Deteksi Afrikanisasi Lebah Apis mellifera Berdasarkan Gen Sitokrom B Dari DNA Mitokondria

DETEKSI AFRIKANISASI LEBAH

Apis mellifera

BERDASARKAN GEN

SITOKROM B DARI DNA MITOKONDRIA

Oleh:

ANIFA BINTAR RAHMAWATI

G34102010

DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

ABSTRAK

ANIFA BINTAR RAHMAWATI. Deteksi Afrikanisasi Pada Lebah Apis mellifera Berdasarkan Gen Sitokrom B Dari DNA Mitokondria. Dibimbing oleh RIKA RAFFIUDIN dan M. CHANDRA WIDJAJA.

Apis mellifera merupakan lebah madu yang persebaran alaminya meliputi daerah Mediterania, Afrika, dan Eropa. Berdasarkan analisis morfometrik, Apis mellifera terbagi kedalam 24 subspesies yang terdiri dari kelompok garis keturunan A (Afrika), M (Eropa Utara dan Barat), C (Eropa Selatan) dan O (Timur Tengah). Peternak lebah di dunia banyak yang mengimpor A. mellifera. Peternak di Indonesia umumnya mengimpor dari Australia. Peternakan lebah menjadi terancam sejak A. m. scutellata diimpor dari Afrika ke Brazil yang keturunannya dengan A. m. ligustica menghasilkan Africanized honeybee yang bersifat agresif. Hingga saat ini belum ada usaha untuk mendeteksi keberadaan AHB di peternakan lebah madu Indonesia khususnya di lembaga yang berwenang seperti Balai Karantina Hewan. Tujuan penelitian ini adalah untuk mendeteksi afrikanisasi pada lebah A. mellifera berdasarkan gen sitokrom b dari DNA mitokondria. Keberadaan lebah AHB dapat dideteksi dari DNA mitokondria melalui gen sitokrom b berdasarkan keberadaan situs pemotongan enzim BglII. Hasil amplifikasi daerah gen sitokrom b dengan menggunakan primer forward dan reverse sitokrom b menghasilkan fragmen DNA berukuran 485 pb. Hasil pemotongan fragmen DNA tersebut dengan BglII menghasilkan satu mitotipe yang terdiri dari dua fragmen DNA masing-masing berukuran 194 pb dan 291 pb. Data DNA hasil restriksi menunjukkan bahwa belum ada AHB di Jawa.

ABSTRACT

ANIFA BINTAR RAHMAWATI. Detection africanized of A. mellifera honeybee based on cytochrome b gene in mitochondria DNA. Supervised by RIKA RAFFIUDIN and M. CHANDRA WIDJAJA.

DETEKSI AFRIKANISASI LEBAH

Apis mellifera

BERDASARKAN GEN

SITOKROM B DARI DNA MITOKONDRIA

Skripsi

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains

Pada Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Institut Pertanian Bogor

Oleh:

Anifa Bintar Rahmawati

G34102010

DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

Judul Skripsi : Deteksi Afrikanisasi Lebah

Apis mellifera Berdasarkan Gen

Sitokrom B Dari DNA Mitokondria

Nama

: Anifa Bintar Rahmawati

NRP

: G34102010

Menyetujui:

Pembimbing I,

Pembimbing II,

Dr. Ir. Rika Raffiudin, Msi

Drs. Chandra Widjaja,MM

NIP 131 999 583

NIP 080 057 508

Mengetahui:

Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Institut Pertanian Bogor

Prof. Dr. Ir. Yonny Koesmaryono, MS.

NIP 131473999

PRAKATA

Alhamdulillah segala puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat allah SWT atas segala rahmat serta limpahan karunianya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan.

Penulis ingin mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada Dr. Ir. Rika Raffiudin, MSi. dan Drs. M. Chandra Widjaja, MM. atas bimbingan, saran, dan perhatiannya yang sangat besar selama ini. Terima kasih untuk Dr. Nampiah Sukarno, Msi. Atas masukan dan kritiknya terhadap karya ilmiah ini. Ucapan terima kasih juga penulis ucapkan untuk mbak Zulfarida dan Apriani yang telah membantu selama penelitian di Laboratorium. Ucapan terima kasih juga kepada seluruh dosen Zoologi; Ibu Taruni, Bapak Heru, Ibu Wita Farajalah, Bapak Ahmad Farajalah, Bapak Bambang Suryobroto, Bapak Tri Atmowidi, kak Berry, dan mbak Kanthi, juga staf Zoologi mbak Tini atas nasehatnya, pak Djupri, dan pak Adi. Terima kasih juga untuk teman-teman di Laboratorium Zoologi atas kebersamaannya selama ini: Isma, Adisti, Rian Haris, Ikbal, Bian, Gema, Wida, Rifah, Sanah, Sumi, Dian Erlangga, dan seluruh teman-teman Biologi 39. Ucapan terima kasih juga untuk seluruh warga Griya Amani, kelompok azzahra dan seseorang yang memberikan semangat didalam hatiku.

Akhirnya, penulis ingin mengucapkan terima kasih yang sangat mendalam untuk Bapak dan Ibu, adik-adik: Putra Aminudin dan Ainin Jariati atas dukungan, semangat, kasih sayang serta doanya selama ini.

Bogor, Mei 2007

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Nabire Pada tanggal 2 Maret 1985 sebagai anak pertama dari tiga bersaudara pasangan Rochmadi dan Siti Qomariah.

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL...

vii

DAFTAR GAMBAR ...

vii

DAFTAR LAMPIRAN...

vii

PENDAHULUAN

Latar Belakang ... 1

BAHAN DAN METODE

Koleksi Lebah ... 1

Ekstraksi dan Isolasi DNA ... 1

Amplikasi DNA Gen Sitokrom b A. mellifera ... 2

Elektroforesis dan Visualisasi DNA... 2

Pengukuran pita DNA ... 2

PCR-RFLP ... 2

Sequencing (pengurutan) DNA dan Alignment (penjajaran) DNA... 3

HASIL

Amplifikasi DNA ... 3

Pemotongan DNA A. mellifera Hasil Amplikasi dengan Enzim Restriksi BglII... 3

Pengurutan DNA A. mellifera ... 3

Alignment DNA... 3

PEMBAHASAN

... 7

KESIMPULAN ...

7

SARAN ...

8

DAFTAR PUSTAKA ...

8

DAFTAR TABEL

Halaman

1. Nukleotida primer yang digunakan untuk mengamplikasi gen sitokrom b A. Mellifera... 2

DAFTAR GAMBAR

Halaman 1. Hasil amplikasi gen sitokrom b A. mellifera menggunakan primer forward dan reverse sitokrom b ... 3

2. Hasil pemotongan gen sitokrom b A. mellifera meggunakan enzim restriksi BglII ... 3

3. Hasil pengurutan nukleotida DNA gen sitokrom b ... 4

4. Homologi urutan nukleotida gen sitokrom b A. mellifera ... 5

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman 1. Daftar nama dan alamat peternak A. mellifera di Jawa Timur, Jawa Tengah, Yogyakarta, dan Jawa Barat... 9

2. Kromatogram hasil pengurutan DNA contoh Am19 Pati menggunakan primer forward sitokrom b ... 11

PENDAHULUAN

Latar belakang

Apis mellifera termasuk kedalam Ordo

Hymenoptera, famili Apidae dan subfamili Apinae (Michener 2000). Lebah A. mellifera adalah lebah madu yang dibudidayakan karena produksi madunya yang tinggi. Lebah madu ada yang hingga saat ini belum semua dapat dibudidayakan. Lebah madu yang telah dapat dibudidayakan adalah dari kelompok lebah A. mellifera, dan A. cerana, sedangkan lebah madu yang belum dapat dibudiyakan yaitu A. koscevnikovi, A. dorsata, A. andreni- formis, A. florea dan A. laboriosa.

