IRMA FATIMAH. Isolation of Proteolytic Bacteria from Digestive Tract of Tilapias Strain GIFT (Oreochromis niloticus (Linnaeus) Trewavas) and Characterization
BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan dari bulan Januari sampai Juni 2005 di Laboratorium Mikrobiologi FMIPA, IPB.
Bahan
Aeromonas hydrophila patogen koleksi dari Laboratorium Kesehatan Ikan, Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan-IPB. Sebanyak dua sampel ikan nila GIFT didapat dari Loka Riset Perikanan Air Tawar (Loriskanwar) Sukamandi Subang, Jawa Barat dalam keadaan hidup. Sampel saluran pencernaan ikan nila galur GIFT (O. niloticus) dewasa diambil dari 2 bagian, yaitu: lambung
dan usus sepanjang 0-3 cm dari lambung.
Metode Penelitian
Pengambilan Sampel dan Isolasi Bakteri
Ikan dibedah untuk diambil bagian saluran pencernaannya secara aseptik dan dalam keadaan dingin (menggunakan es). Saluran pencernaan ikan dipilah berdasarkan bagiannya, yaitu: lambung dan usus sepanjang 0-3 cm dari lambung. Kemudian masing-masing dimasukkan ke dalam 50 ml media kaldu nutrien (NB [Difco]; komposisi per liter: bakto ekstrak sapi 3 g dan bakto pepton 5 g) yang mengandung susu skim 0.5 %. Setelah itu, sampel diinkubasi pada suhu 25-27º C selama ± 48 jam sambil dikocok 140 rpm di atas mesin pengocok (Lab line, USA).
Penapisan Bakteri Penghasil Protease
Sebanyak satu ose suspensi bakteri digores kuadran pada media agar-agar nutrien yang mengandung susu skim (NAS) 0.5% dan diinkubasi pada suhu 25-27º C selama ± 24 jam. Koloni yang tumbuh membentuk zona bening diisolasi dan diinokulasikan ke media NAS 0.5 % dengan gores kuadran, serta diinkubasi pada suhu 25-27º C selama ± 24 jam. Setelah mendapatkan koloni tunggal, dipilih beberapa isolat yang memiliki Indeks Proteolitik (IP) terbesar dan morfologi koloni yang berbeda untuk diidentifikasi dan diamati produksi dan karakteristik proteasenya. IP merupakan nisbah antara diameter zona bening dengan diameter koloni. Isolat yang telah murni disimpan di dalam gliserol pada suhu -20º C. Peremajaan isolat secara rutin dilakukan pada media NAS 0.5 %.
Identifikasi Isolat
Isolat terpilih yang diseleksi berdasarkan indeks proteolitiknya. Identifikasi tahap awal meliputi pewarnaan Gram, pertumbuhan isolat pada media
Salmonella-Shigella agar (SSA) dan eosin methylene-blue agar (EMBA). Identifikasi sampai genus berdasarkan Bergey’s of Determinative Bacteriology (Holt et al. 1994).
Pertumbuhan dan Kurva Aktivitas Protease
Sebanyak 2 ose suspensi bakteri diinokulasi ke dalam 50 ml kaldu nutrien yang mengandung susu skim (NBS) 0.5 %
mikrob, serta mempunyai peranan penting dalam metabolisme dan regulasi dalam sel (Ward 1983). Enzim ekstraseluler disekresikan ke luar sel dan mendegradasi senyawa polimer menjadi senyawa yang lebih sederhana yang mudah larut dan diserap melalui dinding sel. Enzim ekstraseluler banyak digunakan dalam industri, karena dihasilkan dalam jumlah besar dan metode ekstraksi cukup mudah (Stanbury & Whitaker 1984).
