AKTIVITAS ANTIPROLIFERATIF EKSTRAK TERSTANDAR LENGKUAS
(Alpinia galanga)
BERDASARKAN SENYAWA 1’
-ASETOKSI KAVIKOL
ASETAT PADA SEL KANKER PAYUDARA MCF7
Disusun sebagai salah satu syarat menyelesaikan Program Studi Strata I pada Fakultas Farmasi
Oleh:
HANA DWI PUSPITA SARI
K 100 130 064
PROGRAM STUDI FARMASI FAKULTAS FARMASI
1
AKTIVITAS ANTIPROLIFERATIF EKSTRAK TERSTANDAR LENGKUAS (Alpinia galanga) BERDASARKAN SENYAWA 1’-ASETOKSI KAVIKOL ASETAT PADA SEL
KANKER PAYUDARA MCF7
Abstrak
Lengkuas (Alpinia galanga) diketahui mengandung senyawa metabolit sekunder fenilpropanoid. 1’-Asetoksi kavikol asetat (ACA) merupakan senyawa yang dilaporkan memiliki aktivitas sitotoksik dan antiproliferatif. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas sitotoksik dan antiproliferatif dari ekstrak etanol lengkuas yang mengandung senyawa ACA terhadap sel MCF7. Penelitian sebelumnya dilakukan kuantifikasi kadar 1’-Asetoksi kavikol asetat dari pasar Legi, pasar Beringharjo, dan pasar Wonogiri. Identifikasi ACA dengan KLT menggunakan fase gerak heksan : etil asetat (3:1). Aktivitas sitotoksik dilakukan dengan metode MTT dan aktivitas antiproliferatif dengan metode flow cytometer menggunakan reagen Propidium Iodida. Hasil dari identifikasi KLT menunjukkan adanya intensitas elusi senyawa 1’ -Asetoksikavikol asetat yang sebanding dengan kadar senyawa ACA. Aktivitas sitotoksik ekstrak etanol lengkuas menunjukkan bahwa semakin banyak kandungan senyawa ACA, semakin besar potensi aktivitas sitotoksik dengan nilai IC50 yang rendah. Ekstrak etanol lengkuas yang mengandung kadar ACA terbanyak (3,798%b/b) berpotensi sitotoksik terhadap sel MCF7 dengan nilai IC50 15,8 µg/mL. Aktivitas antiproliferatif menunjukkan adanya penghambatan dalam siklus sel dengan akumulasi sel pada fase G0-G1.
Kata Kunci: 1’-Asetoksi kavikol asetat , Lengkuas, IC50 , MCF7, Proliferatif.
Abstract
Galangal (Alpinia galanga) contains phenylpropanoid as secondary metabolites. 1'-Acetoxy chavicol acetate (ACA) is one of active compound is reported for cytotoxic and antiproliferative activity. This study aimed to determine the cytotoxic and antiproliferative activity 1’-Acetoxychavicol acetate of the ethanol extract of galangal in breast cancer MCF7 cells. Previous studies have done quantification of 1’ -Acetoxychavicol acetat from pasar Legi, pasar Beringharjo, and pasar Wonogiri. Identification of ACA by TLC with the mobile phase of hexane : ethyl acetate (3: 1). Cytotoxic activity was carried out by MTT method and antiproliferativeactivity by flow cytometer method with the reagent Propidium Iodide. The results of TLC showed the presence intensity of 1'-Acetoxy chavicol acetate is proportional with the level of ACA. Cytotoxic activity of galangal extract showed that the higher level of ACA, the higher activity of cytotoxic presented in a lower IC50 value. The ethanol extract of galangal that
contained highest levels of ACA (3.798%w/w) has potential cytotoxic against MCF7 with IC50 value 15,8 μg/mL. Antiproliferation activity showed inhibition of cell cycle by
cell accumulation at G0-G1 phase.
