Isolasi Bakteri Proteolitik Dari Pencernaaan Ikan Nila Galur Gift (Oreochromis Niloticus (Linnaeus) Trewavas) Dan Karakterisasi Protease Ekstraselulernya

(1)

ISOLASI BAKTERI PROTEOLITIK

DARI PENCERNAAAN IKAN NILA GALUR GIFT

(Oreochromis niloticus (Linnaeus) Trewavas)

DAN KARAKTERISASI PROTEASE EKSTRASELULERNYA

Oleh:

Irma Fatimah

G34101026

DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

(2)

ABSTRAK

IRMA FATIMAH. Isolasi Bakteri Proteolitik dari Pencernaan Ikan Nila Galur GIFT

(

Oreochromis niloticus

(Linnaeus) Trewavas) dan Karakterisasi Protease

Ekstraselulernya

.

Dibimbing oleh NISA RACHMANIA MUBARIK dan DINAMELLA WAHJUNINGRUM.

Bakteri proteolitik yang berhasil diisolasi dari pencernaan ikan nila GIFT (Genetic Improvement of Farm Tilapias) berjumlah 31 isolat, namun hanya dua isolat yang dikarakterisasi protease ekstraselulernya dan diidentifikasi sebagai Aeromonas sp. galur NU8 dan Enterobacter

sp. galur NU5. Aeromonas hydrophila yang bersifat patogen digunakan sebagai pembanding. Protease yang dihasilkan oleh Aeromonas sp. galur NU8 merupakan metaloprotease dengan suhu optimum 70°C dan pH optimum 7, aktivitas protease sedikit meningkat dengan penambahan 5 mM K+, dan aktivitas protease menurun dengan penambahan 5 mM EDTA. Aktivitas protease

Aeromonas sp. galur NU8 tidak stabil jika diinkubasi selama 120 menit pada suhu optimumnya, namun stabil pada setiap perlakuan pH setelah diinkubasi selama 1 jam pada suhu 4ºC. Protease yang dihasilkan oleh Enterobacter sp. galur NU5 merupakan metaloprotease dengan suhu optimum 50°C dan pH optimum 7, aktivitas protease meningkat dengan penambahan 5 mM Co2+, dan aktivitas protease menurun dengan penambahan 5 mM EDTA. Aktivitas protease

Enterobacter sp. galur NU5 tidak stabil jika diinkubasi selama 120 menit pada suhu optimumnya, namun stabil pada setiap perlakuan pH setelah diinkubasi selama 1 jam pada suhu 4ºC. A. hydrophila yang bersifat patogen sebagai pembanding menghasilkan protease dengan suhu optimum 70°C dan pH optimum 8, aktivitas protease meningkat dengan penambahan 5 mM Cu2+, dan penambahan 5 mM EDTA tidak mempengaruhi aktivitas proteasenya. Aktivitas protease A. hydrophila cenderung stabil jika diinkubasi selama 120 menit pada suhu optimumnya dan stabil juga pada setiap perlakuan pH setelah diinkubasi selama 1 jam pada suhu 4ºC. Aeromonas sp. galur NU8 mempunyai aktivitas spesifik protease yang lebih tinggi dibandingkan dengan A. hydrophila yang patogen dan Enterobacter sp. galur NU5.

ABSTRACT

IRMA FATIMAH. Isolation of Proteolytic Bacteria from Digestive Tract of Tilapias

Strain GIFT (

Oreochromis niloticus

(Linnaeus) Trewavas) and Characterization

of Its Extracellular Protease. Supervised by NISA RACHMANIA MUBARIK dan

DINAMELLA WAHJUNINGRUM.

At least 31 isolates of proteolytic bacteria were isolated from digestive tract of Tilapias strain GIFT (Genetic Improvement of Farm Tilapias), but only 2 isolates that can be used for the protease characterization. The result showed that both of them are Aeromonas sp. strain NU8 and

(3)

ISOLASI BAKTERI PROTEOLITIK

Skripsi

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains

Pada Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Institut Pertanian Bogor

Oleh:

Irma Fatimah

G34101026

DEPARTEMEN BIOLOGI

(4)

Judul : ISOLASI BAKTERI PROTEOLITIK DARI SALURAN PENCERNAAN IKAN NILA GALUR GIFT (Oreochromis niloticus (Linnaeus) Trewavas) DAN KARAKTERISASI PROTEASE EKSTRASELULERNYA

Nama : Irma Fatimah NIM : G34101026

Menyetujui,

Pembimbing I Pembimbing II

Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M.Si. Dr. Dinamella Wahjuningrum, M.Si. NIP. 1320455531 NIP. 132234940

Mengetahui,

Dekan Fakultas MIPA

Dr. Ir. Yonny Koesmaryono, MS. NIP. 131473999

(5)

PRAKATA

Bismillahirahmanirrahim

Alhamdulillah, segala puji bagi Allah yang selalu memberikan rahmat bagi makhluk-Nya. Atas ridho serta segala rahmat dan kenikmatan dari Allah SWT, karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Penyusunan karya ilmiah ini berdasarkan penelitian di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi Institut Pertanian Bogor, Bogor.

Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr. Nisa Rachmania Mubarik, MSi. dan Dr. Dinamella Wahjuningrum, MSi. yang telah membimbing penulis selama penelitian dan penulisan karya ilmiah ini. Demikian pula ucapan terima kasih disampaikan kepada Drs. Tri Atmowidi, Msi. atas saran dan masukan dalam penulisan skripsi ini. Penelitian ini menggunakan bahan kimia yang didanai dari penelitian QUE-Biologi tahun 2002-2003.

Ucapan terima kasih terdalam penulis haturkan untuk orang-orang yang sangat kusayangi: Ayah, Ibu, dan kakakku Evi terima kasih untuk kasih sayang, doa, perhatian, dan semua dukungannya selama ini. Terima kasih untuk teman-teman Biologi 38 it’s fun to be with you, khususnya buat Cynthia Marbun, Ambar, Deri, Trio, dan Andini terima kasih kalian selalu menemani dan mendukung setiap langkah dalam penelitianku. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada seluruh staf laboratorium mikrobiologi yang telah membantuku selama penelitian dan kepada semua kakak kelas yang telah membantu kelancaran penelitian. Tidak lupa kepada M’20: M’Atin sekeluarga, M’Yayu, Atiek, Yayan, Dita, Teh Imas, Ika, Geril, M’Eva, Kak Ulie, dan Neni terima kasih untuk canda tawanya selama ini.

Penulis berharap semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat.

Bogor, Oktober 2005

(6)

RIWAYAT HIDUP

(7)

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR GAMBAR... DAFTAR LAMPIRAN...………... PENDAHULUAN... BAHAN DAN METODE... Waktu dan Tempat Penelitian... Bahan... ... Metode Penelitian... Pengambilan Sampel dan Isolasi Bakteri... Penapisan Bakteri Penghasil Protease... Identifikasi Isolat... Pertumbuhan dan Kurva Aktivitas Protease... Pengujian Aktivitas Protease dan Pengukuran Kadar Protein... Karakterisasi Protease...

Penentuan pH Optimum... Penentuan Suhu Optimum... Pengaruh Penambahan Senyawa Penghambat dan Kation... Pengujian Ketahanan Enzim terhadap Panas dan pH...

HASIL... Isolasi Bakteri Penghasil Protease... Identifikasi Isolat... Pertumbuhan dan Kurva Aktivitas Protease... Karakterisasi Protease...

PEMBAHASAN... SIMPULAN... DAFTAR PUSTAKA...

vi vii 1 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3

3 3 3 4 4

(8)

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1

2

3

4

5

6

7

8

Pembentukkan zona bening: A. Enterobacter sp. galur NU5, B. Aeromonas

sp. galur NU8, dan C. A. hydrophila pada cawan agar nutrien... Pertumbuhan dan kurva aktivitas spesifik protease Enterobacter sp. galur NU5 selama 24 jam pada suhu ruang (25-27º C)... Pertumbuhan dan kurva aktivitas spesifik protease Aeromonas sp. galur NU8 selama 27 jam pada suhu ruang (25-27º C)... Aktivitas protease Aeromonas hydrophila, Aeromonas sp. galur NU8, dan

Enterobacter sp. galur NU5 pada berbagai suhu... Aktivitas protease Aeromonas hydrophila, Aeromonas sp. galur NU8, dan

Enterobacter sp. galur NU5pada berbagai pH... Aktivitas protease Aeromonas sp. galur NU8, Enterobacter sp. galur NU5, dan Aeromonas hydrophila pada berbagai senyawa... Kestabilan aktivitas protease Aeromonas sp. galur NU8, Enterobacter sp. galur NU5, dan Aeromonas hydrophila pada suhu optimumnya masing-masing... Kestabilan aktivitas protease Aeromonas sp. galur NU8, Enterobacter sp. galur NU5, dan Aeromonas hydrophila terhadap pH...

