PRODUKSI OLIGOSAKARIDA DARI UMBI KENTANG
HITAM MELALUI HIDROLISIS EKSTRAK KASAR α
-AMILASE ASAL
Brevibacterium sp.
SATRYO WIBISONO
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Produksi Oligosakarida dari Umbi Kentang Hitam Melalui Hidrolisis Ekstrak Kasar α-Amilase asal Brevibacterium sp. adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
ABSTRAK
SATRYO WIBISONO. Produksi Oligosakarida dari Umbi Kentang Hitam Melalui Hidrolisis Ekstrak Kasar α-Amilase asal Brevibacterium sp. . Dibimbing oleh HASIM dan NANIK RAHMANI.
Oligosakarida merupakan makromolekul karbohidrat yang tersusun atas 2-10 residu monosakarida yang memiliki manfaat di bidang pangan dan kesehatan. Salah satu cara memproduksi oligosakarida yakni dengan hidrolisis enzimatis dari pati. Kentang hitam memiliki kandungan karbohidrat tinggi, terutama pati sebesar 83%. Aktivitas enzim amilase yang diperoleh dari hasil ekstraksi kasar sebesar 1.708 U/ml. Derajat polimerisasi kentang hitam diperoleh sebesar 10. Reaksi hidrolisis pati kentang hitam dengan menggunakan enzim tersebut menghasilkan 3 spot pada analisis KLT dan 3 puncak pada KCKT. Komponen oligosakarida pati kentang hitam hasil analisis KLT menunjukkan bahwa terdapat senyawa maltotriosa dan maltosa dengan fase gerak n-butanol:asam asetat:air (2:1:1). Hasil analisis KCKT menunjukkan kandungan senyawa glukosa, maltosa, dan maltotriosa dalam sampel dengan fase gerak asetonitril:air (75:25). Sampel segar menunjukkan senyawa glukosa sebanyak 1,60% (b/v), maltosa 0,36% (b/v), dan maltotriosa 0,46% (b/v). Adapun sampel hasil pemekatan freeze dry terdiri dari senyawa glukosa sebanyak 4,20% (b/v), maltosa 0,21% (b/v), dan maltotriosa 0,30% (b/v).
Kata kunci: kentang hitam, oligosakarida, HPLC, enzim amilase, Brevibacterium sp.
ABSTRACT
SATRYO WIBISONO. Production of Oligosaccharides from Black Potatoes
Through Hydolisis α-Amylase from Brevibacterium sp. Supervised by HASIM and NANIK RAHMANI.
Oligosaccharides is a carbohydrate macromolecule composed of 2-10 monosaccharide residues that have benefits in the field of food and health. One way to produce oligosaccharides with enzymatic hydrolisis of starch. Black potatoes have high carbohydrate content, especially starch by 83%. Activity of amylase enzyme from raw extraction have 1.708 U/ml. Degree of polymerization
of black potatoe’s starch is 10. Hydrolysis reaction of black potatoe’s starch with that enzyme gave 3 spots on TLC analysis with mobile phase n-buthanol:acetic acid:water purified (2:1:1). In HPLC analysis showed 3 main peaks that means consist of 3 compound with mobile phase acetonitrile:water (75:25). Fresh sample consist of glucose as many as 1,60% (b/v), maltose 0,36% (b/v), and maltotriose 0,46% (b/v). Freeze dried sample consist of glucose as many as 4,20% (b/v), maltose 0,21% (b/v), and maltotriose 0,30 % (b/v).
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
PRODUKSI OLIGOSAKARIDA dari UMBI KENTANG
HITAM MELALUI HIDROLISIS EKSTRAK KASAR α
-AMILASE ASAL
Brevibacterium sp.
SATRYO WIBISONO
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Judul Skripsi : Produksi Oligosakarida dari Umbi Kentang Hitam melalui Hidrolisis Ekstrak Kasar α-Amilase asal Brevibacterium sp.
