STUDI MENGENAI MORFOLOGI DAN KOMPOSISI SEL TESTIKULAR IKAN GURAME Osphronemus gouramy Lac.
MAULUDDIN
SKRIPSI
PROGRAM STUDI TEKNOLOGI DAN MANAJEMEN AKUAKULTUR FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi yang berjudul :
STUDI MENGENAI MORFOLOGI DAN KOMPOSISI SEL TESTIKULAR IKAN GURAME Osphronemus gouramy Lac.
adalah benar merupakan karya sendiri dan belum digunakan dalam bentuk apapun
kepada perguruan tinggi manapun. Semua sumber data dan informasi yang berasal
atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain
telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian
akhir skripsi ini.
Bogor, Maret 2009
RINGKASAN
MAULUDDIN. Studi mengenai Morfologi dan Komposisi Sel Testikular Ikan Gurame Osphronemus gouramy Lac. Dibimbing oleh ALIMUDDIN dan MUHAMMAD ZAIRIN JUNIOR.
Ikan gurame membutuhkan waktu 2 – 3 tahun untuk mencapai matang gonad, sehingga memerlukan waktu relatif lama untuk memproduksi induk. Lamanya waktu memproduksi induk dapat menyebabkan kurangnya ketersediaan benih yang siap tebar. Saat ini, teknologi yang bisa digunakan untuk mempercepat kematangan gonad ikan gurame belum ada. Baru-baru ini, teknologi rekayasa reproduksi pada ikan telah dikembangkan, yaitu pengembangan induk surrogate
(induk semang). Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui morfologi dan proporsi komposisi sel spermatogonia ikan gurame dari berbagai ukuran.
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Juli – Desember 2008. Pembuatan preparat histologi dilakukan di Laboratorium Kesehatan Ikan, Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor (IPB). Dokumentasi hasil histologi dilakukan di Laboratorium Histologi, Departemen Anatomi Fisiologi dan Farmakologi, Fakultas Kedokteran Hewan, IPB. Disosiasi testis dan dokumentasinya dilaksanakan di Balai Besar Pengembangan Budidaya Air Tawar (BBPBAT) Sukabumi. Tahapan yang dilakukan dalam penelitian ini adalah pengamatan preparat histologi yang bertujuan untuk mengetahui perkembangan morfologi sel testikular dan disosiasi gonad yang berfungsi untuk menghitung komposisi sel testikular ikan gurame.
Secara keseluruhan nilai rata – rata berat gonad ikan gurame berkisar antara 0,0755 – 0,2517 g. Nilai rata – rata IKG ikan gurame berkisar antar 8,7025 x 10-3 – 9,5382 x 10-3%. Dari hasil pengamatan preparat histologis testis ikan gurame menunjukkan bahwa terdapat perbedaan fase spermatogenesis dan tipe sel – sel spermatogenik yang terdapat pada setiap kelas ikan gurame uji. Ikan gurame yang dikelompokkan ke dalam kelas ikan muda (800 – 1000 g), tipe sel – sel spermatogenik yang ada di dalam testisnya berbeda dengan ikan gurame yang dikelompokkan ke dalam kelas ikan dewasa (1100 – 1300 g) dan ikan yang matang gonad (2250 – 3200 g). Adapun pada ikan yang dikelompokkan ke dalam kelas ikan yang belum berkembang gonadnya (400 – 600 g) belum terlihat atau terdapat adanya gonad. Jumlah spermatogonia terbanyak terdapat pada ikan muda (348.000 sel), yang kemudian jumlahnya semakin menurun baik pada ikan dewasa (192.000 sel) maupun ikan yang matang gonad (116.000 sel). Proporsi spermatogonia tertinggi terdapat pada ikan muda, yaitu sebesar 80,56% dan yang terendah terdapat pada ikan yang matang gonad, yaitu sebesar 6,30%. Adapun sel testikular yang mempunyai diameter terpanjang secara berturut – turut adalah spermatogonia, spermatosit, dan spermatid.