4

5

(9)

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1

2 3 4

5

6

7

8

9

10

11

Taksonomi ikan nila galur GIFT (Oreochromis niloticus (Linnaeus) Trewavas) dan ciri-cirinya... Metode pengujian aktivitas protease (Walter 1984)... Metode pengukuran kadar protein mikroasai (Hammond et al. 1988)... Ciri-ciri morfologi dan indeks proteolitik (IP) isolat yang berasal dari saluran pencernaan ikan nila galur GIFT... Pertumbuhan dan aktivitas spesifik protease Enterobacter sp. galur NU5 selama 24 jam pada suhu ruang (25-27°C)... Pertumbuhan dan aktivitas spesifik protease Aeromonas sp. galur NU8 selama 27 jam pada suhu ruang (25-27°C)... Aktivitas protease Aeromonas hydrophila, Aeromonas sp. galur NU8, dan

Enterobacter sp. galur NU5 pada berbagai suhu... Aktivitas protease Aeromonas hydrophila, Aeromonas sp. galur NU8, dan

Enterobacter sp. galur NU5 pada berbagai pH... Aktivitas protease Aeromonas sp. galur NU8, Enterobacter sp. galur NU5, dan Aeromonas hydrophila pada berbagai senyawa... Kestabilan aktivitas protease Aeromonas sp. galur NU8, Enterobacter sp. galur NU5, dan Aeromonas hydrophila pada suhu optimumnya masing-masing... Kestabilan aktivitas protease Aeromonas sp. galur NU8, Enterobacter sp. galur NU5, dan Aeromonas hydrophila terhadap pH...

11 11 11

12

13

15

16

(10)

PENDAHULUAN

Ikan nila galur GIFT (Genetic Improvement of Farmed Tilapias) atau

Oreochromis niloticus (Linnaeus) Trewavas merupakan salah satu anggota Famili Serranidae yang bernilai ekonomis tinggi bagi Indonesia (Lampiran 1). Di Indonesia nilai ekspor ikan ini ± 10 ton/tahun setelah Thailand (Suria 2003 dalam Nur 2004).

Ikan nila galur GIFT mempunyai keuntungan lain, yaitu: pemeliharaannya mudah, harga murah, dan lebih disukai oleh pasar. Ikan nila galur GIFT masuk dari Filipina ke Indonesia pada tahun 1994 dengan alasan untuk meningkatkan keanekaragaman jenis ikan di Indonesia. Menurut Widiyati et al. 1995 dalam Brojo (1999) ikan nila galur GIFT mempunyai pola pertumbuhan dan daya adaptasi yang lebih baik jika berada di daerah dengan iklim seperti di Indonesia, sehingga dapat dengan mudah beradaptasi.

Ikan nila tergolong ke dalam ikan herbivora pemakan plankton yang mengkonsumsi bahan protein yang lebih sedikit dibandingkan ikan predator. Pada umumnya usus ikan herbivora lebih panjang daripada usus ikan karnivora. Oleh karena itu, kemungkinan ditemukannya mikrob flora normal lebih besar (UT 2004). Flora normal dapat berfungsi sebagai probiotik, karena dapat membantu proses metabolisme inang tanpa merusak jaringan inang. Bakteri probiotik dapat menghasilkan enzim hidrolitik, seperti protease (Verschuere et al.

2000), amilase (Moriarty 1999), dan lipase (Janice & Felix 2002).

Menurut Verschuere (2000), probiotik merupakan mikrob hidup yang ditambahkan dan memiliki pengaruh menguntungkan inang dengan cara mengubah hubungan saling menguntungkan antara inang-mikrob dan antar komunitas mikrob menjadi lebih baik, meningkatkan kecernaan pakan pada inang atau nilai nutrisi dari pakan tersebut, meningkatkan respon inang terhadap penyakit, atau dapat juga dengan meningkatkan kualitas air. Moriarty (1999) mendefinisikan probiotik sebagai kultur tunggal atau campuran mikroorganisme hidup yang digunakan pada hewan dan manusia, bersifat menguntungkan bagi inang dengan cara meningkatkan kemampuan mikroflora asli, sedangkan probiotik untuk akuakultur adalah kultur tunggal atau campuran mikroorganisme hidup yang digunakan untuk memperbaiki habitat inang

dengan menambah jumlah bakteri alami yang membantu hidup inang, karena bakteri ini dapat mengubah komposisi bakteri di air dan sedimen.

Kasus penyakit ikan disebabkan oleh bakteri yang berkaitan erat dengan faktor ekstraseluler yang dihasilkan, antara lain enzim protease. Beberapa peneliti melaporkan jenis protease tertentu berperan penting dalam kerusakan jaringan ikan, seperti protease yang dihasilkan oleh

Aeromonas hydrophila Allan & Stevenson 1981; Chabot & Thune 1991), Vibrio harveyi (Moriarty 1999), V. anguillarum,

Flexibacter columnaris, dan Pseudomonas aeruginosa (Secades & Guijarro 1999). Menurut Snieszko dan Axelrod (1971), toksin dan enzim protease yang dihasilkan oleh bakteri patogen dapat merusak jaringan ikan, misalnya pada dinding saluran pencernaan.

Genus Aeromonas selain mempunyai kemampuan proteolitik juga mempunyai kemampuan hemolitik. Hemolitik merupakan kemampuan untuk mendegradasi hemoglobin dalam darah. Aeromonas

mempunyai kemampuan hemolitik lebih tinggi dibandingkan dengan proteolitiknya terutama pada Aeromonas patogen (Cahill 1990 dalam Cipriano et al. 2001).

Aeromonas merusak sel darah merah dan resisten terhadap serum yang dihasilkan oleh leukosit. Di samping itu, Aeromonas

mempunyai faktor virulensi yang lain, yaitu: struktur lipopolisakarida, á-hemolisin, â -hemolisin, siderofor, hemaglutinin, enterotoksin, dan protein permukaan (Cipriano et al. 2001).

Berdasarkan data yang ada di Loka Riset Perikanan Air Tawar (Loriskanwar) Sukamandi Subang, Jawa Barat, ikan nila jarang terserang penyakit, walaupun ikan jenis lain yang terdapat pada kolam yang sama terserang penyakit. Oleh karena itu, diharapkan bakteri pencernaan pada ikan nila dapat berperan sebagai probiotik bagi ikan lain. Probiotik dipilih umumnya tidak menyebabkan resistensi mikrob target seperti antibiotik. Selain itu, probiotik yang dipilih bersifat proteolitik dengan tujuan untuk membuat suatu produk tandingan yang dapat menghambat faktor virulensi mikrob patogen.

(11)

mikrob, serta mempunyai peranan penting dalam metabolisme dan regulasi dalam sel (Ward 1983). Enzim ekstraseluler disekresikan ke luar sel dan mendegradasi senyawa polimer menjadi senyawa yang lebih sederhana yang mudah larut dan diserap melalui dinding sel. Enzim ekstraseluler banyak digunakan dalam industri, karena dihasilkan dalam jumlah besar dan metode ekstraksi cukup mudah (Stanbury & Whitaker 1984).

