cair, luria bertani (LB) agar, klorin, biorem 1 (basa alkali), biorem 10 (enzim), media kingler iron agar (KIA), susu skim, H2O2 3%, dan media pelarut fosfat,.
13
3.3.METODE
3.3.1. Determinasi Jeruk Nipis (Citrus aurantiolia (Christm.) Swingle)
Determinasi dilakukan untuk memastikan klasifikasi tanaman yang digunakan dalam penelitian. Determinasi terhadap jeruk nipis (Citrus aurantiolia (Christm.) Swingle) dilakukan di Herbarium Bogoriense LIPI – Cibinong.
3.3.2. Sterilisasi Alat dan Bahan
Seluruh alat yang akan digunakan dalam penelitian dicuci bersih, dikeringkan dan disterilkan terlebih dahulu. Gelas beker, erlenmeyer, cawan petri, tabung reaksi, jarum ose, spatula, dan pinset disterilkan dengan autoklaf pada suhu 1210C selama 15 menit. Alat-alat kaca seperti gelas beker, Erlenmeyer, dan tabung reaksi ditutup mulutnya dengan kapas dan cawan petri dibungkus dengan kertas. Bahan-bahan yang terbuat dari karet disterilkan dengan direndam dalam alcohol 70% dan jarum ose disterilkan dengan nyala Bunsen (Pertiwi, 2010).
Seluruh media pembenihan (nutrient agar dan media heterotrof) disterilkan dengan autoklaf pada suhu 1210C selama 15 menit. Pengerjaan aseptis dilakukan di dalam lemari aseptis yang sebelumnya telah dibersihkan dengan alkohol, lalu disterilkan dengan UV yang dinyalakan selama lebih kurang 2 jam sebelum digunakan.
3.3.3. Penyiapan Air Perasan Jeruk Nipis (Citrus aurantiolia (Christm.) Swingle)
Jeruk nipis (Citrus aurantiolia (Christm.) Swingle) yang akan digunakan diukur terlebih dahulu menggunakan penggaris, kemudian dicuci dengan air bersih dan dibilas dengan etanol lalu dipotong menjadi 2 bagian. Kemudian airnya diperas kedalam tabung erlenmeyer dan disaring dengan menggunakan kertas saring lalu disaring kembali menggunakan membran penyaring berukuran 0.2 µ m (Ninditha, 2012).
Selanjutnya dilakukan penyiapan berbagai seri konsentrasi air perasan jeruk nipis (Citrus aurantifolia). Konsentrasi air perasan jeruk nipis (Citrus aurantifolia) yang digunakan pada penelitian ini adalah 0.0625%, 0,125%, 0,25%,
14
0,50%, 1%, 2%, 4 % dan 8% v/v. Proses ini dilakukan untuk memperoleh sampel yang siap untuk digunakan.
3.3.4. Pemeriksaan Kandungan Kimia Jeruk Nipis
Penapisan fitokimia dilakukan untuk mengetahui metabolit sekunder yang terkandung di dalam air perasan jeruk nipis (Citrus aurantiolia). Metabolit sekunder yang diuji secara kualitatif ini antara lain alkaloid, flavonoid, steroid, tannin, saponin, triterpenoid dan hidrokuinon. Penapisan fitokimia pada penelitian ini dilakukan oleh Pusat Studi Biofarmaka – LPPM IPB. Metode penapisan fitokimia tersebut dapat dilihat pada lampiran 1.
3.3.5. Karakterisasi Bakteri Staphylococcus aureus
Jarum ose yang berbentuk bulat diusapkan pada kulit kemudian ose tersebut digoreskan pada media BHI dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 370C. Bakteri yang tumbuh pada media kemudian dikarakterisasi menggunakan pewarnaan Gram. Selanjutnya bakteri gram positif yang berbentuk staphylococcus dikarakterisasi menggunakan media KIA, media pelarut fosfat, susu skim 20% dan penambahan H2O2 3% (Breed et al., 1957).
3.3.5.1.Karakterisasi Bakteri Menggunakan Media KIA (Deteksi H2S)
Media KIA (Klingler Iron Agar) dibuat sebanyak 9 ml dengan posisi tegak dalam tabung reaksi. Kemudian ditusukkan sebanyak 1 ose bakteri uji ke dalam media menggunakan ose yang berbentuk jarum. Terbentuknya H2S menunjukkan bahwa bakteri uji adalah Staphylococcus aureus. Terbentuknya H2S dapat dilihat dari perubahan warna pada media dari warna merah menjadi warna hitam pada bekas tusukan bakteri dan dapat juga dilihat dari media agar yang terangkat (Breed, et al., 1957).