Nama : Satryo Wibisono NIM : G84090035
Disetujui oleh
Dr. drh. Hasim, DEA Pembimbing I
Nanik Rahmani, M. Si Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr. Ir. I Made Artika, M.Sc. App Ketua Departemen
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Februari 2013 ini ialah produksi oligosakarida, dengan judul Produksi Oligosakarida dari Umbi Kentang Hitam melalui Hidrolisis Ekstrak Kasar α-Amilase asal Brevibacterium sp. Skripsi ini didanai oleh DIPA PN Puslit Biologi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI), Cibinong.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr. drh. Hasim, DEA selaku pembimbing utama dan Ibu Nanik Rahmani, M. Si selaku pembimbing kedua. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada ayah, ibu, serta seluruh keluarga, atas segala doa dan kasih sayangnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL vi
DAFTAR LAMPIRAN vi
PENDAHULUAN 1
METODE PENELITIAN 2
Bahan 2
Alat 2
Prosedur Penelitian 3
HASIL 5
Tepung Oligosakarida dari Umbi Kentang Hitam 5 Gula Total, Gula Pereduksi, dan Derajat Polimerisasi 6
Profil Oligosakarida 7
PEMBAHASAN 8
Tepung Oligosakarida dari Umbi Kentang Hitam 8 Gula Total, Gula Pereduksi, dan Derajat Polimerisasi 9
Profil Oligosakarida 10
SIMPULAN DAN SARAN 10
Simpulan 10
Saran 11
DAFTAR PUSTAKA 11
DAFTAR TABEL
1. Hasil analisis gulatotal dan gula reduksi oligosakarida hasil hidrolisis 6
2. Nilai Rf kromatogram TLC 7
3. Luas area dan konsentrasi kromatogram HPLC 8
DAFTAR LAMPIRAN
1. Aktivitas Enzim amilase 13
2. Perhitungan gula pereduksi dan gula total 14
3. Perhitungan HPLC 15
4. Kurva standar 16
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Oligosakarida didefinisikan sebagai komponen yang tersusun dari 2-10 monomer residu monosakarida (Ganzle & Follador 2012). Oligosakarida dapat ditemukan secara alami dalam berbagai bahan pangan, seperti biji-bijian, buah-buahan, sayur-sayuran, kacang-kacangan, serta umbi-umbian. Cadangan makanan tanaman umbi-umbian dibuat dalam bentuk polisakarida dengan sedikit campuran oligosakarida dan monosakarida. Polisakarida yang paling umum adalah pati yang merupakan polimer dari glukosa dalam bentuk amilosa dan amilopektin.
Manfaat oligosakarida telah banyak berkembang dalam bidang industri pangan maupun industri kimia. Lee, Kwon, Moon (2003) mengungkapkan bahwa oligosakarida memiliki manfaat sebagai pemanis, humektan, dan prebiotik. Oligosakarida memiliki manfaat sebagai pemanis karena memiliki tingkat kemanisan sebesar 0.3-0.6 kali dibanding sukrosa. Kemampuan oligosakarida sebagai humektan sendiri karena oligosakarida dapat menjaga kelembaban tanpa meningkatkan kandungan airnya (Patel & Goyal 2011). Rycroft et al (2001) mengemukakan bahwa oligosakarida dapat meningkatkan populasi bakteri baik di saluran cerna (sebagai prebiotik).
Meskipun oligosakarida memiliki banyak manfaat, oligosakarida memiliki harga yang sangat mahal. Sebagai contoh adalah maltosa. Perusahaan kimia, Sigma Aldrich, memproduksi dan menjual maltosa untuk standar analisis kimiawi dengan harga satu juta rupiah per gram sehingga perlu adanya inovasi untuk memproduksinya.
Inovasi-inovasi untuk memproduksi oligosakarida banyak dikembangkan, baik secara sintetis kimia, depolimerisasi secara fisika, maupun melalui hidrolisis secara enzimatis (Barreteau, Delattre, Michaud 2006). Sebagian besar industri memanfaatkan metode enzimatis untuk memproduksi oligosakarida karena dianggap lebih efektif dan efisien. Metode enzimatis ini memiliki keunggulan, yakni produk yang diinginkan lebih banyak dibanding dengan produk sampingnya, kinetika reaksi sangat mudah dikontrol sehingga apabila menginginkan hasil dalam skala besar karakteristik reaksi dapat diatur sesuai dengan jenis produk yang diinginkan, umumnya bekerja pada suhu rendah sehingga dapat menghemat energi dan menciptakan keamanan dalam lingkungan kerja, investasi peralatan lebih kecil dibanding metode fisika maupun kimia, serta tidak menghasilkan limbah yang berbahaya dan beracun (Findrik & Vasiæ-Raèki 2009). Salah satu bahan dasar untuk memproduksi oligosakarida secara enzimatis adalah pati yang
terdiri dari unit α-D-glukopiranosil yang terhubung dengan ikatan α
-1-4-glikosidik dan/atau ikatan α-1-6-glikosidik.
2
1992). Komponen utama polisakarida kentang hitam dapat dihidrolisis menjadi gula-gula sederhana dengan menggunakan enzim amilase (Winarno 2008).
Enzim amilase dapat diproduksi oleh mikroorganisme. Mikroorganisme yang digunakan biasanya diisolasi dari daratan. Pemanfaatan mikroorganisme dari lautan juga perlu dilakukan karena memiliki karakteristik tahan terhadap kandungan garam yang sangat tinggi. Salah satu mikroorganisme yang berasal dari laut adalah Brevibacterium sp. yang juga diketahui dapat memproduksi enzim amilase (Rahmani, Yopi, Andriani, Prima2011a).
Brevibacterium sp. memiliki bentuk sel batang dengan diameter koloni 0.6-1.2 x 1.5-6 m. Bakteri ini termasuk dalam bakteri Gram positif, aerob, tidak mampu bergerak serta termasuk dalam katalase positif. Dengan adanya substrat berupa pati, Brevibacterium sp. dapat menghasilkan enzim amilase secara ekstraseluler (Rahmani, Yopi, Andriani, Prima2011a).