Lebah A. mellifera merupakan spesies le- bah madu yang persebarannya paling luas. A. mellifera ditemukan di sebagian besar daerah gurun pasir dan daerah dengan temperatur yang dingin (Ruttner 1988). Persebaran alami A. mellifera adalah di daerah Mediterania, Afrika, dan Eropa.

Berdasarkan analisis morfometrika, Rutt- ner (1988) membagi 24 subspesies ini menjadi empat kelompok garis keturunan (lineage). Garis keturunan A terdiri dari A. mellifera yang daerah persebarannya meliputi daerah Afrika, M meliputi Eropa utara dan barat, C meliputi Eropa Selatan dan O meliputi Timur Tengah. Pengelompokan yang sama juga di- hasilkan oleh Franck et al. (2000) berdasarkan DNA mitokondria.

Peternak lebah di dunia banyak mengim- por beberapa subspesies A. mellifera yaitu A. m. mellifera dan A. m. ligustica dari Eropa. Hal itu karena sifat jinak serta produksi ma- dunya yang tinggi (Gojmerac 1983).

Peternakan lebah menjadi terancam sejak lebah madu A. m. scutellata yang berasal dari Afrika diimpor ke Brazil pada tahun 1956. Lebah Afrika tersebut diimpor dengan tujuan untuk mendapat galur lebah yang adaptasinya baik di daerah tropis. A. m. scutellata menga- lami hibridisasi dengan lebah madu Eropa yaitu A. m. ligustica dan A. m. mellifera yang menghasilkan Africanized honey bee (AHB) (Kenneth 1999). AHB memiliki sifat ganas, sengat yang mematikan dan sangat cepat dalam perbanyakan koloni (Sheppard 1999). Keturunan lebah AHB ini tersebar dari Brazil ke Meksiko, Texas, Arizona, dan California (Schneider et al. 2003).

Secara morfologi peternak lebah tidak dapat membedakan antara lebah AHB dan

lebah madu Eropa (bukan AHB). Penelitian dasar untuk mendeteksi lebah AHB dilakukan dengan menggunakan penanda molekuler mitokondria DNA. Mitokondria DNA diturun- kan secara maternal melalui sitoplasma, tidak mengalami rekombinasi atau sedikit terjadi rekombinasi gen (Hoy 1994). Gen sitokrom b pada DNA mitokondria yang dipotong dengan enzim BglII dapat digunakan untuk mende- teksi AHB. Berdasarkan Crozier et al. (1991) enzim BglII mampu untuk memotong gen sitokrom b yang digunakan untuk mendeteksi AHB. Selain BglII dengan gen sitokrom b, enzim dan daerah gen lain dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan lebah AHB. Daerah gen tersebut adalah lrRNA/Eco RI dan cox 1/Hinc II (Pinto et al. 2003).

Hingga saat ini belum ada usaha untuk mendeteksi keberadaan AHB di peternakan lebah madu di Indonesia khususnya di Balai Karantina Hewan. Penelitian ini bertujuan untuk mendeteksi afrikanisasi lebah A. melli- fera di pulau Jawa berdasarkan gen sitokrom b pada DNA mitokondria.

Bahan dan Metode

Koleksi Lebah

Contoh lebah diperoleh dari hasil pengkoleksian lebah madu pada tahun 2005 yang dilakukan di Pati (Jawa Tengah) dan Jember (Jawa Timur) (Raffiudin 2006). Se- banyak 70 koloni lebah yang berasal dari Pati dan Jember disimpan dalam tabung berisi etanol absolut.

Ekstraksi dan Isolasi DNA

Ekstraksi DNA sudah dilakukan oleh peneliti sebelumnya (Hidayat 2006, Raffiudin 2006). Secara garis besar tahap persiapan dan pelaksanaan ekstraksi DNA adalah sebagai berikut.

Tabel 1 Nukleotida primer yang digunakan untuk mengamplifikasi gen sitokrom b A. mellifera berdasarkan posisi urutan DNA mitokondria A. mellifera Crozier & Crozier (1993)

Sebanyak 200 µl cetyl trimetyl amonium bromida (CTAB) konsentrasi 20% dimasuk- kan ke dalam tabung berisi toraks yang sudah digerus untuk melisis membran. Kemudian ditambahkan 14 µl proteinase K dengan kon- sentrasi 5 mg/µl dan diinkubasi pada suhu 55ºC selama dua jam. Larutan berisi campuran CTAB dan proteinase K disentrifugasi 13000 rpm (10 menit). Supernatan yang berisi DNA dipindahkan ke dalam tabung steril baru, kemudian ditambahkan 250 µl Chloroform Isoamil Alkohol (C:IAA=24:1). Supernatan dikocok (5 menit) dan disentrifugasi 13000 rpm (5 menit). Fenol kloroform isoamil alko- hol (P:C:I=25:24:1) kemudian disentrifugasi 13000 rpm (1menit). Larutan berisi DNA di- pindahkan ke tabung 1.5 ml steril dan ditam- bahkan 400 µl CIAA, lalu dikocok (5 menit).

Larutan berisi DNA disentrifugasi 13000 rpm (3 menit), kemudian supernatan dipindah- kan ke tabung baru. DNA yang terlarut dalam supernatan dipresipitasi dengan menggunakan 600 µl isopropanol selama semalam pada suhu

−4 ºC. Campuran DNA dan isopropanol di- sentrifugasi 13000 rpm selama 30 menit. Etanol 70% sebanyak 500 µl ditambahkan pada pelet DNA. Campuran tersebut disentri- fugasi 13000 rpm (10 menit) pada suhu 4 oC. Etanol dibuang dan pelet DNA dikeringkan dengan cara divakum (30 menit). DNA hasil ekstraksi dilarutkan dalam TE 0.5 mM dan disimpan pada suhu −4 oC.

Amplifikasi DNA Gen Sitokrom bA. melli- fera

DNA lebah diamplifikasi menggunakan mesin PCR TaKaRa Thermal Cycler. Pe-reaksi PCR terdiri atas ddH20, 2.5 µM dNTP, Mg 2+ free buffer, 25 µM MgCl2, 10 µM pri-

mer sitokrom b reverse, 10 µM primer sito- krom b forward (Tabel 1) (Crozier et al. 1991), Taq polimerase 5 unit/0.1 µl, dan DNA hasil ekstraksi. Proses PCR dilakukan dengan tahapan; denaturation (pemisahan DNA utas ganda) pada 94 ºC selama 1 menit, annealing (penempelan primer) pada 55 ºC selama 1 menit, dan elongation (pemanjangan) pada 72

º

C selama 2 menit. Semua tahap dilakukan selama 30 siklus.

Elektroforesis dan Visualisasi DNA

DNA hasil amplifikasi dipisahkan dengan polyacrilamide gel electrophoresis (PAGE) 6% menggunakan bufer 1 x Tris 0.5 M, Asam borat 0.65 M, EDTA 0.02M (TBE). Arus lis- trik yang digunakan sebesar 160 V selama 90 menit. Visualisasi DNA dalam gel poli akrilamid dilakukan dengan pewarnaan perak (Silver staining) yang dilakukan dalam sha- king bath (Tegelstrom 1986). Gel hasil elektroforesis dicuci dengan larutan CTAB (0.2 gr/200 ml akuades) selama 8 menit. Kemudian gel dicuci dengan aquades dua kali masing-masing 2 menit. Setelah itu gel dibilas lagi dalam larutan NH4OH (2 ml/200 ml

akuades) selama 6 menit.

Selanjutnya gel direndam dalam cam- puran larutan 0.32 AgNO3, 0.8 ml NH4OH,

dan akuades 200 ml selama 10 menit. Kemu- dian gel dicuci lagi menggunakan aquades dua kali masing-masing 2 menit. Setelah itu gel direndam dalam campuran larutan 4 gr Na2CO3, 100 µl formaldehida, dan 200 ml

akuades sampai muncul pita DNA. Terakhir, gel direndam dalam larutan asam asetat 1% dalam 200 ml akuades untuk pengawetan pita DNA.