Protease terdiri atas empat subkelompok berdasarkan mekanisme katalitik enzim, yaitu: protease serin, protease sistein, protease asam, dan protease logam atau metaloprotease (Rao et al. 1998). Contoh metaloprotease yang diaktifkan oleh ion magnesium dan kalsium ialah berasal dari

Citrobacter sp. galur BKL-1 yang diisolasi dari bagian lambung ikan kerapu lumpur (Ariana et al. 2003). Contoh protease serin adalah protease yang berasal dari Bacillus

sp. galur BKU-10 (Fitri et al. 2005). Protease serin atau protease yang memiliki gugus serin pada sisi aktifnya dapat juga dihasilkan oleh A. hydrophila dan P. aeruginosa (Rao et al. 1998). Protease serin dihambat oleh senyawa diisopropil fluorofosfat (DFP) atau fenilmetilsulfonil fluorida (PMSF) (Bollag & Edelstein 1991). Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan isolat proteolitik yang berasal dari saluran pencernaan ikan nila GIFT dan melakukan karakterisasi enzim protease dari isolat yang terpilih. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi untuk jenis protease bakteri lainnya dari saluran pencernaan ikan air tawar.

BAHAN DAN METODE

Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilakukan dari bulan Januari sampai Juni 2005 di Laboratorium Mikrobiologi FMIPA, IPB.

Bahan

Aeromonas hydrophila patogen koleksi dari Laboratorium Kesehatan Ikan, Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan-IPB. Sebanyak dua sampel ikan nila GIFT didapat dari Loka Riset Perikanan Air Tawar (Loriskanwar) Sukamandi Subang, Jawa Barat dalam keadaan hidup. Sampel saluran pencernaan ikan nila galur GIFT (O. niloticus) dewasa diambil dari 2 bagian, yaitu: lambung

dan usus sepanjang 0-3 cm dari lambung.

Metode Penelitian

Pengambilan Sampel dan Isolasi Bakteri

Ikan dibedah untuk diambil bagian saluran pencernaannya secara aseptik dan dalam keadaan dingin (menggunakan es). Saluran pencernaan ikan dipilah berdasarkan bagiannya, yaitu: lambung dan usus sepanjang 0-3 cm dari lambung. Kemudian masing-masing dimasukkan ke dalam 50 ml media kaldu nutrien (NB [Difco]; komposisi per liter: bakto ekstrak sapi 3 g dan bakto pepton 5 g) yang mengandung susu skim 0.5 %. Setelah itu, sampel diinkubasi pada suhu 25-27º C selama ± 48 jam sambil dikocok 140 rpm di atas mesin pengocok (Lab line, USA).

Penapisan Bakteri Penghasil Protease

Sebanyak satu ose suspensi bakteri digores kuadran pada media agar-agar nutrien yang mengandung susu skim (NAS) 0.5% dan diinkubasi pada suhu 25-27º C selama ± 24 jam. Koloni yang tumbuh membentuk zona bening diisolasi dan diinokulasikan ke media NAS 0.5 % dengan gores kuadran, serta diinkubasi pada suhu 25-27º C selama ± 24 jam. Setelah mendapatkan koloni tunggal, dipilih beberapa isolat yang memiliki Indeks Proteolitik (IP) terbesar dan morfologi koloni yang berbeda untuk diidentifikasi dan diamati produksi dan karakteristik proteasenya. IP merupakan nisbah antara diameter zona bening dengan diameter koloni. Isolat yang telah murni disimpan di dalam gliserol pada suhu -20º C. Peremajaan isolat secara rutin dilakukan pada media NAS 0.5 %.

Identifikasi Isolat

Isolat terpilih yang diseleksi berdasarkan indeks proteolitiknya. Identifikasi tahap awal meliputi pewarnaan Gram, pertumbuhan isolat pada media

Salmonella-Shigella agar (SSA) dan eosin methylene-blue agar (EMBA). Identifikasi sampai genus berdasarkan Bergey’s of Determinative Bacteriology (Holt et al. 1994).

Pertumbuhan dan Kurva Aktivitas Protease

(12)

dan diinkubasi selama 6 jam untuk

Enterobacter sp. galur NU5 pada suhu ruang. Kemudian sebanyak 109 sel/ml dimasukkan ke dalam 200 ml media produksi protease. Sedangkan untuk A. hydrophila dan Aeromonas sp. galur NU8 diinkubasi selama 4 jam pada suhu ruang. Kemudian sebanyak 108 sel/ml dimasukkan ke dalam 200 ml NBS 0.5%. Pembuatan kurva turbiditas pertumbuhan dilakukan dengan cara mengukur absorbansi suspensi biakan pada panjang gelombang 640 nm setiap selang waktu 3 jam selama 24 jam.

Cara mendapatkan ekstrak kasar enzim dengan melakukan sentrifugasi (Jouan, Perancis) suspensi bakteri pada kecepatan 8400 xg selama 5 menit. Aktivitas protease diukur dengan metode Walter (1984) yang dimodifikasi pada suhu 37º C dan pH 8.

Pengujian Aktivitas Protease dan Pengukuran Kadar Protein

Aktivitas protease diukur dengan metode Walter (1984) yang dimodifikasi. Sebanyak 0.5 ml larutan kasein 1 % direaksikan dengan 0.5 ml bufer tris HCl 0.05 M pH 8 dan 0.1 ml ekstrak kasar enzim, kemudian diinkubasi dalam penangas air pada suhu 37º C. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 1 ml larutan asam trikloroasetat (TCA) 10 % (b/v) dan diinkubasi di dalam lemari es (20º C) selama 10 menit. Hasil reaksi disentrifugasi pada kecepatan 8400 xg selama 5 menit. Sebanyak 0.75 ml filtrat ditambahkan dengan 2.5 ml Na2CO3 0.5 M dan 0.5 ml Folin Ciocalteu (1:2). Supernatan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 578 nm (Spectronic 20) dengan menggunakan L-tirosin sebagai standar. Satu unit aktivitas protease setara dengan 1µmol tirosin yang dihasilkan per menit pada kondisi pengukuran (Lampiran 2).

Kadar protein sampel diukur dengan metode Bradford (1976) yang dimodifikasi oleh Hammond et al. (1988) untuk mikroasai. Sebanyak 4 ml larutan Bradford dimasukkan ke dalam tabung yang telah berisi 0.4 ml enzim. Selanjutnya dikocok kuat dengan menggunakan vortex dan diinkubasi selama 15 menit. Absorbansi larutan diukur pada panjang gelombang 595

nm. Bovine serum albumin (BSA)

digunakan sebagai standar dengan konsentrasi 0-0.1 mg/ml (Lampiran 3). Kadar protein sampel ditentukan dari persamaan regresi kurva standar. Aktivitas

spesifik adalah aktivitas protease per miligram protein.

Karakterisasi Protease

Karakterisasi bertujuan untuk menentukan suhu dan pH optimum aktivitas enzim, ketahanan terhadap panas dan pH, serta pengaruh penambahan senyawa kation dan penghambat.

Penentuan pH Optimum. Penentuan

pH optimum dilakukan dengan cara mengukur aktivitas protease pada berbagai pH. Larutan bufer yang digunakan bufer sitrat 0.05 M (pH 5 dan 6) dan tris-HCl 0.05 M (pH 7, 8, dan 9).

Penentuan Suhu Optimum. Penentuan

suhu optimum dilakukan dengan cara mengukur aktivitas protease pada berbagai suhu inkubasi, yaitu: pada kisaran 30º C dan 80º C dengan selang 10º C.

Pengaruh Penambahan Senyawa

Penghambat dan Kation. Ekstrak kasar

enzim direaksikan dengan etilena diamina tetra asetat (EDTA) dan berbagai kation monovalen (Na+ dan K+) dan kation bivalen (Ca2+, Mg2+, Co2+, Cu2+, dan Zn2+) yang masing-masing berasal dari garam NaCl, KCl, CaCl2.2H2O, MgCl2.6H2O, CoCl2, CuCl2, dan ZnCl2, dengan konsentrasi akhir kation pada eaksi enzim masing-masing 5 mM. Campuran diinkubasi pada suhu dan pH optimum selama 10 menit.

Pengujian Ketahanan Enzim

terhadap Panas dan pH. Kestabilan enzim

terhadap panas diukur dengan menginkubasi ekstrak kasar enzim tanpa substrat pada suhu optimum selama 120 menit, kemudian aktivitas enzim diukur setiap 30 menit pada suhu dan pH optimumnya. Sedangkan untuk kestabilan pH diketahui dengan menginkubasi ekstrak kasar enzim pada suhu 4º C di dalam lemari es selama 1 jam. Enzim diencerkan dengan bufer pH 5-9 (perbandingan 1:1), kemudian aktivitas enzim kemudian diukur pada suhu dan pH optimum.