2
1.PENDAHULUAN
Kanker merupakan salah satu penyakit tidak menular. Prevalensi kejadian kanker cukup tinggi dan menjadi penyebab kematian ke-2 (13%) setelah penyakit kardiovaskuler. Kanker tertinggi di Indonesia pada perempuan adalah kanker payudara dan kanker leher rahim (serviks), sedangkan pada laki-laki adalah kanker paru dan kanker kolorektal (KemenkesRI, 2016). Di Indonesia pada tahun 2013, prevalensi penyakit kanker payudara berada di urutan ke dua setelah kanker serviks dengan jumlah penderita sekitar 61.682 orang (KemenKesRI, 2015). Pengobatan penyakit kanker bekerja dengan mekanisme penghambatan pembelahan sel dan induksi apoptosis. Efek samping yang tidak nyaman dan adanya resistensi dari obat kemoterapi, mendorong penggunan alternatif tanaman obat tradisional sebagai penyembuhan kanker (Ma’at, 2004) .
Tanaman obat tradisional yang digunakan sebagai obat dapat dalam bentuk simplisia dan harus berkualitas sesuai dengan standar mutu simplisia. Persyaratan kualitas simplisia terdapat dalam monografi simplisia salah satunya yaitu kandungan kimia senyawa aktif (DepKes RI, 2008). Lengkuas (Alpinia galanga) merupakan tanaman famili Zingiberacea. Lengkuas mengandung senyawa fenilpropanoid diantaranya 1’-Asetoksikavikol asetat, 1’-Asetoksieugenol asetat, trans-p-kumaril diasetat, 1’-Hidroksikavikol asetat, trans-p-kumaril alkohol (Matsuda, 2005). Senyawa 1’ -Asetoksikavikol asetat telah dilaporkan memiliki aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker payudara (MCF7) (Chauhan et al, 2014). Nilai IC50 yang diperoleh senyawa 1’-Asetoksikavikol asetat pada sel MCF7 sebesar 23,9 µM (Lee & Houghton 2005). Selain uji sitotoksik, senyawa 1’-Asetoksikavikol asetat ini memiliki aksi dalam penghambatan aktivasi NF-kB yang akan memicu aktifnya Cyclin D (Ito et al. 2005). Ekstrak lengkuas yang mengandung senyawa 1’-Asetoksikavikol asetat di analisis menggunakan metode MTT dan flow cytometer dapat menghambat proliferasi sel pada fase G0-G1 dengan IC50 20 µM (Hasima et al. 2010). Hasil penelitian tersebut memiliki nilai IC50 yang berpotensi sebagai antikanker. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui aktivitas antiproliferatif dari ekstrak terstandar lengkuas yang mengandung senyawa 1’-Asetoksikavikol asetat pada sel kanker payudara MCF7.
2.METODE
3
2.1. Bahan
Rimpang lengkuas yang diperoleh dari Pasar Legi Surakarta, Pasar Wonogiri, Pasar Beringharjo Yogyakarta. Sel uji MCF7 dari Laboratorium Sitotoksik Fakultas Farmasi UMS. Pelarut etanol 96%, heksan p.a, etil asetat p.a, kloroform p.a, aquades, larutan standar 1’-asetoksikavikol asetat, media kultur DMEM, FBS, penisilin-streptomisin, larutan PBS, Tripsin-EDTA, DMSO, larutan MTT
assay, SDS 10% dalam HCl 0,1N, aluminium foil, Reagen flowcytometriy.
2.2. Alat
Blender, peralatan gelas (pyrex), bejana untuk maserasi, corong buchner, kompresor, vacum evaporator (Heidolph), waterbath (Changzhou Nuohai XMTD-204), timbangan analitik (Sartorius), mikropipet (Soccorex), botol Duran, stiker label, pasteur pipet, LAF (Nuaire), hemacytometer (Marienfield Germany), counter, tabung reaksi kecil, vortex (Thermo), 96-well-plate (Iwaki),
conical tube, Lap, buangan untuk media bekas/PBS, eppendorf, yellow tip and blue tip, ELISA
reader (BioTek), 6-well plate (Iwaki), inkubator, sentrifugator ependorf (Hettich), mikroskop (Olympus Jepang), Flow cytometer Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS-Calibur).