Tujuan dari penelitian ini adalah melakukan hidrolisis pati kentang hitam
dengan menggunakan α-amilase dari Brevibacterium sp. dan menganalisis produknya dengan menggunakan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT). Adapun hipotesis dari penelitian ini adalah produk hidrolisis pati kentang hitam dapat menghasilkan senyawa maltosa, maltotriosa, dan maltotetraosa. Hasil dari penelitian ini diharapkan dapat mensubtitusi penggunaan bahan kimia standar analisis (oligosakarida standar analisis) komersial dengan produk hidrolisis dari pati yang berasal dari umbi lokal seperti kentang hitam.
METODE PENELITIAN
Bahan
Bahan utama yang digunakan sebagai substrat yaitu pati hasil ekstraksi kentang hitam. Kentang yang digunakan merupakan hasil kultur jaringan di Laboratorium Biak Sel dan Kultur Jaringan, Puslit Biologi, LIPI dengan kode 4/9. Sampel kentang hitam yang digunakan dalam kultur jaringan berasal dari daerah Sangian, Jawa Timur. Adapun bahan-bahan yang digunakan dalam pembuatan media peremajaan, pertumbuhan, dan produksi enzim amilase ekstrak kasar yaitu Artificial Sea Water (ASW), yeast extract (YE), pepton, pati komersial (Merck), akuades, agar, dan isolat Brevibacterium sp. yang merupakan koleksi bakteri laut di Laboratorium Biokatalis dan Fermentasi, Pusat penelitian Bioteknologi, LIPI Cibinong Bogor. Bahan-bahan lain yang digunakan untuk analisis kimia yaitu buffer sodium fosfat pH 6.6 (20 mM), pereaksi DNS (DNS, NaOH, Na-K tartrat), fenol 5% (b/v), H2SO4 pekat, n-butanol, asam asetat, α-difenilamin, aseton, asam
fosfat, dan anilin.
Alat
3 tabung, microtube Eppendorf, pipet mikro, sentrifus (Hitachi CT15RE), stopwatch, waterbath 100 ºC dan 80ºC, kuvet, spektrofotometer UV-Visible double beam (Hitachi U-3900H), plat TLC silica gel 60 F254 (Merck Art 20-20 cm), bejana
pengembang, autoklaf (Tomy High Pressure Steam Sterilizer ES-315), dan HPLC (Agilent Technology I200 Infinity Series).
Prosedur Penelitian
Produksi Enzim Amilase Ekstrak Kasar
Pembuatan media peremajaan dan kultur pertumbuhan
Brevibacterium sp (Rahmani, Yopi, Andriani, Prima 2011a). Bahan-bahan
penyusun media peremajaan dan kultur Brevibacterium sp. (pH 8) terdiri dari 38 g/L ASW, 2% pati komersial, 1.5% agar, 1 g/L yeast extract, dan 5 g/L pepton. Media tersebut disterilisasi pada suhu 121ºC selama 15 menit. Peremajaan bakteri dilakukan pada cawan Petri steril, sedangkan kultur pertumbuhan bakteri dilakukan pada media cair. Bahan-bahan yang digunakan pada media peremajaan dan kultur pertumbuhan bakteri hampir sama, hanya saja agar tidak ditambahkan pada media kultur pertumbuhan.
Peremajaan dan proses kultur Brevibacterium sp (Rahmani, Yopi, Andriani, Prima 2011a). Peremajaan Brevibacterium sp. dilakukan dengan menggoreskan isolat bakteri menggunakan jarum ose steril pada media padat yang telah disiapkan. Media padat tersebut mengandung komponen nutrisi dan sumber karbon bagi pertumbuhan bakteri. Sebelum melakukan penanaman, laminar tempat kerja disinari UV terlebih dahulu selama 15 menit untuk membunuh mikroorganisme yang tidak diinginkan sehingga dapat menurunkan resiko kontaminasi. Media yang telah ditanami isolat kemudian diinkubasi pada suhu 30ºC selama 3 hari. Prekultur dilakukan dengan memindahkan sebanyak 1 ose koloni tunggal ke dalam 20 ml media cair. dan kultur diperoleh dari memindahkan media prekultur ke media kultur 180 ml. Tujuan prekultur yaitu sebagai tahap adaptasi bakteri terhadap media pertumbuhan sebelum dilakukan kultur pada volume yang lebih besar yaitu 180 ml media cair. Prekultur diinkubasi dalam inkubator goyang 150 rpm selama 3 hari pada suhu 30ºC.
Preparasi enzim amilase ekstrak kasar (Rahmani, Yopi, Andriani, Prima 2011a). Amilase ekstrak kassar diperoleh dari ekstraksi kultur sel dengan cara sentrifugasi pada kecepatan relatif sentrifugal (RCF) 12000 rpm. Ekstraksi enzim amilase dipertahankan pada suhu dingin yaitu minimal 4ºC (Liu et al. 2011) untuk menjaga aktivitas enzim. Supernatan yang diperoleh merupakan amilase ekstrak kasar dengan karakteristik yaitu aktif pada pH 6.6 dalam buffer fosfat 0.2 M dan suhu 30ºC.
Analisis aktivitas amilase ekstrak kasar (Modifikasi Bernfeld 1955).