HASIL

Isolasi Bakteri Penghasil Protease

(13)

Isolat ditumbuhkan pada media EMBA dan SSA bertujuan untuk melihat kemampuannya mereduksi laktosa. Isolat yang dapat mereduksi laktosa tumbuh pada media EMBA dan tidak pada media SSA. Media EMBA dan SSA dapat pula digunakan untuk membedakan sifat gram bakteri. Bakteri gram positif tidak dapat mereduksi laktosa, sehingga tidak dapat hidup pada media EMBA.

Identifikasi Isolat

Hanya dua isolat yang digunakan untuk diidentifikasi dan diamati proteasenya, yaitu: isolat NU5 dan isolat NU8. Kedua isolat menghasilkan zona bening media NAS 0.5% (Gambar 1, Lampiran 4). Hasil identifikasi menunjukkan bahwa kedua isolat adalah

Enterobacter sp. galur NU5 dan Aeromonas

sp. galur NU8 (Tabel 1).

Tabel 1 Ciri-ciri morfologi dan fisiologi isolat NU8 dan NU5 yang berumur 24 jam

Ciri-ciri Isolat NU8 Isolat NU5 Bentuk sel Pewarnaan gram Fermentasi karbohidrat Pembentukan gas Merah metil Voges-Proskauer Oksidase Indol Nitrit Hidrolisis urea Hidrolisis pati Sitrat simmons Motilitas Sifat Indeks proteolitik (IP) Batang pendek - + + + + + + + - + + Motil Anaerob fakultatif 1.10 Batang pendek - + + + + - - + + - + Motil Aerob obligat 4.50

Pertumbuhan dan Kurva Aktivitas Protease

Pertumbuhan sel pada media NBS 0.1% menunjukkan bahwa galur NU5 memasuki fase stasioner pada jam ke-18 dan memiliki aktivitas spesifik protease tertinggi pada jam ke-24, yaitu: 0.121 U/mg dengan kadar protein 0.066 mg/ml (Gambar 2, Lampiran 5). Galur NU8 mengalami fase stasioner pada jam ke-21 dan aktivitas spesifik protease tertinggi tercapai pada jam ke-24, yaitu: 0.267 U/mg dengan kadar protein 0.060 mg/ml (Gambar 3, Lampiran 6).

7.2 7.4 7.6 7.8 8 8.2 8.4 8.6 8.8 9

0 3 6 9 12 15 18 21 24

W a ktu inkub a si (ja m )

L o g s e l 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 A k ti v it as sp e si fi p ro tease ( U /m g )

P e rtum buhan s el A k tivitas s pes ifik proteas e

9.2 9.4 9.6 9.8 10 10.2 10.4 10.6 10.8

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27

W aktu inkubasi (jam )

Lo g se l 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 A kt iv ita s sp es ifi k pr ot eas e ( U /m g)

P ertum buhan sel A ktivitas spesifik protease

Karakterisasi Protease

Suhu optimum galur NU8 ialah 70º C dengan aktivitas protease sebesar 0.079 U/mg (Gambar 4, Lampiran 7) dan pH optimumnya 7 dengan aktivitas protease sebesar 0.548 U/mg (Gambar 5, Lampiran 8). Sedangkan suhu optimum galur NU5 50º C dengan aktivitas protease sebesar 0.005 U/mg (Gambar 4, Lampiran 7) dan pH Gambar 2 Pertumbuhan dan kurva aktivitas spesifik protease Enterobacter sp. galur NU5 selama 24 jam pada suhu ruang (25-27º C).

Gambar 3 Pertumbuhan dan kurva aktivitas spesifik protease Aeromonas sp. galur NU8 selama 27 jam pada suhu ruang (25-27º C). Gambar 1 Pembentukkan zona bening:

A. Enterobacter sp. galur NU5, B. Aeromonas sp. galur NU8, dan C. A. hydrophila pada cawan agar nutrien

A

B

(14)

optimumnya 7 dengan aktivitas protease sebesar 0.005 U/mg (Gambar 5, Lampiran 8).

Penambahan kation K+ dengan konsentrasi akhir 5 mM menaikkan sedikit aktivitas protease galur NU8 dari 1.258 U/mg menjadi 1.274 U/mg (1.27%), tetapi penambahan kation Na+ dengan konsentrasi akhir 5 mM tidak berpengaruh terhadap aktivitas protease galur NU8. Penambahan kation Mg2+, Cu2+, Ca2+, Co2+, dan Zn2+ dengan konsentrasi akhir 5 mM menurunkan aktivitas protease galur NU8. Aktivitas protease galur NU5 menurun oleh penambahan kation K+ sebesar 35.4%. Penambahan kation Na+, Mg2+, Cu2+, Ca2+, dan Co2+ meningkatkan aktivitas protease galur ini (Gambar 6, Lampiran 9). Kenaikan aktivitas protease terbesar dengan penambahan kation Co2+, yaitu: dari 0.065 U/mg menjadi 0.225 U/mg (71.1%).

Penambahan senyawa pengkelat logam EDTA dengan konsentrasi akhir 5 mM sangat menurunkan aktivitas protease galur NU8 sebesar 85.9%, sedangkan galur NU5 turun aktivitas proteasenya sebesar 75.4%.

Protease galur NU5 yang diinkubasi pada suhu 50°C selama 30 menit pertama mengalami penurunan sebesar 80%, sedangkan protease galur NU8 mengalami penurunan sebesar 94%. Protease kedua galur menunjukkan penurunan aktivitas selama 120 menit inkubasi pada suhu optimumnya masing-masing dengan aktivitas tersisa kurang dari 20% dibandingkan awal inkubasi (Gambar 7, Lampiran 10). Aktivitas protease kedua galur relatif menunjukkan kestabilan terhadap pH 5-9 setelah diinkubasi selama 1 jam pada suhu 4º C (Gambar 8, Lampiran 11).

Aeromonas hydrophila yang digunakan sebagai pembanding mempunyai suhu optimum 70ºC dengan aktivitas protease sebesar 0.008 U/mg (Gambar 4, Lampiran 7) dan pH optimum 8 dengan aktivitas protease sebesar 0.007 U/mg (Gambar 5, Lampiran 8). Penambahan EDTA tidak berpengaruh terhadap aktivitas protease A. hydrophila, namun aktivitas meningkat dengan penambahan Cu2+ sebesar 94.6% (Gambar 6, Lampiran 9). Aktivitas protease A. hydrophila relatif stabil pada kisaran pH 5-9 setelah diinkubasi selama 1 jam pada suhu 4º C (Gambar 8, Lampiran 11), namun aktivitas mengalami kenaikan sebesar 433.3% setelah diinkubasi pada suhu

optimumnya selama 120 menit (Gambar 7, Lampiran 10). 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1

30 40 50 60 70 80

S uhu (0C )

A PS A . h yd ro ph ila d an E nt er ob ac te r sp . gal ur N U 5 ( U /m g) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 A PS A er om on as sp . ga lu r N U 8 ( U /m g)

A erom onas hydrophila E nterobacter sp. galur NU5

A erom onas sp. galur NU8

0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09

5 6 7 8 9

p H A SP A . h yd rop hil a d an E nt er oba ct er s p. ga lu r NU 5 (U /m g) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 A SP A er om on as s p. ga lu r N U 8 (U /m g)

A erom onas hy drophila E nterobac ter s p. galur NU 5

A erom onas s p. galur N U 8

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 E D

TA Na K Mg Cu Co Ca Zn

kont rol Kation A SP A . h yd rop hi la d an E nt er obac te r sp . gal ur NU 5 (U /m g) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 A SP A er om on as sp . gal ur NU 8 (U /m g)

Aerom onas hydrophila Enterobacter sp. galur NU5 Aerom onas sp. galur NU8

Gambar 4 Aktivitas protease A. hydrophila, Aeromonas sp. galur NU8, dan Enterobacter sp. galur NU5 pada berbagai suhu (APS= aktivitas spesifik protease).