Protease terdiri atas empat subkelompok berdasarkan mekanisme katalitik enzim, yaitu: protease serin, protease sistein, protease asam, dan protease logam atau metaloprotease (Rao et al. 1998). Contoh metaloprotease yang diaktifkan oleh ion magnesium dan kalsium ialah berasal dari
Citrobacter sp. galur BKL-1 yang diisolasi dari bagian lambung ikan kerapu lumpur (Ariana et al. 2003). Contoh protease serin adalah protease yang berasal dari Bacillus
sp. galur BKU-10 (Fitri et al. 2005). Protease serin atau protease yang memiliki gugus serin pada sisi aktifnya dapat juga dihasilkan oleh A. hydrophila dan P. aeruginosa (Rao et al. 1998). Protease serin dihambat oleh senyawa diisopropil fluorofosfat (DFP) atau fenilmetilsulfonil fluorida (PMSF) (Bollag & Edelstein 1991). Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan isolat proteolitik yang berasal dari saluran pencernaan ikan nila GIFT dan melakukan karakterisasi enzim protease dari isolat yang terpilih. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi untuk jenis protease bakteri lainnya dari saluran pencernaan ikan air tawar.
BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan dari bulan Januari sampai Juni 2005 di Laboratorium Mikrobiologi FMIPA, IPB.
Bahan
Aeromonas hydrophila patogen koleksi dari Laboratorium Kesehatan Ikan, Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan-IPB. Sebanyak dua sampel ikan nila GIFT didapat dari Loka Riset Perikanan Air Tawar (Loriskanwar) Sukamandi Subang, Jawa Barat dalam keadaan hidup. Sampel saluran pencernaan ikan nila galur GIFT (O. niloticus) dewasa diambil dari 2 bagian, yaitu: lambung
dan usus sepanjang 0-3 cm dari lambung.
Metode Penelitian
Pengambilan Sampel dan Isolasi Bakteri
Ikan dibedah untuk diambil bagian saluran pencernaannya secara aseptik dan dalam keadaan dingin (menggunakan es). Saluran pencernaan ikan dipilah berdasarkan bagiannya, yaitu: lambung dan usus sepanjang 0-3 cm dari lambung. Kemudian masing-masing dimasukkan ke dalam 50 ml media kaldu nutrien (NB [Difco]; komposisi per liter: bakto ekstrak sapi 3 g dan bakto pepton 5 g) yang mengandung susu skim 0.5 %. Setelah itu, sampel diinkubasi pada suhu 25-27º C selama ± 48 jam sambil dikocok 140 rpm di atas mesin pengocok (Lab line, USA).
Penapisan Bakteri Penghasil Protease
Sebanyak satu ose suspensi bakteri digores kuadran pada media agar-agar nutrien yang mengandung susu skim (NAS) 0.5% dan diinkubasi pada suhu 25-27º C selama ± 24 jam. Koloni yang tumbuh membentuk zona bening diisolasi dan diinokulasikan ke media NAS 0.5 % dengan gores kuadran, serta diinkubasi pada suhu 25-27º C selama ± 24 jam. Setelah mendapatkan koloni tunggal, dipilih beberapa isolat yang memiliki Indeks Proteolitik (IP) terbesar dan morfologi koloni yang berbeda untuk diidentifikasi dan diamati produksi dan karakteristik proteasenya. IP merupakan nisbah antara diameter zona bening dengan diameter koloni. Isolat yang telah murni disimpan di dalam gliserol pada suhu -20º C. Peremajaan isolat secara rutin dilakukan pada media NAS 0.5 %.
Identifikasi Isolat
Isolat terpilih yang diseleksi berdasarkan indeks proteolitiknya. Identifikasi tahap awal meliputi pewarnaan Gram, pertumbuhan isolat pada media
Salmonella-Shigella agar (SSA) dan eosin methylene-blue agar (EMBA). Identifikasi sampai genus berdasarkan Bergey’s of Determinative Bacteriology (Holt et al. 1994).