STUDI MENGENAI MORFOLOGI DAN KOMPOSISI SEL TESTIKULAR IKAN GURAME Osphronemus gouramy Lac.
MAULUDDIN
SKRIPSI
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Perikanan Pada Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan
Institut Pertanian Bogor
PROGRAM STUDI TEKNOLOGI DAN MANAJEMEN AKUAKULTUR FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
Judul : STUDI MENGENAI MORFOLOGI DAN KOMPOSISI SEL TESTIKULAR IKAN GURAME Osphronemus gouramy Lac.
Nama : Mauluddin Nomor Pokok : C14104050
Menyetujui,
Pembimbing I Pembimbing II
Dr. Alimuddin Prof. Dr. M. Zairin Junior
NIP. 132 133 953 NIP. 131 578 846
Mengetahui,
Dekan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan
Prof. Dr. Ir. Indra Jaya, M.Sc NIP. 131 578 799
KATA PENGANTAR
Puji syukur atas kehadirat Allah SWT yang telah melimpahkan segala
rahmat, nikmat, dan karunia-Nya yang tidak dapat dibalas dengan apapun
sehingga skripsi yang berjudul “Studi mengenai Morfologi dan Komposisi Sel
Testikular Ikan Gurame Osphronemus gouramy Lac.” ini dapat diselesaikan oleh penulis.
Dalam kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih yang
setulus-tulusnya kepada :
1. Dr. Alimuddin selaku Pembimbing I dan Prof. Dr. Muhammad Zairin
Junior selaku Pembimbing II yang telah banyak memberikan bimbingan
dan masukan selama melakukan penelitian sampai dengan penyusunan
skripsi ini.
2. Sri Nuryati, M.Si selaku Dosen Penguji Tamu yang telah memberikan
banyak masukan dalam menyelesaikan skripsi ini.
3. Harton Arfah, M.Si selaku Pembimbing Akademik yang telah memberikan
bimbingan dan arahan selama studi.
4. Mama, Mama, Mama, dan Ayah serta seluruh keluarga besar atas kasih
sayang, doa, dan dukungan baik moril dan materi.
5. Pak Ranta, Pak Marjanta, Mba Yuli, Kang Asep, Kak Rahmat, Mba Anna,
Mba Lina, Kak Lina, Ibu Irma, Pak Aam, Pak Ade Sunarma BBPBAT
Sukabumi, dan Pak Adhi Winarno FKH IPB atas bantuan yang diberikan.
6. Lazuardi Yudha Anggoro, Deby Yuniasari, Radi Ihlas Albani, Arief Eko
Prasetiyo, Dwi Hany Yanti, dan Sendok yang telah “hadir dan men –
close” atas kebersamaan, kerjasama, dan dukungannya.
7. Teman – teman BDP 41, kakak dan adik kelas BDP, dan pihak – pihak
yang tidak bisa disebutkan satu persatu atas bantuan yang diberikan.
Penulis mengharapkan skripsi ini dapat bermanfaat kepada semua pihak
yang memerlukan.
Bogor, Maret 2009
DAFTAR RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta, 24 November 1986 oleh mama dan ayah
yang sangat dicintai. Pendidikan formal yang dilalui adalah SMAN 38 Jakarta.
Pada tahun 2004, penulis mendapat kesempatan untuk melanjutkan pendidikan
tinggi ke Intitut Pertanian Bogor di Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan pada
Program Studi Teknologi dan Manajemen Akuakultur melalui Jalur USMI
(Undangan Seleksi Masuk IPB).
Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah aktif dalam organisasi
Himpunan Mahasiswa Akuakultur (HIMAKUA) sebagai staf Departemen
Kewirausahawan periode 2005/2006 dan Pengembangan Sumber Daya Manusia
periode 2006/2007. Selain itu, Penulis juga aktif menjadi Asisten Mata Kuliah
Dasar-dasar Genetika Ikan dan Industri Perbenihan Ikan periode 2007/2008.