Pengukuran pita DNA

Pengukuran pita DNA dilakukan untuk mengetahui ukuran DNA berdasarkan gel akrilamida. Pengukuran ini dilakukan pada pita penanda DNA dan pada DNA target. Penentuan ukuran pita DNA target berdasar- kan regresi menggunakan program R (the R Development Core Team Version 1.6.0) (Ve- nables & Ripley 1999).

PCR-RFLP

DNA A. mellifera hasil amplifikasi dipo- tong menggunakan enzim restriksi BglII. Enzim restriksi BglII merupakan enzim pemo- tong enam basa. Situs pemotongannya adalah

AGATCT (Griffiths et al. 1999) memotong basa ke 291 gen sitokrom b pada GenBank L06178. Komposisi pereaksi RFLP dalam total reaksi 4 µl terdiri atas DNA hasil amplifikasi 2 µl, 10 x bufer enzim BglII 0.4 µl, enzim BglII 10 unit/0.5 µl, air destilata Nama Primer Susunan nukleotida primer (5’-3’) Posisi nukelotida primer

pada mitokondria total Sitokrom b Forward TATGTACTACCTTGAGGACAAATATC 11400-11425

Sitokrom b Reverse ATTACACCTCCTAATTTATTAGGAAT 11859-11884

DETEKSI AFRIKANISASI LEBAH

Apis mellifera

BERDASARKAN GEN

SITOKROM B DARI DNA MITOKONDRIA

Oleh:

ANIFA BINTAR RAHMAWATI

G34102010

DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

ABSTRAK

ANIFA BINTAR RAHMAWATI. Deteksi Afrikanisasi Pada Lebah Apis mellifera Berdasarkan Gen Sitokrom B Dari DNA Mitokondria. Dibimbing oleh RIKA RAFFIUDIN dan M. CHANDRA WIDJAJA.

Apis mellifera merupakan lebah madu yang persebaran alaminya meliputi daerah Mediterania, Afrika, dan Eropa. Berdasarkan analisis morfometrik, Apis mellifera terbagi kedalam 24 subspesies yang terdiri dari kelompok garis keturunan A (Afrika), M (Eropa Utara dan Barat), C (Eropa Selatan) dan O (Timur Tengah). Peternak lebah di dunia banyak yang mengimpor A. mellifera. Peternak di Indonesia umumnya mengimpor dari Australia. Peternakan lebah menjadi terancam sejak A. m. scutellata diimpor dari Afrika ke Brazil yang keturunannya dengan A. m. ligustica menghasilkan Africanized honeybee yang bersifat agresif. Hingga saat ini belum ada usaha untuk mendeteksi keberadaan AHB di peternakan lebah madu Indonesia khususnya di lembaga yang berwenang seperti Balai Karantina Hewan. Tujuan penelitian ini adalah untuk mendeteksi afrikanisasi pada lebah A. mellifera berdasarkan gen sitokrom b dari DNA mitokondria. Keberadaan lebah AHB dapat dideteksi dari DNA mitokondria melalui gen sitokrom b berdasarkan keberadaan situs pemotongan enzim BglII. Hasil amplifikasi daerah gen sitokrom b dengan menggunakan primer forward dan reverse sitokrom b menghasilkan fragmen DNA berukuran 485 pb. Hasil pemotongan fragmen DNA tersebut dengan BglII menghasilkan satu mitotipe yang terdiri dari dua fragmen DNA masing-masing berukuran 194 pb dan 291 pb. Data DNA hasil restriksi menunjukkan bahwa belum ada AHB di Jawa.

ABSTRACT

ANIFA BINTAR RAHMAWATI. Detection africanized of A. mellifera honeybee based on cytochrome b gene in mitochondria DNA. Supervised by RIKA RAFFIUDIN and M. CHANDRA WIDJAJA.

DETEKSI AFRIKANISASI LEBAH

Apis mellifera

BERDASARKAN GEN

SITOKROM B DARI DNA MITOKONDRIA

Skripsi

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains

Pada Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Institut Pertanian Bogor

Oleh:

Anifa Bintar Rahmawati

G34102010

DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

Judul Skripsi : Deteksi Afrikanisasi Lebah

Apis mellifera Berdasarkan Gen

Sitokrom B Dari DNA Mitokondria

Nama

: Anifa Bintar Rahmawati

NRP

: G34102010

Menyetujui:

Pembimbing I,

Pembimbing II,

Dr. Ir. Rika Raffiudin, Msi

Drs. Chandra Widjaja,MM

NIP 131 999 583

NIP 080 057 508

Mengetahui:

Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Institut Pertanian Bogor

Prof. Dr. Ir. Yonny Koesmaryono, MS.

NIP 131473999

PRAKATA

Alhamdulillah segala puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat allah SWT atas segala rahmat serta limpahan karunianya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan.

Penulis ingin mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada Dr. Ir. Rika Raffiudin, MSi. dan Drs. M. Chandra Widjaja, MM. atas bimbingan, saran, dan perhatiannya yang sangat besar selama ini. Terima kasih untuk Dr. Nampiah Sukarno, Msi. Atas masukan dan kritiknya terhadap karya ilmiah ini. Ucapan terima kasih juga penulis ucapkan untuk mbak Zulfarida dan Apriani yang telah membantu selama penelitian di Laboratorium. Ucapan terima kasih juga kepada seluruh dosen Zoologi; Ibu Taruni, Bapak Heru, Ibu Wita Farajalah, Bapak Ahmad Farajalah, Bapak Bambang Suryobroto, Bapak Tri Atmowidi, kak Berry, dan mbak Kanthi, juga staf Zoologi mbak Tini atas nasehatnya, pak Djupri, dan pak Adi. Terima kasih juga untuk teman-teman di Laboratorium Zoologi atas kebersamaannya selama ini: Isma, Adisti, Rian Haris, Ikbal, Bian, Gema, Wida, Rifah, Sanah, Sumi, Dian Erlangga, dan seluruh teman-teman Biologi 39. Ucapan terima kasih juga untuk seluruh warga Griya Amani, kelompok azzahra dan seseorang yang memberikan semangat didalam hatiku.

Akhirnya, penulis ingin mengucapkan terima kasih yang sangat mendalam untuk Bapak dan Ibu, adik-adik: Putra Aminudin dan Ainin Jariati atas dukungan, semangat, kasih sayang serta doanya selama ini.

Bogor, Mei 2007

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Nabire Pada tanggal 2 Maret 1985 sebagai anak pertama dari tiga bersaudara pasangan Rochmadi dan Siti Qomariah.

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL...

vii

DAFTAR GAMBAR ...

vii

DAFTAR LAMPIRAN...

vii

PENDAHULUAN

Latar Belakang ... 1

BAHAN DAN METODE

Koleksi Lebah ... 1

Ekstraksi dan Isolasi DNA ... 1

Amplikasi DNA Gen Sitokrom b A. mellifera ... 2

Elektroforesis dan Visualisasi DNA... 2

Pengukuran pita DNA ... 2

PCR-RFLP ... 2

Sequencing (pengurutan) DNA dan Alignment (penjajaran) DNA... 3

HASIL

Amplifikasi DNA ... 3

Pemotongan DNA A. mellifera Hasil Amplikasi dengan Enzim Restriksi BglII... 3

Pengurutan DNA A. mellifera ... 3

Alignment DNA... 3

PEMBAHASAN

... 7

KESIMPULAN ...

7

SARAN ...

8

DAFTAR PUSTAKA ...