Pertumbuhan dan Kurva Aktivitas Protease
Sebanyak 2 ose suspensi bakteri diinokulasi ke dalam 50 ml kaldu nutrien yang mengandung susu skim (NBS) 0.5 %
dan diinkubasi selama 6 jam untuk
Enterobacter sp. galur NU5 pada suhu ruang. Kemudian sebanyak 109 sel/ml dimasukkan ke dalam 200 ml media produksi protease. Sedangkan untuk A. hydrophila dan Aeromonas sp. galur NU8 diinkubasi selama 4 jam pada suhu ruang. Kemudian sebanyak 108 sel/ml dimasukkan ke dalam 200 ml NBS 0.5%. Pembuatan kurva turbiditas pertumbuhan dilakukan dengan cara mengukur absorbansi suspensi biakan pada panjang gelombang 640 nm setiap selang waktu 3 jam selama 24 jam.
Cara mendapatkan ekstrak kasar enzim dengan melakukan sentrifugasi (Jouan, Perancis) suspensi bakteri pada kecepatan 8400 xg selama 5 menit. Aktivitas protease diukur dengan metode Walter (1984) yang dimodifikasi pada suhu 37º C dan pH 8.
Pengujian Aktivitas Protease dan Pengukuran Kadar Protein
Aktivitas protease diukur dengan metode Walter (1984) yang dimodifikasi. Sebanyak 0.5 ml larutan kasein 1 % direaksikan dengan 0.5 ml bufer tris HCl 0.05 M pH 8 dan 0.1 ml ekstrak kasar enzim, kemudian diinkubasi dalam penangas air pada suhu 37º C. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 1 ml larutan asam trikloroasetat (TCA) 10 % (b/v) dan diinkubasi di dalam lemari es (20º C) selama 10 menit. Hasil reaksi disentrifugasi pada kecepatan 8400 xg selama 5 menit. Sebanyak 0.75 ml filtrat ditambahkan dengan 2.5 ml Na2CO3 0.5 M dan 0.5 ml Folin Ciocalteu (1:2). Supernatan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 578 nm (Spectronic 20) dengan menggunakan L-tirosin sebagai standar. Satu unit aktivitas protease setara dengan 1µmol tirosin yang dihasilkan per menit pada kondisi pengukuran (Lampiran 2).
Kadar protein sampel diukur dengan metode Bradford (1976) yang dimodifikasi oleh Hammond et al. (1988) untuk mikroasai. Sebanyak 4 ml larutan Bradford dimasukkan ke dalam tabung yang telah berisi 0.4 ml enzim. Selanjutnya dikocok kuat dengan menggunakan vortex dan diinkubasi selama 15 menit. Absorbansi larutan diukur pada panjang gelombang 595
nm. Bovine serum albumin (BSA)
digunakan sebagai standar dengan konsentrasi 0-0.1 mg/ml (Lampiran 3). Kadar protein sampel ditentukan dari persamaan regresi kurva standar. Aktivitas
spesifik adalah aktivitas protease per miligram protein.
Karakterisasi Protease
Karakterisasi bertujuan untuk menentukan suhu dan pH optimum aktivitas enzim, ketahanan terhadap panas dan pH, serta pengaruh penambahan senyawa kation dan penghambat.
Penentuan pH Optimum. Penentuan
pH optimum dilakukan dengan cara mengukur aktivitas protease pada berbagai pH. Larutan bufer yang digunakan bufer sitrat 0.05 M (pH 5 dan 6) dan tris-HCl 0.05 M (pH 7, 8, dan 9).
Penentuan Suhu Optimum. Penentuan
suhu optimum dilakukan dengan cara mengukur aktivitas protease pada berbagai suhu inkubasi, yaitu: pada kisaran 30º C dan 80º C dengan selang 10º C.
Pengaruh Penambahan Senyawa
Penghambat dan Kation. Ekstrak kasar
enzim direaksikan dengan etilena diamina tetra asetat (EDTA) dan berbagai kation monovalen (Na+ dan K+) dan kation bivalen (Ca2+, Mg2+, Co2+, Cu2+, dan Zn2+) yang masing-masing berasal dari garam NaCl, KCl, CaCl2.2H2O, MgCl2.6H2O, CoCl2, CuCl2, dan ZnCl2, dengan konsentrasi akhir kation pada eaksi enzim masing-masing 5 mM. Campuran diinkubasi pada suhu dan pH optimum selama 10 menit.