Untuk memperdalam wawasan di bidang budidaya perairan, penulis pernah
menjalani praktek kerja lapang di Balai Budidaya Laut Lombok, Nusa Tenggara
Barat.
DAFTAR ISI
3.2.1 Pengumpulan dan Penanganan Ikan Gurame ... 13
3.2.2 Penentuan IKG ... 13
4.1.2 Karakteristik Morfologi Sel Testikular ... 19
4.1.3 Komposisi dan Pengukuran Diameter Sel Testikular ... 21
DAFTAR TABEL
Halaman
1. Jumlah sel testikular per ekor ikan gurame dari berbagai kelas... 21
DAFTAR GAMBAR
Halaman 1. Ikan gurame Osphronemusgouramy Lac. ... 4 2. Ilustrasi berbagai jenis testis. A: testis tubular mamalia, B: testis tubular
anastomosing, C: testis lobular, T: Tubuli, I: Lumen, RT: Rete Testis,
AT: Anastomosing Tubular, MD: Main Longitudinal Testis Duct, dan
L: Lobuli. (Grier, 1983 dalam Takashima dan Hibiya, 1995) ... 7 3. Ilustrasi dua jenis testis lobular pada ikan teleostei. A: lobuli berlekuk
dan B: lobuli padat (Nagahama, 1983 dalam Takashima dan Hibiya, 1995) ... 8
4. Skema spermatogenesis ... 9
5. Gambaran histologis tetes ikan carp. 1: sel stem, 2: spermatogonia primer, 3: spermatogonia sekunder, 4: spermatosit primer,
5: spermatosit sekunder, 6: spermatid, dan 7: sel Sertoli
(Takashima dan Hibiya, 1995) ... 11
6. Gambaran histologis testis ikan white perch. : spermatogonia,
a: spermatosit, b: spermatid, dan c: spermatozoa (Blazer, 2002) ... 12
7. Grafik hubungan antara berat ikan dengan berat gonad... 18
8. Grafik hubungan antara berat ikan dengan IKG ... 19
9. Gambaran histologis testis ikan gurame dari berbagai kelas.
A: ikan muda, B: ikan dewasa, C: ikan matang gonad,
a: spermatogonia, b: spermatosit, c: spermatid, dan d: spermatozoa ... 20
10. Komposisi sel testikular ikan gurame dari berbagai kelas.
A: ikan muda, B: ikan dewasa, C: ikan matang gonad,
1: spermatogonia, 2: spermatosit, dan 3: spermatid ... 22
STUDI MENGENAI MORFOLOGI DAN KOMPOSISI SEL TESTIKULAR IKAN GURAME Osphronemus gouramy Lac.
MAULUDDIN
SKRIPSI
PROGRAM STUDI TEKNOLOGI DAN MANAJEMEN AKUAKULTUR FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi yang berjudul :
STUDI MENGENAI MORFOLOGI DAN KOMPOSISI SEL TESTIKULAR IKAN GURAME Osphronemus gouramy Lac.
adalah benar merupakan karya sendiri dan belum digunakan dalam bentuk apapun
kepada perguruan tinggi manapun. Semua sumber data dan informasi yang berasal
atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain
telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian
akhir skripsi ini.
Bogor, Maret 2009
RINGKASAN
MAULUDDIN. Studi mengenai Morfologi dan Komposisi Sel Testikular Ikan Gurame Osphronemus gouramy Lac. Dibimbing oleh ALIMUDDIN dan MUHAMMAD ZAIRIN JUNIOR.
Ikan gurame membutuhkan waktu 2 – 3 tahun untuk mencapai matang gonad, sehingga memerlukan waktu relatif lama untuk memproduksi induk. Lamanya waktu memproduksi induk dapat menyebabkan kurangnya ketersediaan benih yang siap tebar. Saat ini, teknologi yang bisa digunakan untuk mempercepat kematangan gonad ikan gurame belum ada. Baru-baru ini, teknologi rekayasa reproduksi pada ikan telah dikembangkan, yaitu pengembangan induk surrogate
(induk semang). Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui morfologi dan proporsi komposisi sel spermatogonia ikan gurame dari berbagai ukuran.