8

DAFTAR TABEL

Halaman

1. Nukleotida primer yang digunakan untuk mengamplikasi gen sitokrom b A. Mellifera... 2

DAFTAR GAMBAR

Halaman 1. Hasil amplikasi gen sitokrom b A. mellifera menggunakan primer forward dan reverse sitokrom b ... 3

2. Hasil pemotongan gen sitokrom b A. mellifera meggunakan enzim restriksi BglII ... 3

3. Hasil pengurutan nukleotida DNA gen sitokrom b ... 4

4. Homologi urutan nukleotida gen sitokrom b A. mellifera ... 5

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman 1. Daftar nama dan alamat peternak A. mellifera di Jawa Timur, Jawa Tengah, Yogyakarta, dan Jawa Barat... 9

2. Kromatogram hasil pengurutan DNA contoh Am19 Pati menggunakan primer forward sitokrom b ... 11

PENDAHULUAN

Latar belakang

Apis mellifera termasuk kedalam Ordo

Hymenoptera, famili Apidae dan subfamili Apinae (Michener 2000). Lebah A. mellifera adalah lebah madu yang dibudidayakan karena produksi madunya yang tinggi. Lebah madu ada yang hingga saat ini belum semua dapat dibudidayakan. Lebah madu yang telah dapat dibudidayakan adalah dari kelompok lebah A. mellifera, dan A. cerana, sedangkan lebah madu yang belum dapat dibudiyakan yaitu A. koscevnikovi, A. dorsata, A. andreni- formis, A. florea dan A. laboriosa.

Lebah A. mellifera merupakan spesies le- bah madu yang persebarannya paling luas. A. mellifera ditemukan di sebagian besar daerah gurun pasir dan daerah dengan temperatur yang dingin (Ruttner 1988). Persebaran alami A. mellifera adalah di daerah Mediterania, Afrika, dan Eropa.

Berdasarkan analisis morfometrika, Rutt- ner (1988) membagi 24 subspesies ini menjadi empat kelompok garis keturunan (lineage). Garis keturunan A terdiri dari A. mellifera yang daerah persebarannya meliputi daerah Afrika, M meliputi Eropa utara dan barat, C meliputi Eropa Selatan dan O meliputi Timur Tengah. Pengelompokan yang sama juga di- hasilkan oleh Franck et al. (2000) berdasarkan DNA mitokondria.

Peternak lebah di dunia banyak mengim- por beberapa subspesies A. mellifera yaitu A. m. mellifera dan A. m. ligustica dari Eropa. Hal itu karena sifat jinak serta produksi ma- dunya yang tinggi (Gojmerac 1983).

Peternakan lebah menjadi terancam sejak lebah madu A. m. scutellata yang berasal dari Afrika diimpor ke Brazil pada tahun 1956. Lebah Afrika tersebut diimpor dengan tujuan untuk mendapat galur lebah yang adaptasinya baik di daerah tropis. A. m. scutellata menga- lami hibridisasi dengan lebah madu Eropa yaitu A. m. ligustica dan A. m. mellifera yang menghasilkan Africanized honey bee (AHB) (Kenneth 1999). AHB memiliki sifat ganas, sengat yang mematikan dan sangat cepat dalam perbanyakan koloni (Sheppard 1999). Keturunan lebah AHB ini tersebar dari Brazil ke Meksiko, Texas, Arizona, dan California (Schneider et al. 2003).

Secara morfologi peternak lebah tidak dapat membedakan antara lebah AHB dan

lebah madu Eropa (bukan AHB). Penelitian dasar untuk mendeteksi lebah AHB dilakukan dengan menggunakan penanda molekuler mitokondria DNA. Mitokondria DNA diturun- kan secara maternal melalui sitoplasma, tidak mengalami rekombinasi atau sedikit terjadi rekombinasi gen (Hoy 1994). Gen sitokrom b pada DNA mitokondria yang dipotong dengan enzim BglII dapat digunakan untuk mende- teksi AHB. Berdasarkan Crozier et al. (1991) enzim BglII mampu untuk memotong gen sitokrom b yang digunakan untuk mendeteksi AHB. Selain BglII dengan gen sitokrom b, enzim dan daerah gen lain dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan lebah AHB. Daerah gen tersebut adalah lrRNA/Eco RI dan cox 1/Hinc II (Pinto et al. 2003).

Hingga saat ini belum ada usaha untuk mendeteksi keberadaan AHB di peternakan lebah madu di Indonesia khususnya di Balai Karantina Hewan. Penelitian ini bertujuan untuk mendeteksi afrikanisasi lebah A. melli- fera di pulau Jawa berdasarkan gen sitokrom b pada DNA mitokondria.

Bahan dan Metode

Koleksi Lebah

Contoh lebah diperoleh dari hasil pengkoleksian lebah madu pada tahun 2005 yang dilakukan di Pati (Jawa Tengah) dan Jember (Jawa Timur) (Raffiudin 2006). Se- banyak 70 koloni lebah yang berasal dari Pati dan Jember disimpan dalam tabung berisi etanol absolut.

Ekstraksi dan Isolasi DNA

Ekstraksi DNA sudah dilakukan oleh peneliti sebelumnya (Hidayat 2006, Raffiudin 2006). Secara garis besar tahap persiapan dan pelaksanaan ekstraksi DNA adalah sebagai berikut.

Tabel 1 Nukleotida primer yang digunakan untuk mengamplifikasi gen sitokrom b A. mellifera berdasarkan posisi urutan DNA mitokondria A. mellifera Crozier & Crozier (1993)

Sebanyak 200 µl cetyl trimetyl amonium bromida (CTAB) konsentrasi 20% dimasuk- kan ke dalam tabung berisi toraks yang sudah digerus untuk melisis membran. Kemudian ditambahkan 14 µl proteinase K dengan kon- sentrasi 5 mg/µl dan diinkubasi pada suhu 55ºC selama dua jam. Larutan berisi campuran CTAB dan proteinase K disentrifugasi 13000 rpm (10 menit). Supernatan yang berisi DNA dipindahkan ke dalam tabung steril baru, kemudian ditambahkan 250 µl Chloroform Isoamil Alkohol (C:IAA=24:1). Supernatan dikocok (5 menit) dan disentrifugasi 13000 rpm (5 menit). Fenol kloroform isoamil alko- hol (P:C:I=25:24:1) kemudian disentrifugasi 13000 rpm (1menit). Larutan berisi DNA di- pindahkan ke tabung 1.5 ml steril dan ditam- bahkan 400 µl CIAA, lalu dikocok (5 menit).

Larutan berisi DNA disentrifugasi 13000 rpm (3 menit), kemudian supernatan dipindah- kan ke tabung baru. DNA yang terlarut dalam supernatan dipresipitasi dengan menggunakan 600 µl isopropanol selama semalam pada suhu

−4 ºC. Campuran DNA dan isopropanol di- sentrifugasi 13000 rpm selama 30 menit. Etanol 70% sebanyak 500 µl ditambahkan pada pelet DNA. Campuran tersebut disentri- fugasi 13000 rpm (10 menit) pada suhu 4 oC. Etanol dibuang dan pelet DNA dikeringkan dengan cara divakum (30 menit). DNA hasil ekstraksi dilarutkan dalam TE 0.5 mM dan disimpan pada suhu −4 oC.

Amplifikasi DNA Gen Sitokrom bA. melli- fera

DNA lebah diamplifikasi menggunakan mesin PCR TaKaRa Thermal Cycler. Pe-reaksi PCR terdiri atas ddH20, 2.5 µM dNTP, Mg 2+ free buffer, 25 µM MgCl2, 10 µM pri-

mer sitokrom b reverse, 10 µM primer sito- krom b forward (Tabel 1) (Crozier et al. 1991), Taq polimerase 5 unit/0.1 µl, dan DNA hasil ekstraksi. Proses PCR dilakukan dengan tahapan; denaturation (pemisahan DNA utas ganda) pada 94 ºC selama 1 menit, annealing (penempelan primer) pada 55 ºC selama 1 menit, dan elongation (pemanjangan) pada 72

º

C selama 2 menit. Semua tahap dilakukan selama 30 siklus.

Elektroforesis dan Visualisasi DNA

DNA hasil amplifikasi dipisahkan dengan polyacrilamide gel electrophoresis (PAGE) 6% menggunakan bufer 1 x Tris 0.5 M, Asam borat 0.65 M, EDTA 0.02M (TBE). Arus lis- trik yang digunakan sebesar 160 V selama 90 menit. Visualisasi DNA dalam gel poli akrilamid dilakukan dengan pewarnaan perak (Silver staining) yang dilakukan dalam sha- king bath (Tegelstrom 1986). Gel hasil elektroforesis dicuci dengan larutan CTAB (0.2 gr/200 ml akuades) selama 8 menit. Kemudian gel dicuci dengan aquades dua kali masing-masing 2 menit. Setelah itu gel dibilas lagi dalam larutan NH4OH (2 ml/200 ml

akuades) selama 6 menit.