3.3.5.2.Karakterisasi Bakteri Menggunakan Media Pelarut Fosfat (Phospatase)
Dibuat media BHI dengan penambahan NaCl, dan Ca3(PO4)2 sebagai media selektif untuk karakterisasi bakteri Staphylococcus aureus. Media dibuat dalam
15
cawan petri. Kemudian ditusukkan sebanyak 1 ose bakteri uji ke dalam media menggunakan ose yang berbentuk jarum. Setelah itu diinkubasi pada suhu 370C selama 24 jam. Terbentuknya zona bening disekitar tempat penusukan bakteri menunjukkan bahwa bakteri uji adalah Staphylococcus aureus (Breed, et al., 1957).
3.3.5.3.Karakterisasi Bakteri Menggunakan Susu Skim 20% (Koagulase) Dibuat susu skim 20%, kemudian dipasteurisasi selama 30 menit pada suhu 900C. Selanjutnya dibuat kultur bakteri dalam tabung appendorf, dengan memasukkan sebanyak 1 mL aquadest kemudian ditambahkan sebanyak 2 ose bakteri ke dalamnya dan divortex hingga homogen. Susu yang telah dipasteurisasi dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 2 mL kemudian ditambahkan 500µL kultur bakteri dan diinkubasi pada suhu 370C selama 24 jam. Terbentuknya gumpalan (koagulasi) menunjukkan bahwa bakteri uji adalah Staphylococcus aureus (Breed, et al., 1957).
3.3.5.4.Karakterisasi Bakteri dengan Penambahan H2O2 3% (Katalase) Sebanyak 1 ose bakteri uji disebar pada kaca objek, kemudian ditambahkan 1 tetes H2O2 3%. Terbentuknya gelembung menunjukkan bahwa bakteri uji adalah Staphylococcus aureus (Breed, et al., 1957).
3.3.6. Pembuatan Medium Agar 3.3.6.1.Luria Bertani Agar
Media luria bertani agar dibuat dengan cara mencampur bacto agar 2.25 gram, yeast ekstrak 0.75 gram, tripton, 1,5 gram, dan NaCl 0.75 gram, kemudian dilarutkan dengan pemanasan dalam 150 mL aquadest. Selanjutnya disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 1210C selama 15 menit. Penuangan media dilakukan ketika masih cair, yaitu pada suhu sekitar 45 – 500C. Kemudian diratakan dengan menggoyang cawan dan diputar membentuk angka 8 sebanyak 3 kali lalu disterilisasi dan disimpan dalam kulkas (Adela, 2011).
16
3.3.6.2.Media Hetrotrof (HTR) Cair
Media HTR cair dibuat dengan cara mencampur pepton 3,75 gram, K2HPO4
0,625, glukosa 0,625 gram, NaCl 1,25 gram dan tripton 0,75 gram, kemudian dilarutkan dengan pemanasan dalam 250 mL aquadest. Selanjutnya disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 1210C selama 15 menit.
3.3.7. Purifikasi dan Karakterisasi Bakteri pada Media Luria Bertani Agar Hasil karakterisasi bakteri Staphylococcus aureus kemudian dipurifikasi (dimurnikan). Teknik yang digunakan adalah Streak Plate. Jarum ose dipanaskan terlebih dahulu sampai berpijar, lalu didinginkan. Kemudian bakteri diambil dan digoreskan pada media luria bertani agar. Selanjutya diinkubasi pada suhu 370C selama 24 jam (Deby et al., 2012). Kemudian dilakukan pengamatan secara morfologis terhadap bakteri Staphylococcus aureus yang telah ditumbuhkan pada media luria bertani agar, serta dilakukan karakterisasi bakteri dengan pewarnaan Gram.
3.3.8. Pembuatan Suspensi Bakteri Staphylococcus aureus
Diambil sebanyak satu ose bakteri Staphylococcus aureus yang telah dibiakkan dan dimasukkan ke dalam tabung berisi media heterotrof (HTR) sebanyak 10 mL dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 370C. Kultur bakteri uji divorteks kemudian diukur nilai optical dencity (OD) pada panjang gelombang 600nm untuk mengetahui konsentrasi dari suspensi bakteri tersebut. Kemudian suspensi bakteri diencerkan mengunakan media HTR hingga OD mencapai 0.5.