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Juli – Desember 2008. Pembuatan preparat histologi dilakukan di Laboratorium Kesehatan Ikan, Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor (IPB). Dokumentasi hasil histologi dilakukan di Laboratorium Histologi, Departemen Anatomi Fisiologi dan Farmakologi, Fakultas Kedokteran Hewan, IPB. Disosiasi testis dan dokumentasinya dilaksanakan di Balai Besar Pengembangan Budidaya Air Tawar (BBPBAT) Sukabumi. Tahapan yang dilakukan dalam penelitian ini adalah pengamatan preparat histologi yang bertujuan untuk mengetahui perkembangan morfologi sel testikular dan disosiasi gonad yang berfungsi untuk menghitung komposisi sel testikular ikan gurame.
Secara keseluruhan nilai rata – rata berat gonad ikan gurame berkisar antara 0,0755 – 0,2517 g. Nilai rata – rata IKG ikan gurame berkisar antar 8,7025 x 10-3 – 9,5382 x 10-3%. Dari hasil pengamatan preparat histologis testis ikan gurame menunjukkan bahwa terdapat perbedaan fase spermatogenesis dan tipe sel – sel spermatogenik yang terdapat pada setiap kelas ikan gurame uji. Ikan gurame yang dikelompokkan ke dalam kelas ikan muda (800 – 1000 g), tipe sel – sel spermatogenik yang ada di dalam testisnya berbeda dengan ikan gurame yang dikelompokkan ke dalam kelas ikan dewasa (1100 – 1300 g) dan ikan yang matang gonad (2250 – 3200 g). Adapun pada ikan yang dikelompokkan ke dalam kelas ikan yang belum berkembang gonadnya (400 – 600 g) belum terlihat atau terdapat adanya gonad. Jumlah spermatogonia terbanyak terdapat pada ikan muda (348.000 sel), yang kemudian jumlahnya semakin menurun baik pada ikan dewasa (192.000 sel) maupun ikan yang matang gonad (116.000 sel). Proporsi spermatogonia tertinggi terdapat pada ikan muda, yaitu sebesar 80,56% dan yang terendah terdapat pada ikan yang matang gonad, yaitu sebesar 6,30%. Adapun sel testikular yang mempunyai diameter terpanjang secara berturut – turut adalah spermatogonia, spermatosit, dan spermatid.
STUDI MENGENAI MORFOLOGI DAN KOMPOSISI SEL TESTIKULAR IKAN GURAME Osphronemus gouramy Lac.
MAULUDDIN
SKRIPSI
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Perikanan Pada Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan
Institut Pertanian Bogor
PROGRAM STUDI TEKNOLOGI DAN MANAJEMEN AKUAKULTUR FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
Judul : STUDI MENGENAI MORFOLOGI DAN KOMPOSISI SEL TESTIKULAR IKAN GURAME Osphronemus gouramy Lac.
Nama : Mauluddin Nomor Pokok : C14104050
Menyetujui,
Pembimbing I Pembimbing II
Dr. Alimuddin Prof. Dr. M. Zairin Junior
NIP. 132 133 953 NIP. 131 578 846
Mengetahui,
Dekan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan
Prof. Dr. Ir. Indra Jaya, M.Sc NIP. 131 578 799
KATA PENGANTAR
Puji syukur atas kehadirat Allah SWT yang telah melimpahkan segala
rahmat, nikmat, dan karunia-Nya yang tidak dapat dibalas dengan apapun
sehingga skripsi yang berjudul “Studi mengenai Morfologi dan Komposisi Sel
Testikular Ikan Gurame Osphronemus gouramy Lac.” ini dapat diselesaikan oleh penulis.