Selanjutnya gel direndam dalam cam- puran larutan 0.32 AgNO3, 0.8 ml NH4OH,

dan akuades 200 ml selama 10 menit. Kemu- dian gel dicuci lagi menggunakan aquades dua kali masing-masing 2 menit. Setelah itu gel direndam dalam campuran larutan 4 gr Na2CO3, 100 µl formaldehida, dan 200 ml

akuades sampai muncul pita DNA. Terakhir, gel direndam dalam larutan asam asetat 1% dalam 200 ml akuades untuk pengawetan pita DNA.

Pengukuran pita DNA

Pengukuran pita DNA dilakukan untuk mengetahui ukuran DNA berdasarkan gel akrilamida. Pengukuran ini dilakukan pada pita penanda DNA dan pada DNA target. Penentuan ukuran pita DNA target berdasar- kan regresi menggunakan program R (the R Development Core Team Version 1.6.0) (Ve- nables & Ripley 1999).

PCR-RFLP

DNA A. mellifera hasil amplifikasi dipo- tong menggunakan enzim restriksi BglII. Enzim restriksi BglII merupakan enzim pemo- tong enam basa. Situs pemotongannya adalah

AGATCT (Griffiths et al. 1999) memotong basa ke 291 gen sitokrom b pada GenBank L06178. Komposisi pereaksi RFLP dalam total reaksi 4 µl terdiri atas DNA hasil amplifikasi 2 µl, 10 x bufer enzim BglII 0.4 µl, enzim BglII 10 unit/0.5 µl, air destilata Nama Primer Susunan nukleotida primer (5’-3’) Posisi nukelotida primer

pada mitokondria total Sitokrom b Forward TATGTACTACCTTGAGGACAAATATC 11400-11425

Sitokrom b Reverse ATTACACCTCCTAATTTATTAGGAAT 11859-11884

steril 1.1 µl. Campuran pereaksi RFLP kemu- dian disentrifugasi 4500 rpm selama 1 menit, lalu diinkubasi pada suhu 37 oC selama se- malam.

Hasil pemotongan dimigrasikan pada gel akrilamida 6% dengan arus 120 V selama 90 menit. Visualisasi DNA dalam gel poliakri- lamid dilakukan dengan pewarnaan perak (Te- gelstrom 1986).

Pengurutan DNA dan Alignment DNA

Pengurutan hasil amplifikasi DNA gen sitokrom b dilakukan menggunakan jasa Lem- baga Biologi Molekuler Charoen Pockphan Jakarta, menggunakan mesin ABI 310 Applied Biosystem. Pengurutan DNA dilakukan dari ujung 5' dan 3' menggunakan primer sitokrom b forward dan reverse.

Hasil pengurutan DNA dilakukan analisis homologi dengan cara alignment DNA. Alignment DNA dilakukan antara gen sito- krom b A. m 19 Pati dengan gen A. mellifera (Crozier dan Crozier 1993); Acc Number L0 -6178 pada GenBank menggunakan program Clustal X (Thompson 1997). Analisis homo- logi juga dilakukan antara gen sitokrom b Am 19 Pati, A. mellifera (Crozier dan Crozier 1993) dan AHB haplotipe satu: Genbank Acc Number EF016646 dan AHB haplotipe dua: Acc Number EF016647.

HASIL

Amplifikasi DNA

[image:21.595.319.518.275.398.2]

Hasil amplifikasi dan RFLP gen sitokrom b dilakukan pada seluruh contoh A. mellifera. Seluruh contoh menghasilkan ukuran PCR produk yang sama (500 pb) (Gambar 1). Data gambar PCR produk dan RFLP diperoleh dari contoh A. mellifera asal Jawa Timur (koloni 61-70, sesuai Lampiran 1). Data gambar tersebut mewakili data dari seluruh contoh A. mellifera pada penelitian ini.

Gambar 1 Hasil amplifikasi gen sitokrom b A. mellifera yang diimpor ke Indone- sia M = marker (DNA 100 bp), 1-10 = nomor contoh A. mellifera Jawa Timur dengan no. koloni 61-70 (lampiran 1).

Pemotongan DNA A. mellifera Hasil Ampli- fikasi dengan Enzim Restriksi BglII

Seluruh produk sitokrom b A. mellifera dipotong dengan enzim restriksi BglII. Hasil gel menunjukkan satu mitotipe yang memiliki dua pita DNA berukuran kurang lebih 200 dan 300 pb. Dengan demikian terdapat satu situs pemotongan yang monomorfik (sera- gam) (Gambar 2).

Daerah restriksi gen sitokrom b hasil pemotongan enzim BglII berdasarkan sekuen DNA menghasilkan dua fragmen dengan ukuran 194 pb & 291 pb (Gambar 3). Posisi BglII dari hasil pengurutan nukleotida DNA gen sitokrom b A. mellifera terdapat pada basa ke 291 pb (Gambar 4).

Pengurutan DNA A. mellifera

Contoh A. mellifera yang dipilih untuk dilakukan pengurutan DNA adalah A. melli- fera koleksi Pati dengan nomor koloni 19. Pemilihan nomor koloni Am 19 untuk pengurutan DNA berdasarkan pada produk DNA hasil amplifikasi yang baik. Proses pengurutan DNA menggunakan primer for- ward dan reverse sitokrom b. Hasil penguru- tan DNA berupa kromatogram (Lampiran 2 & 3) telah diedit secara manual. Hasil edit kemu- dian dimasukkan ke dalam program Genetyx (Genetyx Win Versi 4.0) untuk analisis lebih lanjut. Hasil pengurutan DNA pada nomor contoh A. mellifera 19 Pati menggunakan pri- mer sitokrom b forward dan reverse di- dapatkan 485 pb (Gambar 5).

Alignment DNA

Analisis alignment DNA dilakukan untuk mengetahui homologi nukleotida. Nomor contoh A. mellifera 19 Pati dilakukan align- ment DNA dengan lebah A. mellifera yang 10

Gambar 2 Hasil pemotongan gen sitokrom b A. mellifera dengan menggunakan enzim restriksi BglII M=marker (DNA 100 bp), 1-10=nomor con-toh A. mellifera dengan no koloni (61-70) (lampiran 1)

300

6 8

M 2 3 5 7 9

200

1 4

8

M 9

400

2

300

1 3 4 6

pb 5 7 10

500

[image:21.595.101.298.477.722.2]

telah diteliti sebelumnya oleh Crozier dan Crozier (1993) diperoleh dari Gen Bank ACC Number L06178.

Proses alignment DNA menggunakan program Clustal X (Thompson 1997). Hasil alignment DNA menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan urutan nukleotida antara nomor contoh A. mellifera 19 Pati dengan A. melli-

fera hasil dari Crozier dan Crozier (1993) Acc Number L06178. Hasil alignment DNA sitokrom b Am 19 Pati dengan AHB dari GenBank Acc Number EF016647 dan EF016647 menunjukkan bahwa terdapat perbedaan urutan nukleotida, yaitu terdapat sembilan substitusi nukleotida (Gambar 5).