Gambar 5 Aktivitas protease A. hydrophila, Aeromonas sp.galur NU8,dan Enterobactersp. galur NU5 pada berbagai pH

(15)

0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1

0 30 60 90 120

W ak tu ink ubas i (me nit)

A P S A . h yd ro ph il a d an E nt er oba ct er s p. g al ur NU 5 (U /m g) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 A P S A er om on as s p. ga lu r NU 8 (U /m g)

A erom onas hy drophila E nterobac ter s p. galur NU5 A erom onas s p. galur NU8

0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12

5 6 7 8 9

p H A SP A . h yd ro ph ila d an E nt er ob ac te r sp . NU 5 (U /m g) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 A SP A er om on as sp . gal ur N U8 ( U /m g)

Aerom onas hydrophila Enterobacter sp. galur NU5 Aerom onas sp. galur NU8

PEMBAHASAN

Tiga puluh satu isolat yang diperoleh tidak digunakan seluruhnya, namun hanya dua isolat. Enterobacter sp. galur NU5 dipilih karena isolat ini menghasilkan zona bening dengan IP terbesar (4.5), sedangkan

Aeromonas sp. galur NU8 membentuk zona bening dengan IP yang lebih kecil (1.1). Perbedaan IP terjadi karena kemampuan difusi protease pada media NAS 0.5% untuk setiap isolat tidak sama. Isolat yang mempunyai IP besar merupakan isolat yang menghasilkan protease dengan kemampuan difusi lebih besar dibandingkan dengan isolat lain. Oleh karena itu, IP yang besar tidak dapat mencerminkan aktivitas protease yang besar pula. Aeromonas sp. galur NU8 mempunyai aktivitas protease jauh lebih

besar, yaitu: 0.267 U/mg dibandingkan

Enterobacter sp. galur NU5, yaitu: 0.121 U/mg dengan waktu inkubasi dan kadar protein yang sama, yaitu: 24 jam dan 0.066 mg/ml.

Aktivitas protease Enterobacter sp. galur NU5 tertinggi sebelum memasuki fase stasioner terdapat pada jam ke-9 sebesar 0.115 U/mg yaitu ketika sel dalam fase pertumbuhan eksponensial. Protease yang dihasilkan sebagian besar digunakan untuk kebutuhan pertumbuhan dan metabolisme sel.

Pada jam ke-24 Enterobacter sp. galur NU5 sudah masuk fase stasioner dan menghasilkan aktivitas proteolitik tertinggi. Pada fase ini sel mengeluarkan metabolit yang sebagian besar digunakan untuk mempertahankan diri (Pelczar & Chan 1986). Protease yang dihasilkan lebih banyak dan difungsikan untuk bersifat antagonis dengan organisme lain (Moriarty 1999). Umumnya protease jenis netral dan alkali diproduksi pada akhir fase pertumbuhan eksponensial dan stasioner, seperti yang dihasilkan oleh Bacillus sp. galur BBU-32 (Sukma 2003) dan B. stearothermophillus (Kubo et al. 1988).

Aeromonas sp. galur NU8 yang

diperoleh dari ikan sehat dibandingkan dengan Aeromonas hydrophila patogen dalam hal protease ekstraselulernya. Hal ini bertujuan untuk melihat adakah perbedaan ciri-ciri biokimia aktivitas protease yang dihasilkan.

Aktivitas spesifik protease A. hydrophila sebesar 0.007 U/mg jauh lebih rendah dibandingkan dengan aktivitas spesifik Aeromonas sp. galur NU8 sebesar 0.548 U/mg yang diukur pada suhu 70º C, pH 7. Protease yang dihasilkan oleh A. hydrophila aktivitasnya tidak berubah pada penambahan pengkelat logam EDTA. Protease yang dihasilkan oleh Aeromonas

sp. galur NU8 merupakan metaloprotease, karena aktivitas protease spesifiknya mengalami penurunan sebesar 85.9% pada saat dilakukan penambahan EDTA. Menurut hasil penelitian Chabot & Thune (1991), kompleks A. hydrophila yang digunakan dalam penelitiannya menghasilkan protease jenis P1 yang tidak dihambat oleh EDTA, tetapi meningkat dengan penambahan Mg2+. Kation Cu2+ dapat meningkatkan aktivitas protease yang dihasilkan oleh

Aeromonas hydrophila sebesar 94.6%, tetapi sebaliknya bagi aktivitas protease yang turun sebesar 94.8%. Di sisi lain, kation Na+ dan Gambar 7 Kestabilan aktivitas protease

Aeromonas sp. galur NU8,

Enterobacter sp. galur NU5, dan

A. hydrophila pada suhu

optimumnya masing-masing.

Gambar 8 Kestabilan aktivitas protease Aeromonas sp. galur NU8,

Enterobacter sp. galur NU5, dan

(16)

K+ dapat meningkatkan protease yang dihasilkan oleh kedua isolat. Hal ini diperkirakan bahwa beberapa kation divalen yang digunakan berikatan dengan sisi alosterik enzim dan mengubah sisi aktif enzim, namun pengikatan kation ini tidak mampu meningkatkan aktivitas katalitik protease Aeromonas sp. galur NU8, sedangkan Mo2+, Cu2+, Fe2+, Co2+, Ni2+, Mn2+, Se2+ dan Zn2+ merupakan unsur mikro essensial dari berbagai jenis enzim yang berfungsi sebagai kofaktor yang dapat membantu meningkatkan aktivitas katalitik enzim (Lehninger 1982). Beberapa logam pada enzim tertentu dapat meningkatkan aktivitas katalitiknya (Whitaker 1994). Hal yang sama terjadi pada protease yang dihasilkan Citrobacter sp. galur BKL-1 aktivitasnya menurun dengan penambahan Cu2+. Penelitian Artika (2005) menunjukkan bahwa protease yang dihasilkan Serratia marcescens BKU-31 aktivitasnya menurun dengan penambahan Mg2+, Cu2+, Fe2+, Co2+, Ca2+, dan Zn2+ dan meningkat dengan penambahan Na+ dan K+. Sukma (2003) melaporkan bahwa Bacillus sp. galur BBU-32 menghasilkan protease yang menurun dengan penambahan Mg2+, Cu2+, Mn2+, Co2+, Ca2+, dan Zn2+ dan meningkat dengan penambahan Na+ dan K+.

Walaupun Enterobacter sp. galur NU5 tidak dibandingkan dengan bakteri patogen dengan genus yang sama, tetapi tidak menutup kemungkinan bersifat patogen. Bakteri komensal pada ikan dapat menjadi patogen sekunder jika kondisi inang sedang stress atau menurun (Brojo 1999).

Enterobacter sp. galur NU5 menghasilkan protease dengan suhu optimum 50°C, seperti halnya protease yang dihasilkan oleh

Bacillus sp. galur BKU 10 mempunyai suhu optimum 50°C (Fitri et al. 2005). Protease yang dihasilkan oleh Enterobacter sp. galur NU5 merupakan metaloprotease, karena aktivitas protease mengalami penurunan sebesar 75% dengan penambahan pengkelat logam EDTA. Aktivitas protease yang paling besar terjadi dengan penambahan Co2+, yaitu: sebesar 71.1%. Hal ini menunjukkan bahwa protease Enterobacter

sp. galur NU5 memerlukan adanya ion Co2+ untuk mengoptimalkan aktivitasnya. Penelitian Kusumawardhani (2004) menunjukkan bahwa protease yang dihasilkan isolat H2 aktivitasnya mengalami peningkatan paling tinggi dengan penambahan Co2+. Kation berperan sebagai komponen penting pada sisi aktif enzim,

atau bagian dari kofaktor yang dapat menjaga konformasi enzim Whitaker (1994). Di samping itu, ion mempunyai beberapa fungsi dalam mekanisme kerja enzim, yaitu: menciptakan bagian yang utuh pada sisi aktif enzim, membentuk ikatan antara enzim dengan substrat, mengubah konstanta keseimbangan pada reaksi, mengubah muatan permukaan pada protein enzim, menghilangkan hambatan reaksi, mengganti ion logam yang tidak efektif dari sisi enzim atau substrat, dan mengubah keseimbangan konformasi dari kurang aktif menjadi lebih aktif (Rhichardson & Hyslop 1985).