Pengujian Ketahanan Enzim
terhadap Panas dan pH. Kestabilan enzim
terhadap panas diukur dengan menginkubasi ekstrak kasar enzim tanpa substrat pada suhu optimum selama 120 menit, kemudian aktivitas enzim diukur setiap 30 menit pada suhu dan pH optimumnya. Sedangkan untuk kestabilan pH diketahui dengan menginkubasi ekstrak kasar enzim pada suhu 4º C di dalam lemari es selama 1 jam. Enzim diencerkan dengan bufer pH 5-9 (perbandingan 1:1), kemudian aktivitas enzim kemudian diukur pada suhu dan pH optimum.
HASIL
Isolasi Bakteri Penghasil Protease
Mikrob yang dapat diisolasi dari lambung dan usus sepanjang 0-3 cm dari lambung ikan nila GIFT berjumlah 31 isolat (Lampiran 4).
dan diinkubasi selama 6 jam untuk
Enterobacter sp. galur NU5 pada suhu ruang. Kemudian sebanyak 109 sel/ml dimasukkan ke dalam 200 ml media produksi protease. Sedangkan untuk A. hydrophila dan Aeromonas sp. galur NU8 diinkubasi selama 4 jam pada suhu ruang. Kemudian sebanyak 108 sel/ml dimasukkan ke dalam 200 ml NBS 0.5%. Pembuatan kurva turbiditas pertumbuhan dilakukan dengan cara mengukur absorbansi suspensi biakan pada panjang gelombang 640 nm setiap selang waktu 3 jam selama 24 jam.
Cara mendapatkan ekstrak kasar enzim dengan melakukan sentrifugasi (Jouan, Perancis) suspensi bakteri pada kecepatan 8400 xg selama 5 menit. Aktivitas protease diukur dengan metode Walter (1984) yang dimodifikasi pada suhu 37º C dan pH 8.
Pengujian Aktivitas Protease dan Pengukuran Kadar Protein
Aktivitas protease diukur dengan metode Walter (1984) yang dimodifikasi. Sebanyak 0.5 ml larutan kasein 1 % direaksikan dengan 0.5 ml bufer tris HCl 0.05 M pH 8 dan 0.1 ml ekstrak kasar enzim, kemudian diinkubasi dalam penangas air pada suhu 37º C. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 1 ml larutan asam trikloroasetat (TCA) 10 % (b/v) dan diinkubasi di dalam lemari es (20º C) selama 10 menit. Hasil reaksi disentrifugasi pada kecepatan 8400 xg selama 5 menit. Sebanyak 0.75 ml filtrat ditambahkan dengan 2.5 ml Na2CO3 0.5 M dan 0.5 ml Folin Ciocalteu (1:2). Supernatan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 578 nm (Spectronic 20) dengan menggunakan L-tirosin sebagai standar. Satu unit aktivitas protease setara dengan 1µmol tirosin yang dihasilkan per menit pada kondisi pengukuran (Lampiran 2).
Kadar protein sampel diukur dengan metode Bradford (1976) yang dimodifikasi oleh Hammond et al. (1988) untuk mikroasai. Sebanyak 4 ml larutan Bradford dimasukkan ke dalam tabung yang telah berisi 0.4 ml enzim. Selanjutnya dikocok kuat dengan menggunakan vortex dan diinkubasi selama 15 menit. Absorbansi larutan diukur pada panjang gelombang 595
nm. Bovine serum albumin (BSA)
digunakan sebagai standar dengan konsentrasi 0-0.1 mg/ml (Lampiran 3). Kadar protein sampel ditentukan dari persamaan regresi kurva standar. Aktivitas
spesifik adalah aktivitas protease per miligram protein.