Dalam kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih yang
setulus-tulusnya kepada :
1. Dr. Alimuddin selaku Pembimbing I dan Prof. Dr. Muhammad Zairin
Junior selaku Pembimbing II yang telah banyak memberikan bimbingan
dan masukan selama melakukan penelitian sampai dengan penyusunan
skripsi ini.
2. Sri Nuryati, M.Si selaku Dosen Penguji Tamu yang telah memberikan
banyak masukan dalam menyelesaikan skripsi ini.
3. Harton Arfah, M.Si selaku Pembimbing Akademik yang telah memberikan
bimbingan dan arahan selama studi.
4. Mama, Mama, Mama, dan Ayah serta seluruh keluarga besar atas kasih
sayang, doa, dan dukungan baik moril dan materi.
5. Pak Ranta, Pak Marjanta, Mba Yuli, Kang Asep, Kak Rahmat, Mba Anna,
Mba Lina, Kak Lina, Ibu Irma, Pak Aam, Pak Ade Sunarma BBPBAT
Sukabumi, dan Pak Adhi Winarno FKH IPB atas bantuan yang diberikan.
6. Lazuardi Yudha Anggoro, Deby Yuniasari, Radi Ihlas Albani, Arief Eko
Prasetiyo, Dwi Hany Yanti, dan Sendok yang telah “hadir dan men –
close” atas kebersamaan, kerjasama, dan dukungannya.
7. Teman – teman BDP 41, kakak dan adik kelas BDP, dan pihak – pihak
yang tidak bisa disebutkan satu persatu atas bantuan yang diberikan.
Penulis mengharapkan skripsi ini dapat bermanfaat kepada semua pihak
yang memerlukan.
Bogor, Maret 2009
DAFTAR RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta, 24 November 1986 oleh mama dan ayah
yang sangat dicintai. Pendidikan formal yang dilalui adalah SMAN 38 Jakarta.
Pada tahun 2004, penulis mendapat kesempatan untuk melanjutkan pendidikan
tinggi ke Intitut Pertanian Bogor di Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan pada
Program Studi Teknologi dan Manajemen Akuakultur melalui Jalur USMI
(Undangan Seleksi Masuk IPB).
Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah aktif dalam organisasi
Himpunan Mahasiswa Akuakultur (HIMAKUA) sebagai staf Departemen
Kewirausahawan periode 2005/2006 dan Pengembangan Sumber Daya Manusia
periode 2006/2007. Selain itu, Penulis juga aktif menjadi Asisten Mata Kuliah
Dasar-dasar Genetika Ikan dan Industri Perbenihan Ikan periode 2007/2008.
Untuk memperdalam wawasan di bidang budidaya perairan, penulis pernah
menjalani praktek kerja lapang di Balai Budidaya Laut Lombok, Nusa Tenggara
Barat.
DAFTAR ISI
3.2.1 Pengumpulan dan Penanganan Ikan Gurame ... 13
3.2.2 Penentuan IKG ... 13
4.1.2 Karakteristik Morfologi Sel Testikular ... 19
4.1.3 Komposisi dan Pengukuran Diameter Sel Testikular ... 21
DAFTAR TABEL
Halaman
1. Jumlah sel testikular per ekor ikan gurame dari berbagai kelas... 21
DAFTAR GAMBAR
Halaman 1. Ikan gurame Osphronemusgouramy Lac. ... 4 2. Ilustrasi berbagai jenis testis. A: testis tubular mamalia, B: testis tubular
anastomosing, C: testis lobular, T: Tubuli, I: Lumen, RT: Rete Testis,
AT: Anastomosing Tubular, MD: Main Longitudinal Testis Duct, dan
L: Lobuli. (Grier, 1983 dalam Takashima dan Hibiya, 1995) ... 7 3. Ilustrasi dua jenis testis lobular pada ikan teleostei. A: lobuli berlekuk
dan B: lobuli padat (Nagahama, 1983 dalam Takashima dan Hibiya, 1995) ... 8
4. Skema spermatogenesis ... 9
5. Gambaran histologis tetes ikan carp. 1: sel stem, 2: spermatogonia primer, 3: spermatogonia sekunder, 4: spermatosit primer,