Aktivitas enzim amilase ditentukan dengan menggunakan metode DNS yang telah dimodifikasi dengan mereaksikan 0.5 ml enzim yang telah diencerkan dengan faktor pengenceran 10 dan 0.5 ml larutan pati 0.5% dalam buffer sodium fosfat 20 mM pH 6.6, kemudian diinkubasi selama 30 menit selama 30ºC. Reaksi dihentikan dengan merendam tabung reaksi berisi sampel dalam air mendidih 100ºC selama 20 menit. Gula pereduksi yang dibebaskan ditentukan dengan menggunakan metode metode DNS (Miller 1959). Warna yang terbentuk diukur
4
menjadi konsentrasi gula perekduksi (µg mL-1) menggunakan persamaan yang diperoleh dari kurva standar glukosa. Satu unit aktivitas amilase merupakan jumlah enzim yang mampu mengkatalisis perubahan 1 µmol substrat per menit pada kondisi tertentu (Winarno 2010).
Hidrolisis enzimatis pati kentang hitam kode 4/9.
Hidrolisis enzimatis pati kentang hitam kode 4/9 (Rohanah 2012).. Kondisi optimum hidrolisis yang diperoleh adalah perbandingan konsentrasi enzim dan substrat (1:5) dengan waktu inkubasi selama 4 jam. Substrat hasil preparasi dan enzim hasil preparasi dicampur dengan perbandingan konsentrasi enzim dan substrat 1:5 kemudian diinkubasi selama 4 jam. Aktivitas enzim dihentikan dengan cara memanaskan pada suhu 100ºC di air mendidih. Langkah selanjutnya adalah dilakukan sentrifugasi 12000 rpm. Pelet yang diperoleh kemudian dibuang. Supernatan yang diperoleh kemudian dianalisis gula pereduksi, gula total, derajat polimerisasi, dan TLC. Supernatan yang tidak dianalisis kemudian di freeze-drying untuk menghasilkan oligosakarida bentuk padatan.
Analisis Kimia
Analisis gula total (Modifikasi Dubois et al 1956). Larutan glukosa standar masing-masing sebanyak 0.5 ml dengan konsentrasi 50, 100, 150. 200 µg mL-1 dimasukkan ke dalam tabung reaksi, sampel hasil hidrolisis dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang lain. Sebanyak 0.5 ml larutan fenol 5% (b/v) dan 2.5 ml asam sulfat pekat ditambahkan ke dalam larutan standar dan sampel kemudian diinkubasi pada suhu 40ºC selama 20 menit. Setelah itu, absorbansi sampel diukur pada panjang gelombang 490 nm.
Analisis gula pereduksi (Modifikasi Miller 1959). Jumlah gula pereduksi yang terbentuk ditentukan dengan metode DNS yang telah dimodifikasi (Miller 1959). Sebanyak 0.5 ml larutan standar glukosa dengan konsentrasi 50, 100, 150, 200, 250, 500 µg mL-1 yang telah diencerkan dari 1000 µg mL-1 dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambah 0.75 ml pereaksi DNS. Perlakuan sama terhadap sampel hasil hidrolisis. Larutan standar dan sampel dimasukkan ke dalam watebath 100ºC selama 20 menit kemudian didiamkan sampai suhu mendekati suhu ruang. Pengukuran absorbansi pada panjang gelombang 540 nm.
Derajat polymerase (Apriyantono et al 1989). Derajat polimerase dihitung berdasarkan perbandingan antara gula total dan gula pereduksi.
Analisis profil oligosakarida
Kromatografi lapis tipis (Rahmani et al. 2013). Kromatografi lapis tipis digunakan secara kuantitatif untuk melihat jenis oligosakarida yang terbentuk. Analisis ini dilakukan pada plat silica gel 60 F254 (Merck art 20-20 cm) sebagai
5 ke dalam bejana pengembang berisi eluen (terdiri dari n-butanol:asam asetat:akuades 12:6:6) yang telah dijenuhkan selama 1 jam. Elusi dilakukan hingga batas garis akhir. Plat diangkat hingga eluen menguap semua pada suhu
kamar lalu disemprt dengan pewarna gula (0.5 gran α-difenilamin, 25 ml aseton, 2.5 ml asam fosfat, 0.5 ml anilin, pada labu Erlenmeyer 300 ml). Plat dikeringkan dalam oven 100ºC selama 15 menit hingga terbentuk spot. Setelah dingin diukur nilai Rf dari masing-masing komponen.
Analisis HPLC (Lee et al. 2003, Kandra et al. 2002). Oligosakarida hasil hidrolisis enzimatis dianalisis menggunakan HPLC. Detektor yang digunakan yaitu Refractive Index Detector (RID) dan kolom Zorbax SIL (Silica) dengan dilapisi 3-aminopropilsilen. Fase gerak yang digunakan adalah asetonitril dan akuades dengan rasio 75:25 (v/v) yang telah dihomogenisasi. Kecepatan alir dan suhu yang digunakan adalah 0.5 ml/menit dan 30ºC.
Pemekatan oligosakarida pati kentang hitam
Pemekatan produk oligosakarida dilakukan dengan metode freeze-dry di Pusat Bioteknologi PAU, IPB. Kondisi freeze-dry dilakukan pada suhu -50ᵒC,
tekanan vakum 10 Hg, serta waktu operasi 48 jam.