Karakterisasi Protease
Karakterisasi bertujuan untuk menentukan suhu dan pH optimum aktivitas enzim, ketahanan terhadap panas dan pH, serta pengaruh penambahan senyawa kation dan penghambat.
Penentuan pH Optimum. Penentuan
pH optimum dilakukan dengan cara mengukur aktivitas protease pada berbagai pH. Larutan bufer yang digunakan bufer sitrat 0.05 M (pH 5 dan 6) dan tris-HCl 0.05 M (pH 7, 8, dan 9).
Penentuan Suhu Optimum. Penentuan
suhu optimum dilakukan dengan cara mengukur aktivitas protease pada berbagai suhu inkubasi, yaitu: pada kisaran 30º C dan 80º C dengan selang 10º C.
Pengaruh Penambahan Senyawa
Penghambat dan Kation. Ekstrak kasar
enzim direaksikan dengan etilena diamina tetra asetat (EDTA) dan berbagai kation monovalen (Na+ dan K+) dan kation bivalen (Ca2+, Mg2+, Co2+, Cu2+, dan Zn2+) yang masing-masing berasal dari garam NaCl, KCl, CaCl2.2H2O, MgCl2.6H2O, CoCl2, CuCl2, dan ZnCl2, dengan konsentrasi akhir kation pada eaksi enzim masing-masing 5 mM. Campuran diinkubasi pada suhu dan pH optimum selama 10 menit.
Pengujian Ketahanan Enzim
terhadap Panas dan pH. Kestabilan enzim
terhadap panas diukur dengan menginkubasi ekstrak kasar enzim tanpa substrat pada suhu optimum selama 120 menit, kemudian aktivitas enzim diukur setiap 30 menit pada suhu dan pH optimumnya. Sedangkan untuk kestabilan pH diketahui dengan menginkubasi ekstrak kasar enzim pada suhu 4º C di dalam lemari es selama 1 jam. Enzim diencerkan dengan bufer pH 5-9 (perbandingan 1:1), kemudian aktivitas enzim kemudian diukur pada suhu dan pH optimum.
HASIL
Isolasi Bakteri Penghasil Protease
Mikrob yang dapat diisolasi dari lambung dan usus sepanjang 0-3 cm dari lambung ikan nila GIFT berjumlah 31 isolat (Lampiran 4).
Isolat ditumbuhkan pada media EMBA dan SSA bertujuan untuk melihat kemampuannya mereduksi laktosa. Isolat yang dapat mereduksi laktosa tumbuh pada media EMBA dan tidak pada media SSA. Media EMBA dan SSA dapat pula digunakan untuk membedakan sifat gram bakteri. Bakteri gram positif tidak dapat mereduksi laktosa, sehingga tidak dapat hidup pada media EMBA.
Identifikasi Isolat
Hanya dua isolat yang digunakan untuk diidentifikasi dan diamati proteasenya, yaitu: isolat NU5 dan isolat NU8. Kedua isolat menghasilkan zona bening media NAS 0.5% (Gambar 1, Lampiran 4). Hasil identifikasi menunjukkan bahwa kedua isolat adalah
Enterobacter sp. galur NU5 dan Aeromonas
sp. galur NU8 (Tabel 1).