3.3.9. Uji Pembentukan dan Pertumbuhan Biofilm Optimal
Uji pembentukan biofilm dilakukan dengan menggunakan 10 mL suspensi bakteri dalam tabung reaksi yang diinkubasi selama 24 jam pada suhu 370C. Jika terbentuk biofilm terlihat lapisan-lapisan seperti benang halus pada suspensi bakteri. Selanjutnya dilakukan uji pertumbuhan biofilm untuk mengetahui waktu inkubasi yang menghasilkan pertumbuhan biofilm Staphylococcus aureus paling baik. Pengujian dilakukan dengan menggunakan microtitier flat-bottom
17
polystyrene 96 wells, dengan cara memvariasikan waktu inkubasinya. Jumlah suspensi bakteri yang dimasukkan adalah 200 µL dengan variasi waktu inkubasi adalah 1, 2, 3, dan 4 hari. Setelah masa inkubasi, microplate dicuci menggunakan air mengalir sebanyak 3 kali, kemudian ditambahkan 200 µL larutan kristal violet 1% ke tiap well dan diinkubasi pada suhu ruang selama 15 menit. Microplate dicuci kembali dengan cara yang sama seperti sebelumnya, yaitu dengan air mengalir sebanyak 3 kali. Larutan etanol 96% sebanyak 200 µL dimasukkan ke tiap well dan diinkubasi pada suhu ruang selama 15 menit. Pebacaan Optical Dencity (OD) dilakukan dengan Mark Bio-Rad microplate reader pada panjang gelombang 595nm. Pengujian dilakukan triplo. Hasil absorbansi terbesar pada waktu inkubasi dan jumlah bakteri tersebut dinyatakan memiliki pembentukan biofilm yang optimal (George, 2011).
3.3.10.Uji Aktivitas Antibiofilm Secara In Vitro (Yosephine, 2013)
Uji Pencegahan Pembentukan Biofilm pada Permukaan
Uji ini dilakukan untuk mengetahui aktivitas air perasan jeruk nipis terhadap pencegahan pembentukan biofilm Staphylococcus aureus. Pengujian dilakukan dengan menggunakan microtitier flat-bottom polystyrene 96 wells. Pengujian dilakukan terhadap masing-masing ekstrak tanaman dengan variasi konsentrasi 0.0625%, 0,125%, 0,25%, 0,50%, 1%, 2%, 4 % dan 8% v/v. 200 µL ekstrak tanaman terlebih dahulu dimasukkan pada tiap well dan diinkubasi selama 1 jam, kemudian ekstrak tanaman dibuang lalu dimasukkan suspensi bakteri sebanyak 200 µL pada tiap well. Suspensi uji kemudian diinkubasi selama 2 hari pada suhu 370C. Setelah masa inkubasi, microplate dicuci menggunakan air mengalir sebanyak 3 kali, kemudian ditambahkan 200 µL larutan kristal violet 1% ke tiap well dan diinkubasi pada suhu ruang selama 15 menit. Microplate dicuci kembali dengan cara yang sama seperti sebelumnya, yaitu dengan air mengalir sebanyak 3 kali. Larutan etanol 96% sebanyak 200 µL dimasukkan ke tiap well dan diinkubasi pada suhu ruang selama 15 menit. Pebacaan Optical Dencity (OD) dilakukan dengan Mark Bio-Rad microplate reader pada panjang gelombang 595nm. Pengujian dilakukan triplo.