HASIL
Tepung Oligosakarida dari Umbi Kentang Hitam
Enzim α-amilase dihasilkan oleh bakteri Brevibacterium sp. menghasilkan 2 liter ekstrak berwarna kuning. Aktivitas enzim yang diperoleh melalui metode DNS sebesar 1.708 U mL-1. Enzim ditambahkan dalam suspensi pati kentang hitam dengan konsentrasi 2.5% (b/v) sesuai dengan kondisi optimum hidrolisis, yakni perbandingan enzim dengan substrat 1:5, konsentrasi pati kentang hitam 2.5%, waktu hidrolisis selama 4 jam, pH hidrolisis 6.6 serta dilakukan pada suhu 300C (Rohanah 2012). Penambahan enzim dilakukan setelah suspensi pati kentang hitam dalam kondisi suhu ruang setelah dipanaskan terlebih dahulu. Pemanasan yang dilakukan akan mengubah suspensi pati kentang hitam yang semula berwarna putih keruh menjadi kecoklatan.
6
Gambar 1 Oligosakarida cair
Gambar 2 Tepung oligosakarida hasil freeze-drying Gula Total, Gula Pereduksi, dan Derajat Polimerisasi
Oligosakarida tersebut di analisis gula pereduksi dengan menggunakan metode DNS, gula total dengan menggunakan fenol-asam sulfat, serta derajat polimerisasi dihitung berdasarkan perbandingan gula total dan gula pereduksi. Hasil analisis gula total dan gula reduksi dapat dilihat dalam Tabel 1. Kurva standar gula pereduksi dan gula total dapat dilihat pada Lampiran 4. Konsentrasi gula total yang diperoleh sebesar 20003.0 µg mL-1 dan konsentrasi gula reduksi yang diperoleh sebesar 2102.7 µg mL-1 sehingga derajat polimerisasi yang diperoleh sebesar 10.
Tabel 1 Hasil analisis gula total dan gula reduksi oligosakarida hasil hidrolisis
Analisis Konsentrasi (µg mL-1) Derajat Polimerisasi
Gula Total 20003.0
10
Gula Reduksi 2102.7
Profil Oligosakarida
7
Gambar 3 Kromatogram KLT Tabel 2 Nilai Rf kromatogram KLT
No. Sampel Jarak
Analisis dengan menggunakan KCKT dilakukan dalam 2 kondisi, yaitu kondisi pertama pengoperasian dengan waktu analisis 15 menit dan kondisi kedua pengoperasian dengan waktu analisis 40 menit. Hal ini bertujuan untuk mengetahui waktu optimum yang digunakan agar dapat memunculkan jumlah puncak kromatogram yang sama dengan spot yang diterlihat pada analisis KLT. Standar yang digunakan adalah glukosa+maltosa 5% (b/v) dan standar maltosa 5%. Standar diinjeksikan terlebih dahulu dan menghasilkan waktu retensi 7.847
Keterangan :
1-5 sampel freeze dry konsentrasi 1-5% 6 standar maltopentaosa
7 standar maltotriosa 8 standar glukosa
8
untuk standar glukosa serta 10.959 dan 11.240 untuk standar maltosa (Tabel 3). Baik sampel segar maupun sampel freeze dry menghasilkan 2 puncak (2 waktu retensi) pada waktu operasi 15 menit sedangkan pada waktu operasi 40 menit menunjukkan sampel segar memiliki jumlah waktu retensi sebanyak 5 (7.828, 11.265, 16.947, 26.099, dan 34.115) dan sampel freeze dry memiliki jumlah waktu retensi sebanyak 4 ( 7.481, 11.184, 16.864, dan 25.880). Kedua sampel diduga mengandung senyawa glukosa, maltosa, dan maltotriosa.
Tabel 3 Luas area dan konsentrasi pada kromatogram KCKT Tipe Sampel
Standar Maltosa 5 11.240 100.0000 Maltosa 5.0000
Sampel Segar (15
Tepung Oligosakarida dari Pati Kentang Hitam
Enzim amilase yang diperoleh sebanyak 2 liter berwarna kekuningan. Warna tersebut muncul karena media tumbuh bakteri Brevibacterium sp. yang mengandung yeast extract berwarna kuning. Yeast extract merupakan sumber nitrogen pada media tumbuh Brevibacterium sp.
Enzim kemudian diuji aktivitasnya dengan menggunakan metode DNS. Prinsipnya adalah DNS akan mengikat monosakarida yang berada dalam larutan sehingga menimbulkan warna kuning hingga kecoklatan. Warna tersebut dapat memberikan absorbansi pada 540 nm (Miller 1959). Standar glukosa digunakan karena produk akhir dari hidrolisis pati oleh enzim amilase adalah glukosa.
Aktivitas enzim yang terukur adalah 1.708 U mL-1. Aktivitas enzim yang diperoleh lebih kecil dari Rahmani et al. (2011a) yakni 2.85 U/ml. Hal ini dikarenakan bakteri yang digunakan merupakan hasil peremajaan dari isolat awal sehingga menurunkan kemampuan dalam memroduksi enzim amilase.