10 20 30 40 50 60

tatgtactaccatgaggacaaatatcatattgaggtgcaacagttattactaatctttta

70 80 90 100 110 120

tcagcaattccttatattggtgatacaattgtattatgaatttgaggtggattttcaatt

130 140 150 160 170 180

aataatgctacattaaatcgatttttttctttacattttattttaccattattaatttta

190 200 210 220 230 240

tttatagttattcttcatttatttgccttacatttaactggatcatctaatcctcttgga

250 260 270 280 290 300

tcaaattttaataattataaaatttcatttcatccatatttttcaattaaagatctttta

310 320 330 340 350 360

ggattttatatcatcttatttatctttatattcattaattttcaatttccatatcattta

370 380 390 400 410 420

ggagatccagacaatttcaaaattgcaaatccaataaatactccaactcatattaaacct

430 440 450 460 470 480

gaatgatatttcctatttgcatattcaattttacgagcaattcctaataaattaggaggt

[image:22.595.112.479.206.487.2]

490 gtaat

Gambar 3 Hasil pengurutan nukleotida DNA gen sitokrom b A. mellifera. Nukleotida yang digaris bawah adalah nukleotida tempat situs pemotongan enzim BglII

Gambar 4 Peta restriksi hasil pemotongan gen sitokrom b A. mellifera dengan enzim restriksi BglII. Hasil pemotongan dengan enzim restriksi BglII menghasilkan dua fragmen DNA berukuran 194 pb dan 291 pb

BglII

1

100 pb

BglII 485

[image:22.595.143.474.580.649.2]

CYTBL06178 ATGAAAAAATTTATAAACTTTTTTAGTTCCAATGAATTTCTAAAAATAATTATATCTACA 60 AM19PT --- EF016646_1 --- EF016647_2 --- CYTBL06178 ATTTATTTACCAACTCCAGTAAATATTAATTATATATGAAATTTTGGATCAATTCTTGGA 120 AM19PT --- EF016646_1 --- EF016647_2 --- CYTBL06178 ATTTTTTTAATAATTCAAATCATTTCTGGATTTATTTTATCAATACATTATTGTCCAAAT 180 AM19PT --- EF016646_1 --- EF016647_2 --- CYTBL06178 ATTGATATTGCTTTCTGATCAATTACTAATATTATAAAAGATATAAATTCAGGATGATTA 240 AM19PT --- EF016646_1 --- EF016647_2 --- CYTBL06178 TTTCGTTTAATTCACATAAATGGAGCATCATTTTATTTTTTAATAATATATATTCATATT 300 AM19PT --- EF016646_1 --- EF016647_2 --- CYTBL06178 AGTCGAAATTTATTTTATTGTTCATATAAATTAAATAATGTATGAGGAATTGGAATTATA 360 AM19PT --- EF016646_1 --- EF016647_2 --- CYTBL06178 ATTCTTTTAATATCAATAGCAGCTGCATTTATAGGATATGTACTACCATGAGGACAAATA 420 AM19PT ---TATGTACTACCATGAGGACAAATA 24 EF016646_1 ---TATGTACTACCATGAGGACAAATA 24 EF016647_2 ---TATGTACTACCATGAGGACAAATA 24 ************************

CYTBL06178 TCATATTGAGGTGCAACAGTTATTACTAATCTTTTATCAGCAATTCCTTATATTGGTGAT 480 AM19PT TCATATTGAGGTGCAACAGTTATTACTAATCTTTTATCAGCAATTCCTTATATTGGTGAT 84 EF016646_1 TCATATTGAGGTGCAACAGTCATTACTAATCTTTTATCAGCAATTCCTTATATTGGTGAT 84 EF016647_2 TCATATTGAGGTGCAACAGTTATTACTAATCTTTTATCAGCAATTCCTTATATTGGTGAT 84 ******************** ***************************************

CYTBL06178 ACAATTGTATTATGAATTTGAGGTGGATTTTCAATTAATAATGCTACATTAAATCGATTT 540 AM19PT ACAATTGTATTATGAATTTGAGGTGGATTTTCAATTAATAATGCTACATTAAATCGATTT 144 EF016646_1 ACAATTGTATTATGAATCTGAGGTGGGTTCTCAATTAATAATGCTACCTTAAATCGATTT 144 EF016647_2 ACAATTGTATTATGAATCTGAGGTGGGTTCTCAATTAATAATGCTACCTTAAATCGATTT 144 ***************** ******** ** ***************** ************

CYTBL06178 TTTTCTTTACATTTTATTTTACCATTATTAATTTTATTTATAGTTATTCTTCATTTATTT 600 AM19PT TTTTCTTTACATTTTATTTTACCATTATTAATTTTATTTATAGTTATTCTTCATTTATTT 204 EF016646_1 TTTTCTTTACATTTTATTTTACCATTATTAATTTTATTTATAGTTATTCTTCATTTATTT 204 EF016647_2 TTTTCTTTACATTTTATTTTACCATTATTAATTTTATTTATAGTTATTCTTCATTTATTT 204 ************************************************************

CYTBL06178 GCCTTACATTTAACTGGATCATCTAATCCTCTTGGATCAAATTTTAATAATTATAAAATT 660 AM19PT GCCTTACATTTAACTGGATCATCTAATCCTCTTGGATCAAATTTTAATAATTATAAAATT 264 EF016646_1 GCCTTACATTTAACTGGATCATCTAATCCTCTTGGATCAAATTTTAATAATTATAAAATT 264 EF016647_2 GCCTTACATTTAACTGGATCATCTAATCCTCTTGGATCAAATTTTAATAATTATAAAATT 264 ************************************************************

CYTBL06178 TCATTTCATCCATATTTTTCAATTAAAGATCTTTTAGGATTTTATATCATCTTATTTATC 720 AM19PT TCATTTCATCCATATTTTTCAATTAAAGATCTTTTAGGATTTTATATCATCTTATTTATC 324 EF016646_1 TCATTTCATCCATATTTTTCAATTAAAGACCTTTTAGGATTTTATATTATCTTATTTATC 324 EF016647_2 TCATTTCATCCATATTTTTCAATTAAAGACCTTTTAGGATTTTATATTATCTTATTTATC 324 ***************************** ***************** ************

1 2 3 4

5 ₆

CYTBL06178 TTTATATTCATTAATTTTCAATTTCCATATCATTTAGGAGATCCAGACAATTTCAAAATT 780 AM19PT TTTATATTCATTAATTTTCAATTTCCATATCATTTAGGAGATCCAGACAATTTCAAAATT 384 EF016646_1 TTTATATTCATTAATTTTCAATTTCCATATCATTTAGGAGATCCAGATAATTTTAAAATT 384 EF016647_2 TTTATATTCATTAATTTTCAATTTCCATATCATTTAGGAGATCCAGATAATTTTAAAATT 384 *********************************************** ***** ******

CYTBL06178 GCAAATCCAATAAATACTCCAACTCATATTAAACCTGAATGATATTTCCTATTTGCATAT 840 AM19PT GCAAATCCAATAAATACTCCAACTCATATTAAACCTGAATGATATTTCCTATTTGCATAT 444 EF016646_1 GCAAATCCAATAAATACTCCAACTCATATTAAACCTGAATGATATTTTCTATTTGCATAT 444 EF016647_2 GCAAATCCAATAAATACTCCAACTCATATTAAACCTGAATGATATTTTCTATTTGCATAT 444 *********************************************** ************

CYTBL06178 TCAATTTTACGAGCAATTCCTAATAAATTAGGAGGTGTAATCGGATTAGTAATATCAATT 900 AM19PT TCAATTTTACGAGCAATTCCTAATAAATTAGGAGGTGTAAT--- 485 EF016646_1 TCAATTTTACGAGCAATTCCTAATAAATTAGGAGGTGTAAT--- 485 EF016647_2 TCAATTTTACGAGCAATTCCTAATAAATTAGGAGGTGTAAT--- 485 *****************************************

CYTBL06178 CTTATTCTTTATATTATAATTTTTTATAATAATAAAATAATAAACAATAAATTTAATATA 960 AM19PT --- EF016646_1 --- EF016647_2 --- CYTBL06178 TTAAATAAAATTTATTATTGAATATTTATTAATAACTTCATTTTATTAACATGATTAGGT 1020 AM19PT --- EF016646_1 --- EF016647_2 --- CYTBL06178 AAACAATTAATTGAATATCCATTTACTAATATTAATATATTATTTACAACAACATATTTT 1080 AM19PT --- EF016646_1 --- EF016647_2 --- CYTBL06178 TTATATTTTTTCTTAAATTTCTATTTAAGAAAATTATGAGATAATTTAATTTGAAATTCA 1140 AM19PT --- EF016646_1 --- EF016647_2 --- CYTBL06178 CCATTAAATTAA 1152

AM19PT --- EF016646_1 --- EF016647_2 ---

Gambar 5 Homologi urutan nukleotida gen sitokrom b A. mellifera . Cyt B = sitokrom b; Cyt B L06178 berasal dari GenBank Acc Number L06178, Am 19 pt adalah hasil urutan gen sitokrom b A. mellifera asal Pati. EF016646_1 adalah AHB haplotipe satu, EF016647_2 adalah AHB haplotipe dua berasal dari GenBank. * = kesamaan (homologi) nukleotida. Angka disamping kanan adalah nomor nukleotida. Nukleotida digarisbawah adalah situs restriksi BglII. Nukleotida di dalam kotak adalah perbedaan AHB satu dan AHB dua.