5: spermatosit sekunder, 6: spermatid, dan 7: sel Sertoli
(Takashima dan Hibiya, 1995) ... 11
6. Gambaran histologis testis ikan white perch. : spermatogonia,
a: spermatosit, b: spermatid, dan c: spermatozoa (Blazer, 2002) ... 12
7. Grafik hubungan antara berat ikan dengan berat gonad... 18
8. Grafik hubungan antara berat ikan dengan IKG ... 19
9. Gambaran histologis testis ikan gurame dari berbagai kelas.
A: ikan muda, B: ikan dewasa, C: ikan matang gonad,
a: spermatogonia, b: spermatosit, c: spermatid, dan d: spermatozoa ... 20
10. Komposisi sel testikular ikan gurame dari berbagai kelas.
A: ikan muda, B: ikan dewasa, C: ikan matang gonad,
1: spermatogonia, 2: spermatosit, dan 3: spermatid ... 22
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman 1. Data ikan gurame uji ... 32
2. Klasifikasi sel testikular berdasarkan ukuran dan karakteristik utamanya. . 33
I. PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Ikan gurame (Osphronemus gouramy Lac.) merupakan ikan asli Indonesia. Ikan gurame memiliki beberapa kelebihan, diantaranya banyak digemari oleh
masyarakat karena rasa dagingnya yang gurih dan lezat (Sendjaja dan Riski, 2002)
serta harga jual (Rp 20.000,- – Rp 28.000,- per kg) dan permintaan pasar yang
relatif tinggi (Tim Agromedia Pustaka, 2007). Sebaliknya, ikan gurame juga
mempunyai kekurangan, antara lain pertumbuhannya tidak secepat ikan tawar
konsumsi lainnya, seperti ikan mas dan ikan lele. Ikan gurame membutuhkan
waktu 2 – 3 tahun untuk mencapai matang gonad (Tim Agromedia Pustaka,
2007), sehingga memerlukan waktu relatif lama untuk memproduksi induk.
Lamanya waktu memproduksi induk dapat menyebabkan kurangnya ketersediaan
benih yang siap tebar (Sendjaja dan Riski, 2002). Saat ini, teknologi yang bisa
digunakan untuk mempercepat kematangan gonad ikan gurame belum ada.
Baru-baru ini, teknologi rekayasa reproduksi pada ikan telah
dikembangkan oleh Okutsu et al. (2008). Teknologi tersebut adalah pengembangan induk surrogate (induk semang). Prinsip dari pengembangan induk surrogate adalah transplantasi sel stem dari ikan donor ke ikan resipien tertentu yang memiliki kelebihan dibandingkan dengan ikan donor. Kekurangan
pada ikan donor, antara lain seperti ketersediaan induk ikan yang ada hanya salah
satu jenis kelamin saja, kematangan gonad induk ikan jantan dan betina tidak
sinkron, ukuran induk saat mencapai matang gonad relatif besar yang
menyebabkan ikan sulit ditangani, waktu yang diperlukan untuk mencapai matang
gonad lama, dan sebagainya. Sel stem bakal gonad ikan donor akan berkembang
normal dalam gonad ikan resipien menjadi sperma atau telur dan fungsional
(dapat membuahi atau dibuahi) sehingga ikan resipien dapat menghasilkan benih
ikan donor (Okutsu et al., 2006).
memiliki banyak aplikasi dalam bidang biologi, peternakan dan perikanan,
diantaranya adalah untuk menjajaki proses-proses perkembangan dan diferensiasi
sel germinal (gametogenesis), terapi regeneratif penyakit organ reproduksi,
memproduksi hewan transgenik melalui modifikasi sel germinal secara genetik,
pemeliharaan sumber daya genetik yang terancam punah, dan menciptakan sistem
pembenihan dimana spesies target dapat diproduksi dari induk yang lain atau dikenal dengan istilah “surrogate broodstock” (Brinster dan Zimmermann, 1994; Okutsu et al., 2006). Metode xenotransplantasi tersebut mungkin dapat digunakan untuk mengatasi lambatnya ikan gurame matang gonad dan kurangnya
ketersediaan benih ikan gurame yang siap tebar.