9 kentang hitam mulanya dilarutkan dalam akuades sehingga konsentrasinya 2.5%. Pati yang sudah dilarutkan tersebut, harus diberi perlakuan panas terlebih dahulu. Hal tersebut dikarenakan pati tidak larut dalam air dingin. Wang (2002) menjelaskan bahwa pati sangat tahan terhadap penetrasi, baik oleh air atau enzim hidrolitik karena adanya ikatan hidrogen dalam molekul yang sama serta antar molekulnya. Kedua ikatan tersebut dapat melemah ketika suhu suspensi pati dinaikkan. Pemanasan yang terlalu tinggi juga dapat merusak ikatan-ikatan antar molekul pati tersebut. Oleh karena itu, suspensi pati kentang hitam dipanaskan diatas pemanas elektrik dan dijaga suhunya hingga 80°C.
Gula Total, Gula Pereduksi, dan Derajat Polimerisasi
Jumlah gula pereduksi dan gula total perlu dihitung untuk mengetahui panjang polimer pati yang terkandung dalam kentang hitam. Baik gula pereduksi maupun gula total ditentukan dengan menggunakan teknk kolorimetri. Gula pereduksi ditentukan dengan menggunakan metode DNS. Metode ini hanya dapat mendeteksi satu gula pereduksi, misalnya glukosa. Glukosa memiliki gugus aldehida sehingga dapat dioksidasi oleh asam 3,5-dinitrosalisilat menjadi gugus karboksil dan menghasilkan asam 3-amino-5-salisilat pada kondisi basa pada panjang gelombang 450 nm. Gula total diukur dengan menggunakan metode fenol asam sulfat. Metode ini dapat mengukur dua molekul gula sederhana, oligosakarida dan turunannya yang menghasilkan warna jingga kekuningan dan dapat dibaca pada panjang gelombang 490 nm. Reaksi fenol dengan asam sulfat menghasilkan panas (reaksi eksoterm) (Bintang 2010). Konsentrasi gula pereduksi yang diperoleh sebesar 2102.738 µg mL-1 dan gula total diperoleh sebesar 20003.030 µg mL-1.
Derajat polimerisasi ditentukan dari nisbah konsentrasi gula total dan gula pereduksi. Nilai derajat polimerisasi yang dimiliki kentang hitam sebesar 10 artinya bahwa produk hidrolisis dari pati kentang hitam merupakan golongan senyawa oligosakarida. Nakakuki (2002) mengemukakan bahwa oligosakarida merupakan hasil hidrolisis dengan nilai DP sebesar 2-10. Secara umum, derajat polimerisasi menurun seiring bertambahnya waktu reaksi hidrolisis. Hal tersebut dikarenakan adanya pemutusan rantai monosakarida yang panjang menjadi lebih pendek seiring bertambahnya waktu reaksi. Salah satu contoh produk hidrolisis pati yang memiliki derajat polimeriasi yang kecil adalah oligosakarida yang berasal dari umbi tacca, yakni sebesar 2.7 dengan waktu hidrolisis selama 6 jam (Putri 2014).
Profil Oligosakarida
Sampel segar maupun hasil freeze dry, profil oligosakaridanya dianalisis menggunakan metode KLT dan KCKT. Analisis dilakukan untuk mengetahui komponen oligosakarida yang terdapat pada produk hidrolisis tersebut. Sampel freeze dry diencerkan menjadi 1-5%. Hal ini dilakukan untuk mengetahui pada konsentrasi berapa oligosakarida dapat terpisahkan dengan baik.
10
Sampel 1-5% yang merupakan hasil pemekatan freeze dry diketahui mengandung maltotriosa dan hanya sampel 1% saja yang mengandung maltosa. Hal ini berbeda dengan sampel sebelum pemekatan (sampel non freeze dry) yang diduga mengandung maltopentaosa dan maltotriosa. Keseluruhan sampel menunjukkan bahwa oligosakarida yang terdapat dalam supernatan tersebut yang paling banyak adalah maltotriosa. Hal ini seperti yang diungkapkan oleh Poliana dan MacCabe (2007) bahwa enzim α-amilase memotong ikatan glikosidik α-1.4 pada molekul pati dan menghasilkan produk maltosa, maltotriosa, dan glukosa.
Hasil dari KLT kemudian dilanjutkan dengan menggunakan KCKT. Masing-masing sampel dianalisis dengan waktu pengoperasian 15 menit dan 40 menit. Kromatogram sampel segar dengan waktu operasi 15 menit (Lampiran 5) menunjukkan 2 puncak (waktu retensi 7.610 dan 11.144). Waktu retensi 7.610 diduga sebagai senyawa glukosa dan 11.144 diduga sebaga maltosa. Gambar 10 merupakan kromatogram sampel segar dengan waktu operasi 40 menit menunjukkan 4 puncak (7.826, 11.265, 16.947, 26.099). Waktu retensi tersebut tidak sama dengan standar yang digunakan sehingga yang dapat terbaca hanya pada waktu retensi 11.265 yang diduga sebagai maltosa. Pada waktu pengoperasian ditambah terlihat bahwa kurva kromatogram beratambah, artinya jumlah jenis oligosakarida yang terdeteksi bertambah sehingga sesuai jumlahnya dengan jumlah spot pada TLC. Berbeda halnya dengan kromatogram sampel freeze dry dengan waktu pengoperasian yang sama. Baik sampel segar maupun sampel freeze dry menunjukkan jumlah kurva yang sama. Perbedaan diantara keduanya adalah tinggi puncak pada waktu operasi 15 menit, sampel freeze dry memiliki puncak lebih tinggi dari puncak sampel segar, dan waktu operasi 40 menit sampel freeze dry memiliki puncak lebih rendah dari sampel segar. Hal ini menunjukkan bahwa sampel freeze dry akan mengalami penurunan tinggi puncak apabila waktu operasi semakin lama.