Kestabilan panas enzim diukur berdasarkan nilai T50. Nilai T50 menunjukkan suhu inkubasi yang menyebabkan aktivitas sisa suatu enzim tinggal 50% setelah inkubasi 30 menit (Eijsink et al. 1993). Suatu enzim akan dikatakan stabil terhadap panas, apabila nilai T50-nya besar dan turunnya aktivitas enzim tersebut kurang dari 50%, tetap, atau meningkat setelah inkubasi selama 30 menit pada suhu optimumnya. Kestabilan protease

Enterobacter sp. galur NU5 (50°C) dan

Aeromonas sp. galur NU8 (70°C) menurun pada 30 menit inkubasi masing-masing sebesar 80% dan 94%. Aktivitas protease A. hydrophila (70°C) cenderung stabil bahkan aktivitasnya meningkat sebesar 433.3% selama 120 menit inkubasi.

Kestabilan suatu enzim terhadap panas dipengaruhi oleh interaksi intramolekul, densitas konformasi protein, penempatan residu hidrofobik di bagian dalam, dan pemaparan residu hidrofil ke permukaan molekul protein (Wahyuntari 2005). Penelitian Eijsink et al. (1995) membuktikan bahwa melakukan mutasi pada daerah di ujung N suatu enzim, dapat meningkatkan kestabilan enzim tersebut terhadap panas.

Protease yang dihasilkan oleh ketiga isolat relatif stabil pada kisaran pH 5-9. Hal yang serupa juga dilaporkan oleh Artika (2005) bahwa protease yang dihasilkan S. marcescens sp. galur BKU-31 relatif stabil pada kisaran pH 6.5-9.0. Kisaran pH yang relatif lebar ini dapat memberikan nilai lebih pada enzim tersebut, misalnya saat terjadi perubahan pH pada kisaran tersebut reaksi enzim masih dapat menghasilkan produk dengan optimal.

(17)

konsentrasi bufer, ada atau tidaknya substrat, kekuatan ion dan konstanta dielektrik media, dan pengaruh pH pada kestabilan kofaktor dan aktivator (Whitaker 1994). Faktor-faktor yang mempengaruhi kestabilan pH dan suhu tergantung pada semua faktor yang mempengaruhi struktur sekunder, tersier, dan kuartener dari enzim tersebut (Lehninger 1982, Whitaker 1994).

SIMPULAN

Sebanyak 31 isolat bakteri proteolitik berhasil diperoleh dari pencernaan ikan nila galur GIFT. Karakterisasi protease dilakukan pada isolat terpilih, yaitu:

Enterobacter sp. galur NU5 dan Aeromonas

sp. galur NU8. Galur NU5 menghasilkan metaloprotease yang optimum pada suhu 50º C, pH 7, dan aktivitasnya meningkat dengan penambahan Co2+. Galur NU8 juga menghasilkan metaloprotease dengan aktivitas optimum pada suhu 70º C, pH 7, dan aktivitasnya meningkat dengan penambahan K+. A. hydrophila yang berfungsi sebagai pembanding dan bersifat patogen menghasilkan protease yang aktivitasnya lebih rendah daripada galur NU5 dan galur NU8 pada suhu 70°C, pH 8. Penambahan EDTA tidak mempengaruhi aktivitas proteasenya.

DAFTAR PUSTAKA

Allan BJ, Stevenson RMW. 1981. Extracellular virulence factor of

Aeromonas hydrophila in fish infections. Can J Microbiol 27: 1114-1122.

Ariana, Mubarik NR, Prawasti TS. 2003. Produksi dan karakterisasi protease

Citrobacer sp. galur BKL-1 dari

saluran pencernaan ikan kerapu Lumpur (Epinephelus tauvina). Biosfera 20: 75-84.

Artika W. 2005. Produksi dan karakterisasi dari isolat bakteri BKL-1 dan BKU-31 hasil pengendapan ammonium sulfat [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive

method for the quantitation of microgram quantitaties of protein in utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72: 248-254.

Brojo M. 1999. Kariotip dan pola protein ikan mujair (Oreochromis mossambicus (Peters) Trewavas) dan ikan nila (Oreochromis niloticus

(Linnaeus) Trewavas). J Ilmu Perair Perik Indones IV 2: 19-33.

Bollag DM, Edelstein SJ. 1991. Protein Methods. New York: Wiley-Liss. Chabot DJ & Thune RL. 1991. Proteases of

the Aeromonas hydrophila complex: identification, characterization and relation to virulence in channel catfish, Ictalurus punctatus

(Rafinesque). J Fish Diseases 14: 171-183.

Cipriano RC, Bullock GL, Pyle SW. 2001.

Aeromonas hydrophila and motile aeromonad septicaemias of fish. Washington, D.C.. Rev: Cipriano RC. 1984. Fish disease leflet 68. http://www.lsc.usgs.gov/FHB/leaflets /FHB68.pdf [12 Agustus 2004]. Eijsink VGH et al.. 1993. Structural

determinants of the thermostability of thermolysin-like Bacillus neutral protease. Di dalam: van den Tweel WJJ, Harder A, Buitelaar RM, editor.

Proceeding of an International Symposium: Stability and Stabilization of Enzymes. Maastricht, 22-25 Nov 1992. Maastricht: Elsevier Science. hlm. 91-99.

Eijsink VGH, Veltman OR, Aukema W, Vriend G, Venema G. 1995. Structural determinants of the stability of thermolysin-like proteinases. Structural Biol 2: 374-379.

Fitri SGS, Mubarik NR, Prawasti TS. 2005. Produksi dan karakterisasi protease ekstraseluler Bacillus sp. galur BKU 10 dari saluran pencernaan

Epinephelus tauvina. J Mikrobiol Indones 10: 9-13.

Hammond JBW, Kruger NJ. 1988. The Bradford Method for Protein Quantitation. Di dalam: Walker JM, editor. Methods in Molecular Biology New Protein Techniques. Volume ke-3. Clifton: Human Pr. hlm. 25-32. Holt JK, Kreig NR, Sneath PHA, Staley JT,

(18)

Janice LDM, Felix CR. 2002. Characterization of a protease produced by Trichoderma harzianum

isolate which controls cocoa plant witches’ broom disease. BMC Biochem 3:3.

Kubo M, Murayama K, Seto K, Imanaka T. 1988. Higly thermostable neutral protease from Bacillus stearothermophilus. J Ferment Technol 66: 13-17.

Kusumawardhani GN. 2004. Karakterisasi protease ekstraseluler isolate H2 asal tanah pembuangan limbah kopra Sumatera Barat [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.

Lagler KF, Bardach JE, Miller RR, Passino DRM. 1977. Ichthyology. Ed ke-2. New York: John Wiley & Sons. Lehninger A. 1982. Dasar-Dasar Biokimia.

Thenawijdaja M, penerjemah; Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari:

Principles of Biochemisrty.

Muriarty DJW. 1999. Disease control in shrimp aquaculture with probiotic bacteria. http://www.medical-papers. com/bacteria+vibrio+species+aquacul ture+antibiotics.html. [20 Okt 2005]. Nur I. 2004. Ketahanan benih ikan nila

GIFT Oreochromis niloticus dari hasil induk yang diberi vaksin buatan

Streptococcus iniae [disertasi]. Bogor: Program Pasca Sarjana, Institut Pertanian Bogor.

Pelczar MJ Jr, Chan ECS. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Volume ke-1. Hadioetomo RS, Imas T, Tjitrosomo SS, Angka SL, penerjemah; Jakarta: UI Pr. Terjemahan dari: Elements of Microbiology.

Rao MB, Tangsale AM, Ghasge MS, Deshpande VV. 1998. Molecular and biotechnological aspects of microbial protease. Microb Mol Biol Rev 62: 597-635.

Rhichardson T, Hyslop DG. 1985. Enzyme. Di dalam: Fenema OR, editor. Food Chemistry. New York: Marcel Dekker. hlm. 371-476.

Secades P, Guijarro JA. 1999. Purification and characterization of an extracellular protease from the fish pathogen Yersinia ruckeri and effect of culture condition on production.

Appl Environ Microbiol 65: 3969-3975.