2.3. Jalannya penelitian
Rimpang lengkuas diperoleh dari Pasar Legi, Beringharjo, dan Wonogiri. Proses maserasi dilakukan dengan pelarut etanol 96% dan remaserasi sebanyak 2 kali. Penyaringan dilakukan pada maserat dengan corong bughner. Pemekatan maserat menggunakan evaporator dan dilanjutkan pemekatan dengan waterbath. Ekstrak kental dipartisi menggunakan pelarut etil asetat untuk mendapatkan senyawa 1’-Asetoksikavikol asetat. Analisis kuantitatif diperoleh dari hasil penelitian yang dilakukan Sulasmi (2016). Identifikasi senyawa dilakukan dengan metode KLT dan larutan standar pembanding isolat senyawa ACA. Partisi kental etil asetat dielusi pada plat KLT dengan fase gerak heksan : etil asetat (3:1). Kemudian, ekstrak kental lengkuas diuji sitotoksik dan siklus sel pada sel MCF7.
Sel MCF7 hasil panen ditambahkan dengan ekstrak lengkuas konsentrasi 100 µg/mL; 50 µg/mL; 25 µg/mL; 12,5 µg/mL; 6,25 µg/mL. Proses inkubasi dilakukan selama 48 jam. Reagen MTT ditambahkan 100 µL ke plate 96 well untuk mengetahui ada tidaknya kristal formazan. larutan
stopper SDS 10% dalam HCl 0,1N, diinkubasi 24 jam. Dibaca absorbansi menggunakan ELISA
reader pada panjang gelombang 595 nm. Dilakukan perhitungan nilai persentase sel hidup. Hasil perhitungan IC50 yang terkecil digunakan sebagai dasar dalam uji ini. Dilakukan panen sel MCF7. Konsentrasi sampel yang digunakan yaitu IC50, ½ kali IC50, dan ¼ kali IC50. Sel diinkubasi 48 jam. Pencucian sel dengan 500 µL PBS dan dilakukan secara berulang. Sentrifugasi untuk mendapat
4
3.HASILDANPEMBAHASAN
Pemeriksaan standardisasi ekstrak kental salah satunya dapat dilakukan dengan parameter spesifik (DepKes RI, 2008). Salah satu target standardisasi ekstrak kental lengkuas yaitu dengan analisis identifikasi senyawa berkhasiat. Senyawa 1’-Asetoksikavikol asetat (ACA) merupakan salah satu komponen aktif dalam rimpang lengkuas yang berpotensi sebagai antikanker (Asri & Winarko 2016). Tabel 1 menunjukkan hasil penetapan kadar yang dilakukan oleh Sulasmi (2016).
Tabel 1. Hasil rendemen dan penetapan kadar senyawa 1’-Asetoksikavikol asetat (ACA)
Lengkuas
Kandungan senyawa aktif ini diidentifikasi menggunakan KLT. Analisis kualitatif pada masing-masing sampel diperoleh adanya spot elusi senyawa 1’-Asetoksikavikol asetat dan trans-p-kumaril diasetat. Intensitas warna yang diperoleh berbeda pada setiap sampel. Gambar 1 menunjukkan hasil elusi ekstrak lengkuas.
1. Ekstrak lengkuas Ps. Legi; 2. Ekstrak Lengkuas Ps. Wonogiri; 3. Ekstrak Lengkuas Ps. Beringharjo
5 Keterangan: ( ) Sel mati
(A). Sel MCF7 Konfluen 80% (B). Sel MCF7 + tripsin-EDTA (C). Kontrol Sel MCF7
(D). Sel MCF7 + 25 µg/mL ekstrak pasar Legi
(E). Sel MCF7 + 25 µg/mL ekstrak pasar Wonogiri
(F). Sel MCF7 + 25 µg/mL ekstrak pasar Beringhajo
Gambar 2. Morfologi sel MCF7 menggunakan mikroskop sitotoksik)
Intensitas warna hasil elusi dibandingkan dengan standar ACA, ekstrak pasar Legi dan pasar Beringharjo lebih terlihat daripada ekstrak pasar Wonogiri. Hasil tersebut sebanding dengan kadar senyawa aktif 1’-Asetoksi kavikol asetat pasar Legi lebih banyak daripada pasar Wonogiri. Berdasarkan analisis kuantitatif dan kualitatif diperoleh hasil yang sebanding. Kadar senyawa yang lebih banyak akan menghasilkan spot elusi dengan intensitas lebih baik.