Tabel 1 Ciri-ciri morfologi dan fisiologi isolat NU8 dan NU5 yang berumur 24 jam
Ciri-ciri Isolat NU8 Isolat NU5 Bentuk sel Pewarnaan gram Fermentasi karbohidrat Pembentukan gas Merah metil Voges-Proskauer Oksidase Indol Nitrit Hidrolisis urea Hidrolisis pati Sitrat simmons Motilitas Sifat Indeks proteolitik (IP) Batang pendek - + + + + + + + - + + Motil Anaerob fakultatif 1.10 Batang pendek - + + + + - - + + - + Motil Aerob obligat 4.50
Pertumbuhan dan Kurva Aktivitas Protease
Pertumbuhan sel pada media NBS 0.1% menunjukkan bahwa galur NU5 memasuki fase stasioner pada jam ke-18 dan memiliki aktivitas spesifik protease tertinggi pada jam ke-24, yaitu: 0.121 U/mg dengan kadar protein 0.066 mg/ml (Gambar 2, Lampiran 5). Galur NU8 mengalami fase stasioner pada jam ke-21 dan aktivitas spesifik protease tertinggi tercapai pada jam ke-24, yaitu: 0.267 U/mg dengan kadar protein 0.060 mg/ml (Gambar 3, Lampiran 6). 7.2 7.4 7.6 7.8 8 8.2 8.4 8.6 8.8 9 0 3 6 9 12 15 18 21 24
W a ktu inkub a si (ja m )
L o g s e l 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 A k ti v it as sp e si fi p ro tease ( U /m g )
P e rtum buhan s el A k tivitas s pes ifik proteas e
9.2 9.4 9.6 9.8 10 10.2 10.4 10.6 10.8 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27
W aktu inkubasi (jam )
Lo g se l 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 A kt iv ita s sp es ifi k pr ot eas e ( U /m g)
P ertum buhan sel A ktivitas spesifik protease
Karakterisasi Protease
Suhu optimum galur NU8 ialah 70º C dengan aktivitas protease sebesar 0.079 U/mg (Gambar 4, Lampiran 7) dan pH optimumnya 7 dengan aktivitas protease sebesar 0.548 U/mg (Gambar 5, Lampiran 8). Sedangkan suhu optimum galur NU5 50º C dengan aktivitas protease sebesar 0.005 U/mg (Gambar 4, Lampiran 7) dan pH Gambar 2 Pertumbuhan dan kurva aktivitas spesifik protease Enterobacter sp. galur NU5 selama 24 jam pada suhu ruang (25-27º C).
Gambar 3 Pertumbuhan dan kurva aktivitas spesifik protease Aeromonas sp. galur NU8 selama 27 jam pada suhu ruang (25-27º C). Gambar 1 Pembentukkan zona bening:
A. Enterobacter sp. galur NU5, B. Aeromonas sp. galur NU8, dan C. A. hydrophila pada cawan agar nutrien
A
B
optimumnya 7 dengan aktivitas protease sebesar 0.005 U/mg (Gambar 5, Lampiran 8).
Penambahan kation K+ dengan konsentrasi akhir 5 mM menaikkan sedikit aktivitas protease galur NU8 dari 1.258 U/mg menjadi 1.274 U/mg (1.27%), tetapi penambahan kation Na+ dengan konsentrasi akhir 5 mM tidak berpengaruh terhadap aktivitas protease galur NU8. Penambahan kation Mg2+, Cu2+, Ca2+, Co2+, dan Zn2+ dengan konsentrasi akhir 5 mM menurunkan aktivitas protease galur NU8. Aktivitas protease galur NU5 menurun oleh penambahan kation K+ sebesar 35.4%. Penambahan kation Na+, Mg2+, Cu2+, Ca2+, dan Co2+ meningkatkan aktivitas protease galur ini (Gambar 6, Lampiran 9). Kenaikan aktivitas protease terbesar dengan penambahan kation Co2+, yaitu: dari 0.065 U/mg menjadi 0.225 U/mg (71.1%).
Penambahan senyawa pengkelat logam EDTA dengan konsentrasi akhir 5 mM sangat menurunkan aktivitas protease galur NU8 sebesar 85.9%, sedangkan galur NU5 turun aktivitas proteasenya sebesar 75.4%.