Perbedaan AHB dan bukan AHB. Angka diatas urutan nukleotida menunjukkan substitusi yang terjadi antara Am 19 Pt dengan AHB haplotipe satu dan AHB haplotipe dua.

7 8

9

6

PEMBAHASAN

Penelitian dasar untuk mendeteksi AHB dilakukan dengan menggunakan penanda mo- lekuler. Salah satu penanda molekuler yang banyak digunakan adalah DNA mitokondria karena sifatnya yang diturunkan secara mater- nal.

Ada beberapa penanda molekuler yang dapat digunakan untuk membedakan AHB dan bukan AHB. Crozier et al. (1991) di Australia telah menggunakan gen sitokrom b yang dipotong dengan enzim restriksi BglII. Hasil penelitiannya menghasilkan satu frag- men DNA berukuran 485 pb untuk AHB. Dua fragmen DNA berukuran 194 pb dan 291 pb dihasilkan untuk yang bukan AHB. Pene- litian yang sama juga telah dilakukan di Amerika Serikat oleh Pinto et al. (2003). Gen sitokrom b/BglII dapat membedakan antara A. mellifera dari garis keturunan Afrika dan garis keturunan A. mellifera yang lain. Satu frag- men DNA berukuran 485 pb dihasilkan A. mellifera yang termasuk garis keturunan Afri- ka. Dua fragmen DNA berukuran 194 pb dan 291 pb untuk keturunan A. mellifera selain Afrika.

Crozier & Koulinous (1996) telah mela- kukan penelitian yang sama di Australia. Dengan menggunakan gen sitokrom b/BglII dapat membedakan antara kelompok garis ke- turunan asal Afrika dan Eropa. Hal tersebut diketahui berdasarkan keberadaan situs pemo- tongan BglII. Hasil penelitiannya menunjuk- kan bahwa tidak ada situs pemotongan BglII pada A. mellifera dari garis keturunan Afrika.

Menurut penelitian yang dilakukan oleh Hidayat (2006), mengenai asal lebah madu impor A. mellifera di Indonesia berdasarkan daerah intergenik cox 1-2/Dra1 DNA mito- kondria, menyatakan bahwa A. mellifera yang ada di Indonesia merupakan keturunan A. m. ligustica yang diimpor dari Australia.

Pada penelitian ini ukuran DNA seluruh contoh A. mellifera hasil amplifikasi gen sito- krom b berdasarkan sekuen DNA ialah 485 pb. Daerah gen sitokrom b hasil pemotongan enzim BglII berdasarkan sekuen DNA meng- hasilkan dua fragmen DNA. Fragmen tersebut berukuran 194 pb dan 291 pb. Hal ini sesuai dengan hasil penelitian Crozier et al. (1991) pada gen sitokrom b/BglII.

Apis mellifera membutuhkan sumber pa- kan yang lebih banyak dibanding lebah lain. Untuk mensiasati pemenuhan sumber pakan berupa bunga, maka lebah ini perlu dipindah- kan (diangon). Sekitar bulan Mei, Juni, Juli pohon randu di daerah Jawa Tengah dan

Timur sedang mengalami musim bunga. Pada saat itu lebah dari peternak di Jawa Barat membawa lebahnya untuk diangon di Jawa Timur. Selain contoh lebah dari Jawa Tengah dan Jawa Timur, contoh lebah dari Jawa Barat juga ikut diambil untuk dianalisa pada penelitian ini.

Dari seluruh contoh A. mellifera yang dideteksi yaitu contoh yang berasal dari Jawa Tengah, Jawa Barat, dan Jawa Timur tidak membawa gen AHB. Hal tersebut karena dari hasil amplifikasi fragmen DNA dapat dipo- tong oleh enzim BglII. Analisis homologi dilakukan antara nukleotida A. mellifera dari Crozier dan Crozier dengan Acc.Number: L0- 6178, A. mellifera asal Pati dan A. m. scutell- ata (AHB) haplotipe satu dan haplotipe dua.

Berdasarkan hasil Alignment diketahui bahwa contoh A. mellifera pada penelitian ini mempunyai urutan nukleotida yang sama dengan A. mellifera dari Crozier dan Crozier (1993) pada GenBank Acc Number: L06178 yang dimulai dari nukleotida ke 396. Situs BglII terdapat pada posisi nukleotida ke 694.

Pencarian data dari GenBank diperoleh dua haplotipe AHB yaitu EF016646 (AHB haplotipe satu) dan EF 016647 (AHB haplo- tipe dua). Berdasarkan analisis homologi, kedua haplotipe tersebut berbeda pada posisi nukleotida ke 65 (Gambar 4).

Perbedaan antara AHB dan bukan AHB adalah terdapat substitusi pada nukleotida ke 295 (Gambar 5. Mutasi no 5). Nukleotida timin (T) yang dikenali oleh enzim BglII pada Am 19 pt mengalami mutasi menjadi nukleo- tida sitosin (C)n pada lebah AHB. Hal ini menyebabkan pada AHB tidak terdapat situs restriksi BglII sehingga hanya satu pita pada hasil RFLP. Berdasarkan hasil alignment DNA, terdapat sembilan substitusi yang mem- bedakan antara Am 19 pt dari hasil penelitian ini dengan AHB haplotipe satu dan haplotipe dua.

KESIMPULAN

Amplifikasi daerah gen sitokrom b DNA mitokondria Apis mellifera berdasarkan urutan DNA menghasilkan produk sebesar 485 pb. Pemotongan DNA hasil amplifikasi dengan enzim restriksi BglII menghasilkan dua frag- men DNA masing-masing berukuran 194 pb dan 291 pb. Data sitokrom b/BglII hasil restriksi menunjukkan bahwa belum ada lebah AHB di pulau Jawa. Dengan demikian, kebe- radaan lebah Africanized dapat dideteksi dari DNA mitokondria melalui gen sitokrom b

berdasarkan keberadaan situs pemotongan BglII.

SARAN

Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui tingkat akurasi daerah gen lain pada DNA mitokondria dengan enzim restriksi yang berbeda.

DAFTAR PUSTAKA

Clarke et al. 2002. The Africanization of honeybees (Apis mellifera ligustica) of the Yucatan: study massive hybridization event across time. Evolution 56:1462-1474

Crozier RH, Koulinos S, Crozier YC. 1991. An improved test for africanized honey- bee mitochondrial DNA. Experientia 47:968-969

Crozier RH & Koulianos S. 1996. Mitochon- drial DNA sequence data provides further evidence that the honeybees of Kangaroo Islands, Australia, are of hybrid origin. Apidologie 27:165-174

Crozier YC & Crozier RH 1993. The mito- chondrial genome of the honeybee Apis mellifera: complete sequence and genome organization. Genetics 133:97-117 Franck P et al. 2000. Molecular confirmation

of a fourth lineage in honeybees in the Near East. Apidologie 31(2):167-180. Gojmerac W.L. 1983. Bees, Beekeeping, Ho-

ney and Pollination. Connecticut: AVI Pub.