Konsentrasi masing-masing sampel dapat dilihat pada Tabel 3. Masing-masing sampel menunjukkan adanya maltosa dan glukosa. Terlihat bahwa ketika waktu pengoperasian ditambah menjadi 40 menit, jumlah puncak bertambah. Sampel segar yang semula hanya memunculkan 2 puncak ketika ditambah waktu pengoperasiannya menjadi 5 puncak. Puncak yang terdapat pada sampel segar antara lain dengan waktu retensi 7.8428 glukosa, 11.265 maltosa, 16.947 maltotriosa (Rahmani et al. 2013).
Kedua kromatogram mendeteksi adanya senyawa glukosa yang tidak muncul pada spot KLT. Faktor-faktor yang mempengaruhi hal tersebut adalah bahwa detektor pada KCKT memiliki tingkat sensitifitas yang tinggi sehingga senyawa glukosa dapat terdeteksi. Selain itu, enzim yang digunakan merupakan amilase tipe alfa.
Enzim α-amilase (EC 3.2.1.1) atau yang biasa disebut 1,4–α-D-glukan
glukanohidrolase merupakan endoenzim yang memutus ikatan α-1,4 amilosa dan amilopektin dengan cepat pada larutan pati kental yang telah mengalami
11 menjadi glukosa (Winarno 2008).
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Ekstrak kasar α-amilase dari Brevibacterium sp memiliki aktivitas sebesar 1.708 U mL-1. Hasil analisis KLT maupun KCKT menunjukkan hasil yang sama yakni menunjukkan adanya senyawa maltosa dan maltotriosa. Kromatogram sampel segar menunjukkan adanya senyawa glukosa sebanyak 1,60% (b/v), maltosa 0,36% (b/v), dan maltotriosa 0,46% (b/v). Kromatogram freeze dry menunjukkan adanya senyawa glukosa sebanyak 4,20% (b/v), maltosa 0,21% (b/v), dan maltotriosa 0,30% (b/v).
Saran
`Pemisahan terhadap maltooligosakarida menjadi maltosa dan maltotriosa perlu dilakukan untuk memperoleh tingkat kemurnian yang tinggi. Selain itu, pengujian terhadap bakteri probiotik dan patogen pada sistem pencernaan perlu dilakukan untuk mengetahui kemampuan maltooligosakarida yang diperoleh sebagai sumber prebiotik.
DAFTAR PUSTAKA
Apriyantono A, Fardiaz, Puspitasari NL, Budiyanto S. 1989. Analisis Pangan. Bogor (ID) : PAU Pangan dan Gizi.
Barreteau H, Delattre C, Michaud P. 2006. Production of Oligosaccharides as Promising New Food Additive Generation. Food Technol. Biotechnol 44(3): 323-333.
Bintang M. 2010. BIOKIMIA Teknik Penelitian. Jakarta (ID) : Erlangga.
Direktorat Gizi Depkes RI. 1992. Daftar Komposisi Bahan Makanan. Jakarta (ID) : Bhratara
Dubois, Gilles KA, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F. 1956. Colorimetric method for determination of sugar and related substances. J Anal Chem 28:350-356.
Findrik Z, Vasiæ-Raèki D. 2009. Overview on Reactions with Multi-enzyme System. Chem Biochem Eng Q. 23 (4) 545-553.
Ganzle MG, Follador R. 2012. Metabolism of oligosaccharides and starch lactobacilli : a review. Kanada : University of Alberta.
12
Hizukuri S, Abe J, Hanashiro I. 2006. Starch : analytical aspect. Dalam : Eliasson(ed). Carbohydrates in Food Second Edition. Boca Raton : CRC Press, pp 305-390.
Kandra L, Gyemant G, Liptak A. 2002. Action pattern of α-amylases on modified maltooligosaccharides. J Biol 57(11):171-180.
Lee JW, Kwon TO, Moon IS. 2003. Adsorption of monosacharides, disacharides, and maltooligosacharides on activated carbon for separaton of maltopentose. J Bioetchnol Bioprocess Engineer 8 : 47-53.
Liu J, Zhang Z, Zhu H, Dang H, Lu J, Cui Z. 2011. Isolation and characterization
of α-amylase from marine Pseudomonas sp. K6-28-040. J Biotechnol. 10 (14) : 2733-2740.
Manning T, Gibson GR. 2004. Prebiotics : Best practice and research. J Clinical Gastroenterol. 28 (12):287-298.