Protease galur NU5 yang diinkubasi pada suhu 50°C selama 30 menit pertama mengalami penurunan sebesar 80%, sedangkan protease galur NU8 mengalami penurunan sebesar 94%. Protease kedua galur menunjukkan penurunan aktivitas selama 120 menit inkubasi pada suhu optimumnya masing-masing dengan aktivitas tersisa kurang dari 20% dibandingkan awal inkubasi (Gambar 7, Lampiran 10). Aktivitas protease kedua galur relatif menunjukkan kestabilan terhadap pH 5-9 setelah diinkubasi selama 1 jam pada suhu 4º C (Gambar 8, Lampiran 11).
Aeromonas hydrophila yang digunakan sebagai pembanding mempunyai suhu optimum 70ºC dengan aktivitas protease sebesar 0.008 U/mg (Gambar 4, Lampiran 7) dan pH optimum 8 dengan aktivitas protease sebesar 0.007 U/mg (Gambar 5, Lampiran 8). Penambahan EDTA tidak berpengaruh terhadap aktivitas protease A. hydrophila, namun aktivitas meningkat dengan penambahan Cu2+ sebesar 94.6% (Gambar 6, Lampiran 9). Aktivitas protease A. hydrophila relatif stabil pada kisaran pH 5-9 setelah diinkubasi selama 1 jam pada suhu 4º C (Gambar 8, Lampiran 11), namun aktivitas mengalami kenaikan sebesar 433.3% setelah diinkubasi pada suhu
optimumnya selama 120 menit (Gambar 7, Lampiran 10). 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 30 40 50 60 70 80 S uhu (0C ) A PS A . h yd ro ph ila d an E nt er ob ac te r sp . gal ur N U 5 ( U /m g) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 A PS A er om on as sp . ga lu r N U 8 ( U /m g)
A erom onas hydrophila E nterobacter sp. galur NU5 A erom onas sp. galur NU8
0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 5 6 7 8 9 p H A SP A . h yd rop hil a d an E nt er oba ct er s p. ga lu r NU 5 (U /m g) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 A SP A er om on as s p. ga lu r N U 8 (U /m g)
A erom onas hy drophila E nterobac ter s p. galur NU 5 A erom onas s p. galur N U 8
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 E D TA Na K Mg Cu Co Ca Zn kont rol Kation A SP A . h yd rop hi la d an E nt er obac te r sp . gal ur NU 5 (U /m g) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 A SP A er om on as sp . gal ur NU 8 (U /m g)
Aerom onas hydrophila Enterobacter sp. galur NU5 Aerom onas sp. galur NU8
Gambar 4 Aktivitas protease A. hydrophila, Aeromonas sp. galur NU8, dan Enterobacter sp. galur NU5 pada berbagai suhu (APS= aktivitas spesifik protease).
Gambar 5 Aktivitas protease A. hydrophila, Aeromonas sp.galur NU8,dan Enterobactersp. galur NU5 pada berbagai pH
Gambar 6 Aktivitas protease Aeromonas sp. galur NU8, Enterobacter sp. galur NU5, dan A. hydrophila pada berbagai senyawa
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0 30 60 90 120
W ak tu ink ubas i (me nit)
A P S A . h yd ro ph il a d an E nt er oba ct er s p. g al ur NU 5 (U /m g) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 A P S A er om on as s p. ga lu r NU 8 (U /m g)
A erom onas hy drophila E nterobac ter s p. galur NU5 A erom onas s p. galur NU8
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 5 6 7 8 9 p H A SP A . h yd ro ph ila d an E nt er ob ac te r sp . NU 5 (U /m g) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 A SP A er om on as sp . gal ur N U8 ( U /m g)
Aerom onas hydrophila Enterobacter sp. galur NU5 Aerom onas sp. galur NU8
PEMBAHASAN
Tiga puluh satu isolat yang diperoleh tidak digunakan seluruhnya, namun hanya dua isolat. Enterobacter sp. galur NU5 dipilih karena isolat ini menghasilkan zona bening dengan IP terbesar (4.5), sedangkan
Aeromonas sp. galur NU8 membentuk zona bening dengan IP yang lebih kecil (1.1). Perbedaan IP terjadi karena kemampuan difusi protease pada media NAS 0.5% untuk setiap isolat tidak sama. Isolat yang mempunyai IP besar merupakan isolat yang menghasilkan protease dengan kemampuan difusi lebih besar dibandingkan dengan isolat lain. Oleh karena itu, IP yang besar tidak dapat mencerminkan aktivitas protease yang besar pula. Aeromonas sp. galur NU8 mempunyai aktivitas protease jauh lebih
besar, yaitu: 0.267 U/mg dibandingkan
Enterobacter sp. galur NU5, yaitu: 0.121 U/mg dengan waktu inkubasi dan kadar protein yang sama, yaitu: 24 jam dan 0.066 mg/ml.