6
Perubahan morfologi sel terjadi pada uji sitotoksik (Gambar 2). Pada kondisi awal, sel MCF7 berbentuk bulat lonjong tak beraturan dan bergerombol. Hasil setelah pemberian ekstrak, morfologi sel berbentuk bulat gelap dan sebagian ada yang renggang. Perubahan morfologi sel MCF7 ini menunjukkan adanya kematian sel. Hal ini dapat berkaitan dengan adanya kandungan senyawa metabolit sekunder tanaman yang berpotensi sebagai antikanker.
Tabel 2. Hasil uji sitotoksik nilai IC50 perlakuan ekstrak lengkuas
Keterangan: *Potensi antikanker
Ekstrak pasar Legi memiliki nilai IC50 terkecil dibanding sampel lain. Kandungan senyawa
1’-Asetoksi kavikol asetat sebanding dengan nilai IC50. Kadar senyawa ACA yang tinggi memberikan nilai IC50 yang kecil. Berdasarkan hasil uji sitotoksik diperoleh nilai IC50 ekstrak etanol lengkuas pasar Legi terkecil 15,8 µg/mL. Ekstrak pasar Wonogiri dan Yogyakarta tidak memiliki aktivitas antikanker. Adanya kandungan senyawa 1’-Asetoksi kavikol asetat dapat menghambat proliferasi sel MCF7 dengan IC50 20 µM (Hasima et al. 2010). Berdasarkan hasil elusi KLT (Gambar 1) dapat diketahui intensitas elusi senyawa 1’-Asetoksi kavikol asetat berpengaruh terhadap hasil nilai IC50. Perbedaan lokasi penanaman lengkuas berpengaruh terhadap keragaman karakter morfologi rimpang, hasil panen (waktu panen), dan kualitas kandungan kimia (Bermawie et al. 2012). Hasil IC50 terkecil 15,8 µg/mL tersebut kemudian dijadikan dasar untuk analisis siklus sel dengan metode flow cytometer. Metode ini dilakukan untuk mengetahui profil akumulasi sel pada fase siklus sel dan memperkirakan penghambatan proliferasi yang terjadi akibat pemberian sampel. Metode flow cytometer berdasarkan kemampuan untuk menodai (stain) DNA sel, dimana intensitas warna yang dihasilkan sebanding dengan jumlah DNA sel (Rabinovitch 1994).
Pengukuran jumlah DNA sel menggunakan 3 seri konsentrasi yaitu IC50 (15,8 µg/mL), ½ kali IC50 (7,9 µg/mL), dan ¼ kali IC50 (3,95 µg/mL). Gambar 3 menunjukkan hasil pengamatan mikroskop untuk analisis flow cytometry setelah perlakuan ekstrak. Kondisi sel untuk dapat di analisis dengan alat flow cytometer harus berupa sel tunggal. Hasil pengamatan uji siklus sel ini mengalami perubahan morfologi sel MCF7. Sel yang mati akibat pemberian sampel berubah bentuk menjadi bulat kecil, sedangkan sel yang masih hidup berbentuk tak beraturan lonjong dan bergerombol. Setiap konsentrasi memberikan perubahan morfologi sel pada pengamatan mikroskop.
Sampel lengkuas IC50 Pasar Legi 15,8 µg/mL*
7
Hasil analisis pada konsentrasi sampel ¼ kali IC50 dapat menghambat siklus sel pada fase G0-G1 dengan akumulasi sel 46,35%. Sama halnya ketika konsentrasi menjadi ½ kali IC50 terjadi peningkatan akumulasi fase G0-G1 (53,09%). Konsentrasi sampel IC50, akumulasi fase G0-G1 lebih rendah (48,98%) dibanding konsentrasi ½ kali IC50.