Griffiths AJ et al. 1999. Modern Genetic Analysis. Freeman & Company, Madison Avenue, New York.

Hidayat RM. 2006. Asal Lebah Madu Impor Apis mellifera Di Indonesia Berdasarkan Daerah Intergenik cox 1/cox 2 DNA Mitokondria [Skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Institut Pertanian Bogor

Hoy MA. 1994. Insect Molecular Genetics: An Introduction to Principles and Appli- cations. Academic Press. Inc.

Kenneth TK & Oguro J. 1999. Update on the status of Africanized honeybees in the Western States. British Medical Associa- tion. West J Med 170:220-222

Michener DC. 2000. The Bees of the World. Baltimore and London. The Johns Hop-kins University Pr.

Pinto AM et al. 2003. Identification of Africa- nized honey bee (Hymenoptera: Apidae) mitochondrial DNA: Validation of a rapid

polymerase chain reaction based assay. Ann Entomol 96(5):679-684

Raffiudin R. 2006. Mitochondrial DNA Evi- dence of the Imported Honey Bee Apis mellifera in Indonesia. Report in Indo- nesian Toray Science Foundation (ITSF) Seminar on Science and Technology, Jakarta, 1 February 2006.

Ruttner F. 1988. Biogeography and Taxonomy of Honey Bees. Berlin: Springer Hiedel- berg New York.

Sambrooks J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning a Laboratory Manual. Ed ke-2. New York: Cold Spring Harbor Pr.

Schneider, Hoffman DG, Smith DR. 2003. The African honeybee: factors contribu- ting to a successful biological invasion. Ann Entomol 49:351-368

Sheppard et al. 1993. Analysis of Africanized honeybee mitochondrial DNA reveals further diversity origin. Genet Mol Biol 22:1415-1757

Suwanda O. 1986. Pengelolaan lebah madu oleh pramuka. Di dalam: Budi Daya dan Biologi Lebah Madu. Prosiding Lokakar- ya Pembudidayaan Lebah Madu untuk Peningkatan Kesejahteraan Masyarakat: Sukabumi, 20-22 Mei 1986. Jakarta: Perum Perhutani.hlm 273-292

Tegelstrom H. 1986. Mitochondrial DNA in natural population : an improved routine for screening of genetic variation based on sensitif silver staining. Electrophoresis 7:226-229.

Thompson JD et al. 1997. The Clustal X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools Nucleic Acid Res 25:4876-4882

Venables EO & Ripley BD. 1999. Modern Applied Statistics with S-plus. New York: Springer

Lampiran 1 Daftar nama dan alamat peternak A. mellifera di Jawa Timur, Jawa Tengah, Yogya, dan Jawa Barat (Raffiudin 2006).

No Peternak Nama sampel Alamat

1 Pusbahnas Am 1 Parung panjang, Bogor

2 Pusbahnas Am 2 Parung panjang, Bogor

3 Ari puspa(Joko) Am 3 Ds.Glagah kulon RT 1/RW 1, Kudus

4 Muria agung (Nurcholis) Am 4 Sragen

5 Ramli Am 5 Jawa tengah

6 Rifa'I Am 6 Jawa tengah

7 Harno Am 7 Purwasari, Tlogowungu, Pati

8 Mashudi Am 8 Ds.Tlogorejo, Tlogowungu

9 Mashudi Am 9 Ds.Tlogorejo, Tlogowungu

10 Mashudi Am 10 Ds.Tlogorejo, Tlogowungu

11 Santoso Am 11 Jawa tengah

12 UP3 Regaloh (Marsudi) Am 12 Jawa tengah

13 UP3 Regaloh (Marsudi) Am 13 Jawa tengah

14 Harno Am 14 Purwosari, Tlogowungu, Pati

15 Rahayu (Supri dan kani) Am 15 Yogyakarta

16 Bambang suseno Am 16 Jawa tengah

17 KUD Batu (Bashori) Am 17 Jl.Diponegoro no 8 kota Batu

18 Harwi Am 18 Jawa tengah

19 Serangga mas (Herman) Am 19 Yogyakarta, Mojosongo, solo

20 Serangga mas (Herman) Am 20 Yogyakarta

21 Serangga mas (Herman) Am 21 Yogyakarta

22 Serangga mas (Herman) Am 22 Yogyakarta

23 Serangga mas (Herman) Am 23 Yogyakarta

24 Sudar Am 24 Jawa tengah

25 Apiari madu (Geri) Am 25 Malang

26 Herman Am 26 Jawa tengah

27 Karya sari (Sutrisno) Am 27 Jawa tengah

28 Karya sari jaya (Sutirisno) Am 28 Jawa tengah

29 Djaenuri Am 29 Jawa tengah

30 Darsono jenggin Am 30 Jawa tengah

31 Kelp.tani lebah madu sariwono (wien) Am 31 Jawa tengah

32 Cipta apiari (Budi) Am 32 Jawa tengah

33 Sartono Am 33 Jawa tengah

34 Sartono Am 34 Jawa tengah

35 Pramuka (Wawan) Am 35 Temanggung, Jawa tengah

36 Perhutani gunung arca (Solichin) Am 36 Sukabumi, Jawa barat

37 Heru Am 37 Ketanggan, Gembong, Pati

38 Kelompok tani Yogya (Sutrisno) Am 38 Pringsurat, Temanggung

39 Madu sekarsari (Untung) Am 39 Yogyakarta

40 Mulyadi Am 40 Jawa tengah

41 Sari alam (Susanto) Am 41 Ds.Bedono, dusun wawarkidul RT 2/3 Ambarawa

42 Yapet Am 42 Jawa tengah

43 Suharjo Am 43 Jawa tengah

No Peternak Nama sampel Alamat

44 Suharjo Am 44 Jawa tengah

45 Cepi Am 45 Jawa tengah

46 Cepi Am 46 Jawa tengah

47 Khoirudin Am 47 Jawa tengah

48 Mustika apiaris (Nanang haryono) Am 48 Banyuwangi, Jawa timur 49 Mustika apiaris (Nanang haryono) Am 49 Banyuwangi, Jawa timur

50 Prima (Supri) Am 50 Jawa tengah

51 Santoso (Hawai) Am 51 Perhutani regaloh (Hawai)

52 Nuhana (Holland) Am 52 Dusun Purworejo, Ds bringin pare, Kediri

53 Santoso (Australia) Am 53 Gringsing,Batang

54 Santoso (Cina) Am 54 Perhutani regaloh (Hawai)

55 Nuhana madu (Nuhana) Am 55 Dusun Purworejo, Ds bringin pare, Kediri 56 Sumber madu (Junaidi) Am 56 Ds.Lumbang,kec.Lumbang, Probolinggo

57 KSR (Kasrin) Am 57 Singosari, Malang

58 KS (Liem) Am 58 Surabaya

59 Mekarsari (Samsul) Am 59 Jember

60 Warna muria (H.mustamar) Am 60 Gembong,Pati, Jawa timur

61 AL (Hasan) Am 61 Tempurejo, Jember

62 Sumber madu (Marsito) Am 62 Ds.Kepung pare, Kediri

63 Nektarindo abadi (Trisukow8ibowo) Am 63 Purwosari, Pasuruan

64 AL ihsan (H.tato) Am 64 Wajak, Malang

65 Bintang apiari Am 65 Batu, Malang

66 KUD Batu (Adrian sembodo) Am 66 Jl.Diponegoro no 8 kota Batu 67 Lebah alam (Mulyo haryono) Am 67 Punten batu, Malang

68 Omega madu (Narko/purnomo) Am 68 Dorok manggis RT 05/03,puncu, Kediri

69 Tasmuji Am 69 Pare, Kediri

70 Lestari (ketang) Am 70 Taraken, Kediri

Lampiran 2 Kromatogram hasil pengurutan DNA A. mellifera sampel Am 19 Pati menggunakan primer forward sitokrom b

Lampiran 3 Kromatogram hasil pengurutan DNA A. mellifera sampel Am 19 Pati menggunakan primer reverse sitokrom b