18
Uji Penghambatan Pertumbuhan dan Perkembangan Biofilm
Uji ini dilakukan untuk mengetahui aktivitas air perasan jeruk nipis terhadap penghambatan pertumbuhan biofilm Staphylococcus aureus. Pengujian dilakukan dengan menggunakan microplate flat-bottom polystyrene 96 wells. Suspensi bakteri, ekstrak dan media dimasukkan dalam waktu bersamaan. Media HTR yang dimasukkan sebanyak 60 µL, suspense bakteri sebanyak 70 µL dan ekstrak tanaman sebanyak 70 µL dengan variasi konsentrasi 0,125%, 0,25%, 0,50%, 1%, 2%, 4 % dan 8% v/v. Suspensi uji kemudian diinkubasi selama 2 hari pada suhu 370C. Setelah masa inkubasi, microplate dicuci menggunakan air mengalir sebanyak 3 kali, kemudian ditambahkan 200 µL larutan kristal violet 1% ke tiap well dan diinkubasi pada suhu ruang selama 15 menit. Microplate dicuci kembali dengan cara yang sama seperti sebelumnya, yaitu dengan air mengalir sebanyak 3 kali. Larutan etanol 96% sebanyak 200 µL dimasukkan ke tiap well dan diinkubasi pada suhu ruang selama 15 menit. Pebacaan Optical Dencity (OD) dilakukan dengan Mark Bio-Rad microplate reader pada panjang gelombang 595nm di laboratorium mikrobiologi, LIPI Cibinong. Pengujian dilakukan triplo. % penghambatan =
Uji Penghancuran (Degradasi) Biofilm
Uji ini dilakukan untuk mengetahui aktivitas air perasan jeruk nipis dalam mendegradasi biofilm Staphylococcus aureus. Pengujian ini dilakukan sebagaimana penghambatan perlekatan dan pertumbuhan biofilm hanya saja suspensi ekstrak uji ditambahkan pada saat biofilm telah terbentuk. Biofilm terbentuk setelah masing-masing wells diinkubasi selama 2 hari pada suhu 370C dengan jumlah suspensi bakteri sebanyak 200 µL. Setelah terbentuknya biofilm, suspensi dalam microplate tersebut dibuang, kemudian dimasukkan 200 µL ekstrak tanaman dengan variasi konsentrasi 0,125%, 0,25%, 0,50%, 1%, 2%, 4 % dan 8% v/v. Setelah itu diinkubasi dalam suhu ruang selama 1 jam. Setelah masa inkubasi, microplate dicuci menggunakan air mengalir sebanyak tiga kali, dan seterusnya sebagaimana dilakukan pada uji penghambatan perlekatan dan
19
pertumbuhan biofilm. Persentase pendegradasian dari biofilm dapat diukur dengan rumus sebagai berikut :
% penghancuran =
3.3.11.Rancangan Penelitian dan Analisis Data
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratories dengan desain penelitian post test only control-group design. Data yang diperoleh merupakan data kuantitatif berupa nilai absorbansi atau Optical Density (OD595nm). Data hasil pengujian aktivitas antibiofilm air perasan jeruk nipis (Citrus auranifolia (Christm) Swingle) terhadap pencegahan pembentukan, penghambatan pertumbuhan dan penghancuran biofilm Staphylococcus aureus dianalisis secara statistik. Tujuan dilakukan analisa statistik adalah untuk melihat apakah air perasan jeruk nipis memperlihatkan perbedaan aktivitas antibiofilm yang signifikan terhadap biofilm yang dibentuk oleh bakteri Staphylococcus aureus. Data yang diperoleh dianalisis secara deskriptif, uji homogenitas dilakukan dengan menggunakan Levene dan uji normalitas menggunakan Kolmogorov-Smirnov test. Apabila hasil sebaran data normal, maka untuk melihat perbedaan kadar masing-masing kelompok perlakuan dianalisis dengan uji statistik One way ANOVA.
Hipotesis :
Ho : tidak ada perbedaan yang bermakna antara setiap kelompok Ha : terdapat perbedaan yang bermakna antara setiap kelompok. Pengambilan keputusan :
Bila nilai signifikansi ≤0.05 Ho ditolak, berarti terdapat perbedaan
Bilai nilai signifikansi ≥0.05 Ho diterima, berarti tidak terdapat perbedaan (Santoso, 2009).
20
Pada penelitian ini, optimasi aktivitas terseleksi dilakukan dengan menggunakan aplikasi metode Response Surface Analysis (RSA). Konsentrasi air perasan jeruk nipis, suhu dan waktu inkubasi yang digunakan divariasikan. Tujuannya adalah untuk mengetahui konsentrasi air perasan jeruk nipis dengan suhu dan waktu inkubasi yang menunjukkan aktivitas optimal. Kemudian dilakukan uji aktivitas antibiofilm dengan konsentrasi air perasan jeruk nipis, waktu inkubasi, dan suhu yang digunakan sesuai dengan kondisi optimal yang diperoleh dari RSA dan hasilnya dibandingkan dengan kontrol positif.
21
BAB IV