Tabel 3. Hasil analisis flow cytometry pada sel MCF7 dengan perlakuan ekstrak lengkuas ¼ kali IC50 (3,95
µg/mL), ½ kali IC50 (7,9 µg/mL), IC50 (15,8 µg/mL), dan kontrol sel.
Perlakuan Fase Siklus Sel
M1 G0-G1 S G2-M M5
Kontrol Sel 8,24 39,37 5,11 18,95 28,57 ¼ IC50 9,24 46,35 6,44 18,06 20,27 ½ IC50 8,28 53,09 5,62 18,78 14,50 1 IC50 5,68 48,98 5,89 19,84 19,88 Keterangan : ( ) Sel Mati
(A). Kontrol Sel MCF7 (B). Konsentrasi IC50
(C). Konsentrasi ½ kali IC50 (D). Konsentrasi ¼ kali IC50
8
Akumulasi sel pada fase G0-G1 menunjukkan adanya penghambatan siklus sel. Perbedaan jumlah akumulasi sel dalam fase siklus sel dipengaruhi oleh adanya aktivitas cyclin. Cyclin D merupakan jenis cyclin utama dalam fase G1. Aktivasi Cdk 4/6 oleh adanya ikatan dengan cyclin D akan memicu terjadinya fosforilasi pRb dan dapat memasuki fase S (Sarmoko & Larasati 2003). Senyawa 1’-Asetoksi kavikol asetat dalam ekstrak lengkuas yang diinduksi pada sel myeloma dapat menghambat siklus sel fase G0-G1 (Ito et al. 2005). Pengamatan 24 jam sel kanker MCF7 yang diberi perlakuan 10 µM senyawa ACA mengalami cell cycle arrest pada fase G0-G1. Sedangkan perlakuan ACA 50 µM sel sudah mengalami apoptosis (Campbell et al. 2007). Berdasarkan hasil analisis flow cytometer, sampel ekstrak lengkuas dapat menyebabkan akumulasi sel pada fase
G0-A
B
C
D
9
G1. Fase M1 induksi apoptosis sel paling tinggi sebanyak 9, 24% ( ¼ kali IC50) akan tetapi tidak berbeda jauh dengan kontrol sel. Hasil menunjukkan tidak adanya induksi apoptosis pada pemberian ekstrak lengkuas dan penghambatan terjadi secara cell cycle-specific pada fase G0-G1. Menurut Hasima et al (2010), penghambatan proliferasi sel MCF7 oleh ekstrak lengkuas dapat terjadi pada fase G0-G1. Berdasarkan data histogram, penghambatan proliferasi tidak diiringi adanya apoptosis, hal tersebut dapat terjadi berdasarkan sifat dari sel MCF7. Karakteristik sel MCF7 yaitu dapat mengekspresikan gen bcl2 secara berlebih. Karakterisasi ini menghambat proses apoptosis jalur internal. Gen antiapoptosis bcl2 menghambat perbaikan DNA yang rusak. Sinyal p53 dihambat dengan adanya bcl2 berlebih sehingga pelepasan sitokrom C tidak terjadi dan caspase 3 tidak dapat terbentuk.
Sifat penghambatan pada senyawa 1’-Asetoksikavikol asetat berdasarkan substitusi gugus asetoksi pada posisi para terhadap gugus 1’-asetoksipropenil. Ikatan rangkap dua pada C2’-C3’ juga berperan dalam menimbulkan aktivitas penghambatan. Hilangnya ikatan rangkap C2’-C3’ pada trans-p-kumaril diasetat dapat mengurangi aktivitas penghambatan NO (Matsuda et al. 2005). Secara molekuler senyawa fenilpropanoid ACA dapat menghambat produksi Nitric Oxide (NO) dan mencegah aktivasi NF-kB (Duronio & Xiong 2013). Radikal bebas Nitic Oxoide (NO) secara berlebih salah satunya dapat menyebabkan timbulnya kronik atau akut inflamasi (Matsuda et al. 2005). Profil kandungan senyawa 1’-asetoksikavikol asetat yang sebanding dengan aktivitas sitotoksik mengindikasikan bahwa senyawa tersebut berperan dalam menimbulkan efek antikanker dan penghambatan proliferasi sel pada fase G0-G1. Perbedaan kemampuan sitotoksik ekstrak terhadap sel MCF7 dapat dipengaruhi oleh jumlah kandungan senyawa dan geografis asal penanaman.