Salah satu langkah awal dari pengembangan teknologi xenotransplantasi
adalah studi mengenai morfologi dan komposisi sel testikular ikan donor.
Morfologi dan komposisi sel-sel testikular diduga berhubungan dengan ukuran
ikan dan Indeks Kematangan Gonad (IKG) atau Gonado Somatic Index (GSI). Oleh karena itu, diperlukan berbagai ukuran ikan gurame untuk dapat mengetahui
morfologi dan komposisi sel-sel testikular pada setiap ukuran.
Sel germinal dalam testis ikan jantan terdiri atas spermatogonia,
spermatosit, spermatid, dan spermatozoa. Spermatogonia (tipe A) merupakan sel
stem (sel punca atau sel induk). Menurut Okutsu et al. (2005) sel stem spermatogonia dapat digolongkan menjadi dua jenis, yaitu sel stem spermatogonia
yang belum terdiferensiasi dan yang terdiferensiasi. Sel spermatogonia yang telah
terdiferensiasi akan mengalami proliferasi (pembelahan) mitosis dan meiosis
sampai menjadi spermatozoa. Adapun sel yang belum terdiferensiasi, memiliki
kemampuan memperbaharui diri (self-renewal) sepanjang hidup organisme dan juga dapat terus berkembang menjadi spermatozoa seperti halnya sel
spermatogonia terdiferensiasi. Sel stem ini dapat menurunkan informasi genetik
ke generasi berikutnya melalui pematangan gonad dan fertilisasi. Selanjutnya sel
stem spermatogonia dapat berkembang menjadi sperma dan telur (Okutsu et al., 2008). Dengan demikian, jika sel stem spermatogonia ikan gurame yang belum
terdiferensiasi ditransplantasikan ke ikan resipien dan selanjutnya sel stem
spermatogonia dapat berkembang menjadi sperma dan telur dalam gonad ikan
resipien, sehingga benih ikan gurame dapat dihasilkan dari ikan resipien tersebut.
1.2 Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk membedakan dan menganalisis morfologi
II. TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Ikan Gurame Osphronemus gouramy Lac.
Klasifikasi dan sistematika ikan gurame Osphronemus gouramy Lac. menurut Saanin (1984) adalah sebagai berikut :
Filum : Chordata
Kelas : Pisces
Ordo : Labirinthici
Subordo : Anabantoidei
Famili : Anabantidae
Genus : Osphronemus
Spesies : Osphronemus gouramy Lac.
Secara morfologi, ikan gurame memiliki bentuk badan oval agak panjang,
pipih, dan punggung tinggi. Badan berwarna kecoklatan dengan bintik hitam pada
sirip dada. Pada jari pertama sirip perut terdapat alat peraba berupa benang
panjang dan memiliki alat pernapasan tambahan (labirin) yang berfungsi
menghirup oksigen langsung dari udara. Ikan gurame berkembang biak sepanjang
tahun dan tidak tergantung pada musim. Kematangan kelamin biasanya dicapai
saat ikan gurame berumur 2 – 3 tahun (Tim Agro Media Pustaka, 2007).
Di berbagai daerah, ikan gurame dikenal dengan berbagai sebutan,
diantaranya gurameh (Jawa), gurame (Sunda dan Betawi), kalau, kala, alui
(Sumatera). Dalam bahasa Inggris, ikan gurame disebut giant gouramy (Tim Agro Media Pustaka, 2007).