Miller GL. 1959. Use of dinitrosalicyclic acid reagent for determination of reducing sugar. J Anal Chem. 31: 426-428.
Nakakuki T. 2002. Present status and future of functional oligosaccharide development in Japan. Pure Appl Chem. 74(7):1245-1251.
Patel S, Goyal A. 2011. Functional oligosaccharides : production, propertie, and application. J Microbiol Biotechnol 27 : 1119-1128.
Putri FH. 2014. Hidrolisis Pati Umbi Tacca Menggunakan α-Amilase dari Brevibacterium sp. untuk Menghasilkan Oligosakarida. [skripsi]. Bogor (ID) : Institut Pertanian Bogor.
Rackis JJ. 1989. Physiological Effects of Food Carbohydrates. Washington DC (USA) : American Chemical Society.
Rahmani N, Yopi, Indriani A, Awan. 2011. Karakteristik dan Pengembangan Karbohidrat dari Umbi Kentang Hitam (Coleus tuberosus Benth), Ubi Kayu (Manihot esculenta). [Laporan Teknis]. Bogor (ID) : Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia.
Rahmani N, Yopi, Andriani A, Prima A. 2011. Production and characterization of amylase enzyme from marine bacteria. Proceedings of the International Seminar on Chemistry for a Better Future, 24-25 November 2011, Jatinangor (ID).
Rahmani N, Rohanah, Sukarno, Andriani A, Yopi. 2013. Production of Maltooligosaccharides from Black Potatoes (Coleus tuberosus) Starch by
13 Rohanah. 2012. Hidrolisis Enzimatis Pati Kentang Hitam (Coleus tuberosus) Menggunakan Enzim Amilase dari Mikroba Laut (Brevibacterium sp). [Skripsi]. Bogor (ID) : Institut Pertanian Bogor.
Rohmayati T. 2013. Analisis Oligosakarida Hasil Hidrolisis Pati Kentang Hitam (Culeus tuberosus) oleh Enzim Amilase dari Brevibacterium sp. [Skripsi]. Bogor [ID] : Institut Pertanian Bogor.
Rycroft CE, MR Jones, GR Gibson, RA Rastall. 2001. A Comparative In Vitro Evaluation of The Fermentation Properties of Prebiotic Oligosaccharides. Journal of Applied Microbiology 91, 878-887.
Sanawati A. 2007. Produksi dan Karakterisasi Alpha-Amilase Saccharomycopsis fibuligera Rekombinan yang Diekspresikan dalam Pichia pastoris. [Tesis]. Bandung [ID] : Institut Teknologi Bandung.
Wang NS. 2002. Starch Hydrolysis by Amylase. (dalam) Septiani L. 2003. Karakterisasi tepung dan pati umbi uwi (Dioscorea alata) dan Gembili (D. esculenta) serta pengujian penerimaan α-amilase terhadap pati. [Skripsi] Bogor [ID] : Institut Pertanian Bogor.
14
Lampiran 1 Aktivitas enzim amilase Pengen
ceran U1 U2 U3
Rerata (R)
Kontrol
(K) R-K
Konsent rasi (µg mL-1)
Konsentr asi (mg/ml)
Aktivit as (Unit/
ml)
100x 0.576 0.552 0.511 0.546 0.480 0.066 46.111 0.046 1.708
Perhitungan
∑
y=0.003x-0.072
y= absorbansi (R-K), x=konsentrasi(µg mL-1) 0.066=0.003x-0.072
0.066-0.072=0.003x x = 46.111 µg mL-1
15 Lampiran 2 Perhitungan gula pereduksi dan gula total
Standar gula pereduksi
Persamaan kurva regresi : y=0.0029x-0.0322; R2 = 0.994 Absorbansi gula pereduksi sampel
Pengenceran Ulangan 1 Ulangan 2 Ulangan 3 Rerata Konsentrasi
(µg mL-1) konsentrasi sebenarnya = konsentrasi x faktor pengenceran
konsentrasi sebenarnya = 210.274 x 10 = 2102.738
Standar gula total
Persamaan kurva regresi linier : y=0.0096x-0.0125: R2=0.984 Absorbansi gula total sampel
Pengenceran Ulangan 1 Ulangan 2 Ulangan 3 Rerata Konsentrasi
16
konsentrasi = 50.008 µg mL-1
k.sebenarnya = konsentrasi x faktor pengenceran= 50.008 x 400 = 20003.030 µg mL-1
Perhitungan Derajat Polimerisasi
17
Standar Maltosa 5 11.240 100.0000 Maltosa 5.0000
Sampel Segar (15
Contoh Perhitungan sampel segar 15 menit dengan waktu retensi 7.610 menit
18
Lampiran 4 Kurva standar
Kurva standar glukosa untuk penentuan aktivitas enzim
19 Kurva standar glukosa untuk penentuan nilai gula total
-0,200 0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200
0 50 100 150
Ab
so
rb
an
si
Konsentrasi (µg mL-1)
Series1
18
Lampiran 5 Kromatogram HPLC Standar maltosa
Standar campuran glukosa dan maltosa
19 Sampel segar 40 menit waktu pengoperasian
Sampel freeze-dry 15 menit waktu pengoperasian
20