Aktivitas protease Enterobacter sp. galur NU5 tertinggi sebelum memasuki fase stasioner terdapat pada jam ke-9 sebesar 0.115 U/mg yaitu ketika sel dalam fase pertumbuhan eksponensial. Protease yang dihasilkan sebagian besar digunakan untuk kebutuhan pertumbuhan dan metabolisme sel.
Pada jam ke-24 Enterobacter sp. galur NU5 sudah masuk fase stasioner dan menghasilkan aktivitas proteolitik tertinggi. Pada fase ini sel mengeluarkan metabolit yang sebagian besar digunakan untuk mempertahankan diri (Pelczar & Chan 1986). Protease yang dihasilkan lebih banyak dan difungsikan untuk bersifat antagonis dengan organisme lain (Moriarty 1999). Umumnya protease jenis netral dan alkali diproduksi pada akhir fase pertumbuhan eksponensial dan stasioner, seperti yang dihasilkan oleh Bacillus sp. galur BBU-32 (Sukma 2003) dan B. stearothermophillus (Kubo et al. 1988).
Aeromonas sp. galur NU8 yang
diperoleh dari ikan sehat dibandingkan dengan Aeromonas hydrophila patogen dalam hal protease ekstraselulernya. Hal ini bertujuan untuk melihat adakah perbedaan ciri-ciri biokimia aktivitas protease yang dihasilkan.
Aktivitas spesifik protease A. hydrophila sebesar 0.007 U/mg jauh lebih rendah dibandingkan dengan aktivitas spesifik Aeromonas sp. galur NU8 sebesar 0.548 U/mg yang diukur pada suhu 70º C, pH 7. Protease yang dihasilkan oleh A. hydrophila aktivitasnya tidak berubah pada penambahan pengkelat logam EDTA. Protease yang dihasilkan oleh Aeromonas
sp. galur NU8 merupakan metaloprotease, karena aktivitas protease spesifiknya mengalami penurunan sebesar 85.9% pada saat dilakukan penambahan EDTA. Menurut hasil penelitian Chabot & Thune (1991), kompleks A. hydrophila yang digunakan dalam penelitiannya menghasilkan protease jenis P1 yang tidak dihambat oleh EDTA, tetapi meningkat dengan penambahan Mg2+. Kation Cu2+ dapat meningkatkan aktivitas protease yang dihasilkan oleh
Aeromonas hydrophila sebesar 94.6%, tetapi sebaliknya bagi aktivitas protease yang turun sebesar 94.8%. Di sisi lain, kation Na+ dan Gambar 7 Kestabilan aktivitas protease
Aeromonas sp. galur NU8,
Enterobacter sp. galur NU5, dan
A. hydrophila pada suhu
optimumnya masing-masing.
Gambar 8 Kestabilan aktivitas protease Aeromonas sp. galur NU8,
Enterobacter sp. galur NU5, dan
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0 30 60 90 120
W ak tu ink ubas i (me nit)
A P S A . h yd ro ph il a d an E nt er oba ct er s p. g al ur NU 5 (U /m g) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 A P S A er om on as s p. ga lu r NU 8 (U /m g)
A erom onas hy drophila E nterobac ter s p. galur NU5 A erom onas s p. galur NU8
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 5 6 7 8 9 p H A SP A . h yd ro ph