Snieszko SF, Axelrod. 1971. Disease of Fishes. London: T. H. P. Publication. Stanbury PF, Whitaker A. 1984. Principles

of Fermentation Technology. Oxford: Pagamon Pr.

Sukma P. 2003. Produksi dan karakterisasi protease Bacillus sp. galur BBU-32 asal saluran pencernaan

Parastromateus niger [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.

[UT] Universitas Terbuka. 2004. Biologi Ikan Air Tawar. http://www.ut.ac.id/olsupp/

LUHT4453/biologi.htm [7 Oktober 2004].

Verschuere L, Rombaut G, Sorgelos P, Verstraete W. 2000. Probiotic bacteria as biological control agents in aquaculture. Microb Mol Biol Rev: 655-671.

Wahyuntari B. 2005. Stabilitas protease logam netral mikrob mirip termolisin terhadap panas [ulas balik]. J Mikrobiol Indones 10: 5-8.

Walter H-E. 1984. Proteinases (proteins as substrates). Method with haemoglobin, casein and azocoll as substrate. Di dalam Bergmeyer J, Graβl M, editor. Methods of Enzymatic Analysis. Edisi ke-3. Weinheim: Verlag Chemie. hlm 270-278.

Ward OP. 1983. Proteinases. Di dalam Fogarty MW, editor. Microbial and Enzyme Technology. New York: Applied Science Publishing. hlm. 251-305.

(19)

(20)

Lampiran 1 Taksonomi ikan nila galur GIFT (Oreochromis niloticus (Linnaeus) Trewavas) dan ciri-cirinya

Nama Indonesia: Ikan Nila galur GIFT

Kedudukan taksonomi:

Kelas : Osteichthyes Ordo : Perciformes Subordo : Percoidei Famili : Serranidae Genus : Oreochromis

Spesies : Oreochromis niloticus (Linnaeus) Trewavas

Deskripsi (ciri-ciri):

Ikan air tawar; herbivora; berwarna hitam, badan berbentuk kompres agak membulat; telur dierami oleh induk betina; jenis kelamin mulai dapat dibedakan pada panjang total badan 8-11.9 cm, bentuk alat genital ikan jantan menonjol sedangkan betinanya membulat; dagu sampai dengan sisik di bawah sirip perut ikan jantan berwarna hitam sedangkan betinanya putih atau kuning; telur dierami oleh jantan (Lagler et al. 1977; Brojo 1999).

Lampiran 2 Metode pengujian aktivitas protease (Walter 1984)

Pereaksi Blanko (µl) Standar (µl) Sampel (µl) Penyangga Tris-HCl (0.05 M) pH 7

Substrat kasein (1 %) Ekstrak kasar enzim Akuades steril

Tirosin standar (5 mM)

500 500 - 100

-

500 500 - - 100

500 500 100 - - diinkubasi pada suhu optimum selama 10 menit

Asam trikloroasetat (10 %) Akuades steril

Ekstrak kasar enzim

1000 - 100

1000 100

- diinkubasi pada suhu 20º C selama 10 menit

kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 5 menit Filtrat

Na2CO3 (0.5 M) Folin Ciocalteu (1:2)

750 2500

500

750 2500

500

750 2500

500 didiamkan selama 15 menit kemudian diukur

(21)

Aktivitas protease dihitung dengan rumus:

A sampel – A blanko

UA = x P x 1/T A standar – A blanko

Keterangan:

UA : jumlah enzim yang dapat menghasilkan 1 mikromol produk tirosin per menit (U/ml) A sampel : nilai absorbansi sampel

A standar : nilai absorbansi standar A blanko : nilai absorbansi blanko P : faktor pengenceran T : waktu inkubasi

Lampiran 3 Metode pengukuran kadar protein mikroasai (Hammond et al. 1988)

Komposisi pereaksi Bradford (Bradford 1976) lima kali terdiri atas:

Coomasie brilliant blue G-250

Ethanol 95% Asam ortofosfat 85% Akuades

25 mg 12.5 ml 25 ml 212.5 ml

Sebelum digunakan untuk mengukur kadar protein, pereaksi diencerkan dengan akuades (perbandingan 1:4) dan larutan BSA 1 mg/ml diencerkan dengan akuades (perbandingan 1:9). Kurva standar dibuat dengan menambahkan sebanyak 4 ml pereaksi Bradford ke dalam 0.4 ml larutan BSA (bovine serum albumin) dengan konsentrasi 0.00 mg/ml – 0.10 mg/ml. Selanjutnya campuran tersebut diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang dan absorbansinya dibaca pada panjang gelombang 595 nm. Sedangkan blanko dibuat dengan mencampurkan 0.1 ml akuades dengan 0.5 ml pereaksi Bradford, kemudian dikocok dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 595 nm.

Sampel yang akan diukur kadar proteinnya diperlakukan sama. Sebanyak 4 ml pereaksi Bradford ditambahkan ke dalam 0.4 ml sampel dan diinkubasi pada suhu ruang selama 10 menit. Selanjutnya absorbansi dibaca pada panjang gelombang 595 nm. Perhitungan kadar protein berdasarkan kurva standar yang diperoleh.

Konsentrasi BSA (mg/ml) BSA (ml) Akuades (ml) 0.00

0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.10

0.00 0.04 0.08 0.12 0.16 0.20 0.24 0.28 0.32 0.36 0.40

(22)

Lampiran 4 Ciri-ciri morfologi dan indeks proteolitik (IP) isolat yang berasal dari saluran pencernaan ikan nila galur GIFT

Warna dan Penampakan Koloni Kode

Isolat

Ô koloni

(mm)

Ô zona

(mm) IP NA SSA EMBA Gram dan Penataan Sel

NL1 NL2 NL3 NL4 NL5

NL6

NL7

NL8

NL9 NL10 NL11

NL12

NL13

NL14

NL15

7 7 5.5

6 3.5

7.5

7

7.5

4.5 3.5 9.5

11

12

10

7.5

11.5 7 7 10.5

9.5

5

6

9

3 6.5 1.5

3

4

2.5

1.64 1.00 1.27 1.75 2.71

0.67

0.86

1.20

0.67 1.86 0.16

0.27

0.25

0.40

0.33

Putih susu, rata Putih keruh, rata Putih kekuningan, rata Putih kekuningan, rata Putih kekuningan (sedikit orange), rata

Tengah putih kekuningan, tepi transparan

bergelombang menjalar Tengah putih keruh, tepi transparan bergelombang menjalar

Putih keruh, bergelombang

Putih keruh, rata Putih kekuningan, rata Tengah putih keruh, tepi transparan bergelombang menjalar

Tengah putih agak transparan, tepi transparan bergelombang menjalar Transparan kekuningan, bergelombang

Putih transparan, bergelombang

Tengah putih keruh, tepi transparan bergelombang menjalar

- Merah muda

- - -

-

- - Krem

-

Krem

Merah muda, tengah gelap Merah muda

Merah muda Merah muda Merah muda

Ungu

-

Merah muda Merah muda

Merah muda, tengah gelap

Abu-abu kecoklatan jika kena cahaya

Merah, bulat bergerombol Merah, bulat bergerombol Merah, bulat membentuk rantai Merah, batang pendek

Merah, batang pendek bergerombol

Merah, batang pendak

Merah, batang pendek membentuk rantai

Ungu, batang panjang bergerombol

Merah, batang pendek Merah, batang pendek Merah, bulat bergerombol

Merah, batang pendek

Merah, bulat kecil bergerombol

(23)

Lanjutan Lampiran 4

Warna dan Penampakan Koloni Kode

Isolat

Ô koloni

(mm)