4.PENUTUP
Aktivitas sitotoksik ekstrak etanol lengkuas terhadap sel MCF7 berbanding lurus dengan kandungan senyawa 1’-Asetoksikavikol asetat (ACA). Semakin banyak kandungan senyawa ACA, semakin besar potensi aktivitas sitotoksik terhadap sel MCF7. Ekstrak etanol lengkuas dengan kadar senyawa ACA terbanyak (3,798%b/b) menghasilkan IC50 15,8 µg/mL dan dapat menyebabkan penghambatan proliferasi sel pada fase G0-G1.
SARAN
10
PERSANTUNAN
Bapak/Ibu laboran khususnya Laboratorium Sitotoksik Fakultas Farmasi UMS dan Laboratorium Patologi Klinik Fakultas Kedokteran UGM yang telah memberikan pengarahan, bimbingan, nasihat, masukan, dan ilmu yang bermanfaat selama penelitian.
DAFTAR PUSTAKA
Bermawie, N. et al., 2012. Karakter Morfologi, Hasil, dan Mutu Enam Genotip Lengkuas pada Tiga Argoekologi. Bul. Littro, 23(2), pp.125–135.
Departemen Kesehatan RI, 2008, Farmakope Herbal Indonesia Edisi 1, DepKes RI, Jakarta.
Campbell, C. et al., 2007. Pro-apoptotic effects of 1 ’ -acetoxychavicol acetate in human breast carcinoma cells. Elsevier, 173(3), pp.151–160.
Chauhan Vimal Singh, Swapna M, and A.S., 2014. Phytochemical Investigation and Cytotoxic Activity Of Methanolic Extract of Alpinia galanga, Department of Pharmacology , Vidhya Bharathi College of Pharmacy, India, International Journal of Applied Biology and Pharmaceutical Technology, 5(3), pp.186–189.
Duronio, R.J. & Xiong, Y., 2013. Signaling Pathways that Control Cell Proliferation. Article as Cold Spring Harb Perspect Biol, 5, pp.1–12.
Hasima, N. et al., 2010. 1S-1’-Acetoxyeugenol acetate: A new chemotherapeutic natural compound against MCF-7 human breast cancer cells. Phytomedicine, 17(12), pp.935–939.
Ito, K. et al., 2005. 1 V -Acetoxychavicol Acetate Is a Novel Nuclear Factor K B Inhibitor with Significant Activity against Multiple Myeloma In vitro and In vivo. Research Article, 65(10), pp.4417–4425.
KemenKesRI, 2015. Infodatin Pusat Data dan Informasi Kesehatan RI. Kementerian Kesehatan RI. KemenKesRI, 2016. Peringatan Hari Kanker Sedunia: Kami Bisa, Aku Bisa. , pp.1–9. Available at:
http://www.depkes.go.id/article/view/16020900004/peringatan-hari-kanker-sedunia-kami-bisa-aku-bisa.html,.
Lee, C.C. & Houghton, P., 2005. Cytotoxicity of plants from Malaysia and Thailand used traditionally to treat cancer, Journal of Ethnopharmacology, 100(September), pp.1–3.
Ma’at, S., 2004, Tanaman Obat untuk Pengobatan Kanker, Jurnal Bahan Alam Indonesia, 3, 2, 205-208.
Matsuda, H. et al., 2005. Structure-activity relationships of 1'S-1'-acetoxychavicol acetate for inhibitory effect on NO production in lipopolysaccharide-activated mouse peritoneal macrophages. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, 15(7), pp.1949–1953.
Rabinovitch, P., 1994. Introduction To Cell Cycle Analysis. Phoenix Flow Systems, Inc, pp.1– 34.Available.at:http://w.denovosoftware.com/Download/Introduction_to_Cell_Cycle_Analysis .pdf.
Sarmoko & Larasati, 2003. Regulasi siklus sel, Yogyakarta.