Ô _zona

(mm) IP NA EMBA SSA Gram dan Penataan Sel

NL16

NL17

NL18

NU1 NU2 NU3

NU4

NU5

NU6 NU7

NU8 NU9

NU10 NU11 NU12

NU13

2.5

8.5

14

4 4.5 3.5

3.5

2

4.5 6.5

5 4

4 4.5

4

5.5

8.5

1

1.5

7 8.5 9.5

9.5

9

3.5 4.5

5.5 2

2 6.5

3

8.5

3.40

0.12

0.11

1.75 1.89 2.71

2.71

4.50

0.78 0.69

1.10 0.50

0.50 1.44 0.75

1.55

Putih keruh, rata

Putih transparan, bergelombang menjalar Tengah putih kekuningan, tepi transparan

bergelombang menjalar Putih transparan, rata Putih keruh, rata Putih keruh, rata

Putih keruh, rata

Putih kekuningan, rata

Putih keruh, rata

Tengah putih kekuningan, tepi transparan

bergelombang menjalar Putih susu agak krem, rata Putih susu agak krem, rata

Putih agak kekuningan, rata Putih keruh, rata

Putih keruh, bergelombang

Putih kekuningan, rata

-

Krem

- - -

-

Krem

- Krem

- -

- Krem Krem

-

Ungu

Merah muda Merah muda Merah muda

Merah muda

Abu-abu kecoklatan jika kena cahaya

Ungu

Ungu Ungu

Ungu

Merah muda, tengah gelap Merah muda, tengah gelap

Merah, batang pendek membentuk rantai Merah-bulat, ungu-bulat

Merah-bulat, ungu-batang

Merah, batang pendek Merah, bulat bergerombol Merah, batang pendek bergerombol

Merah, batang pendek membentuk rantai Merah, bulat bergerombol

Merah, batang pendek

Merah, bulat membentuk rantai

Merah, bulat membentuk rantai Merah, batang pendek

membentuk rantai

Merah, bulat membentuk rantai Merah, bulat membentuk rantai Merah, batang pendek

membentuk rantai Merah-bulat, ungu-batang

Keterangan:

(24)

Lampiran 5 Pertumbuhan dan aktivitas spesifik protease Enterobacter sp. galur NU5 selama 24 jam pada suhu ruang (25-27º C)

Jam Aktivitas protease (U/mg) Log sel 0

3 6 9 12 15 18 21 24

0 0.039 0.063 0.115 0.109 0.114 0.099 0.113 0.121

7.842 7.859 8.021 8.206 8.348 8.559 8.731 8.768 8.768

Lampiran 6 Pertumbuhan dan aktivitas spesifik protease Aeromonas sp. galur NU8 selama 27 jam pada suhu ruang (25-27º C)

Jam Aktivitas protease (U/mg) Log sel 0

3 6 9 12 15 18 21 24 27

0 0.005 0.016 0.022

0 0.012 0.043 0.103 0.267 0.267

9.675 9.675 9.675 9.908 10.102 10.202 10.338 10.535 10.558 10.558

Lampiran 7 Aktivitas spesifik protease Aeromonas hydrophila, Aeromonas sp. galur NU8, dan Enterobacter sp. galur NU5 pada berbagai suhu

Aktivitas spesifik (U/mg) Suhu (º C) Aeromonas

hydrophila

Aeromonas sp. galur NU8

Enterobacter sp. galur NU5 30

40 50 60 70 80

0.008 0 0.005

0 0.008 0.008

0.177 0.403 0.935 1.258 1.274 0.371

0.048 0.065 0.081 0.048 0.032 0.032

Lampiran 8 Aktivitas protease Aeromonas hydrophila, Aeromonas sp. galur NU8, dan

Enterobacter sp. galur NU5 pada berbagai pH

Aktivitas spesifik (U/mg)

pH Aeromonas

hydrophila

6 7 8 9

0.002 0.004 0 0.007 0.004

0.145 0.419 0.548 0.387 0.468

(25)

Lampiran 9 Aktivitas protease Aeromonas sp. galur NU8, Enterobacter sp. galur NU5, dan Aeromonas hydrophila pada berbagai senyawa

Aktivitas spesifik (U/mg) Kation Aeromonas

hydrophila

Enterobacter sp. galur NU5 EDTA

Na+ K+ Mg2+

Cu2+ Co2+ Ca2+ Zn2+ Kontrol

0.009 0.010 0.013 0.006 0.168

0 0.003 0.014 0.009

0.177 1.258 1.274 0.742 0.065 0.177 0.419 0.016 1.258

0.016 0.081 0.048 0.081 0.145 0.225 0.145 0.065 0.065

Lampiran 10 Kestabilan aktivitas protease Aeromonas sp. galur NU8, Enterobacter sp. galur NU5, dan Aeromonas hydrophila pada suhu optimumnya masing-masing

Aktivitas spesifik (U/mg) Waktu inkubasi

(menit) Aeromonas

hydrophila

30 60 90 120

0.003 0.015 0.008 0.016 0.016

1.355 0.081 0.032 0.016 0.048

0.081 0.016 0.016 0.016 0.016

Lampiran 11 Kestabilan aktivitas protease Aeromonas sp. galur NU8, Enterobacter sp. galur NU5, dan Aeromonas hydrophila terhadap pH

Aktivitas spesifik (U/mg)

pH Aeromonas

hydrophila

6 7 8 9

0.033 0.065 0.089 0.114 0.041

1.161 1.516 1.597 1.532 1.613

(26)

ISOLASI BAKTERI PROTEOLITIK

Oleh:

Irma Fatimah

G34101026

DEPARTEMEN BIOLOGI

(27)

ABSTRAK

IRMA FATIMAH.

Isolasi Bakteri Proteolitik dari Pencernaan Ikan Nila Galur GIFT

(

Oreochromis

niloticus

(Linnaeus) Trewavas) dan Karakterisasi Protease

Ekstraselulernya

.

Dibimbing oleh NISA RACHMANIA MUBARIK dan DINAMELLA WAHJUNINGRUM.

Bakteri proteolitik yang berhasil diisolasi dari pencernaan ikan nila GIFT (Genetic Improvement of Farm Tilapias) berjumlah 31 isolat, namun hanya dua isolat yang dikarakterisasi protease ekstraselulernya dan diidentifikasi sebagaiAeromonas sp. galur NU8 danEnterobacter

sp. galur NU5. Aeromonas hydrophila yang bersifat patogen digunakan sebagai pembanding. Protease yang dihasilkan olehAeromonassp. galur NU8 merupakan metaloprotease dengan suhu optimum 70°C dan pH optimum 7, aktivitas protease sedikit meningkat dengan penambahan 5 mM K+, dan aktivitas protease menurun dengan penambahan 5 mM EDTA. Aktivitas protease

Aeromonassp. galur NU8 tidak stabil jika diinkubasi selama 120 menit pada suhu optimumnya, namun stabil pada setiap perlakuan pH setelah diinkubasi selama 1 jam pada suhu 4ºC. Protease yang dihasilkan oleh Enterobacter sp. galur NU5 merupakan metaloprotease dengan suhu optimum 50°C dan pH optimum 7, aktivitas protease meningkat dengan penambahan 5 mM Co2+, dan aktivitas protease menurun dengan penambahan 5 mM EDTA. Aktivitas protease

Enterobactersp. galur NU5 tidak stabil jika diinkubasi selama 120 menit pada suhu optimumnya, namun stabil pada setiap perlakuan pH setelah diinkubasi selama 1 jam pada suhu 4ºC. A. hydrophila yang bersifat patogen sebagai pembanding menghasilkan protease dengan suhu optimum 70°C dan pH optimum 8, aktivitas protease meningkat dengan penambahan 5 mM Cu2+, dan penambahan 5 mM EDTA tidak mempengaruhi aktivitas proteasenya. Aktivitas protease A. hydrophilacenderung stabil jika diinkubasi selama 120 menit pada suhu optimumnya dan stabil juga pada setiap perlakuan pH setelah diinkubasi selama 1 jam pada suhu 4ºC. Aeromonas sp. galur NU8 mempunyai aktivitas spesifik protease yang lebih tinggi dibandingkan dengan A. hydrophilayang patogen danEnterobactersp. galur NU5.

ABSTRACT

IRMA FATIMAH.

Isolation of Proteolytic Bacteria from Digestive Tract of Tilapias

Strain GIFT (

Oreochromis niloticus

(Linnaeus) Trewavas) and Characterization

of Its Extracellular Protease

. Supervised by NISA RACHMANIA MUBARIK dan DINAMELLA WAHJUNINGRUM.

At least 31 isolates of proteolytic bacteria were isolated from digestive tract of Tilapias strain GIFT (Genetic Improvement of Farm Tilapias), but only 2 isolates that can be used for the protease characterization. The result showed that both of them areAeromonassp. strain NU8 and

(28)