2.2 Perkembangan Gonad
Pada proses reproduksi, sebelum terjadi pemijahan sebagian besar hasil
metabolisme digunakan untuk perkembangan gonad. Gonad akan semakin
bertambah berat diimbangi dengan bertambah besar ukurannya (Effendie, 1992).
Perkembangan gonad pada ikan dapat dibagi menjadi dua tahap, yaitu tahap
pertumbuhan gonad hingga mencapai tingkat dewasa kelamin dan tahap
pematangan produksi seksual. Tahap pertumbuhan berlangsung sejak ikan
menetas hingga mencapai dewasa kelamin, sedangkan tahap pematangan
berlangsung setelah ikan dewasa. Tahap pematangan akan terus berlangsung dan
berkesinambungan selama fungsi reproduksi ikan berjalan normal (Lagler et al., 1977).
Pengetahuan tentang Tingkat Kematangan Gonad (TKG) sangat penting
dan menunjang keberhasilan dalam membenihkan ikan karena berkaitan erat
dengan pemilihan calon – calon induk ikan yang akan dipijahkan. Untuk
mengetahui perubahan yang terjadi pada gonad secara kuantitatif dapat dinyatakan
dengan suatu indeks yang dinamakan Indeks Kematangan Gonad (IKG) atau
Gonado Somatic Index (GSI). Nilai IKG akan mencapai batas kisaran maksimum pada saat akan terjadi pemijahan dan akan turun kembali setelah memijah
(Effendie, 1992).
Menurut Yani (1994) selama proses perkembangan berlangsung akan
terjadi perubahan gonad secara sitologi, histologi, dan morfologi. Perubahan
tersebut juga akan menyebabkan terjadinya perubahan bobot dan volume gonad
yang dapat dijadikan sebagai indikator dalam menentukan sejauh mana
perkembangan yang telah dialami oleh gonad dalam proses oogenesis pada ikan
betina dan spermatogenesis pada ikan jantan.
Nilai rata – rata IKG ikan betina selalu lebih besar daripada ikan jantan
pada TKG yang sama. Hal ini terjadi karena pertambahan bobot ovarium selalu
lebih besar daripada pertambahan bobot testis. Peningkatan bobot ovarium
berhubungan dengan proses vitelogenesis dalam perkembangan gonad, sedangkan
peningkatan bobot testis berhubungan dengan proses spermatogenesis dan
spermatogenesis berjalan secara hormonal di dalam tubuh ikan (Maty, 1985
dalam Frandson, 1992 dalam Shelton, 1989 dalam Cerda et al., 1996)
TKG merupakan pengelompokkan kematangan gonad ikan berdasarkan
perubahan – perubahan yang terjadi pada perkembangan gonad. Pengamatan
perkembangan gonad dapat dibagi menjadi dua, yaitu pengelompokkan
berdasarkan morfologi dan histologi. Dari pengamatan secara histologi akan dapat
diketahui lebih jelas dan mendetail, sedangkan pengamatan secara morfologi tidak
akan sedetail dengan cara histologi. Akan tetapi, cara morfologi banyak dilakukan
karena dapat dilakukan di lapangan (Yani, 1994).
2.3 Testis
Testis merupakan sepasang organ memanjang yang terletak pada dinding
dorsal (Tang dan Affandi, 2002). Sebagai organ kelamin primer, testis
mempunyai fungsi menghasilkan spermatozoa dan mensekresi hormon
testosteron.
Pada masa lampau, testis ikan teleostei diklasifikasikan ke dalam jenis –
jenis spermatogonia yang terbatas dan tidak terbatas (berdasarkan lokasi tempat
dari spermatogonia; Grier, 1981 dalam Takashima dan Hibiya, 1995) atau jenis – jenis lobular (lobuli – lobuli) atau tubular (tabung) (berdasarkan ada atau tidaknya
keberadaan lumen; Billard, 1986 dalam Takashima dan Hibiya (1995). Di dalam klasifikasi, secara berurutan, jenis – jenis spermatogonia yang terbatas dan tidak
terbatas dapat disamakan dengan jenis – jenis lobular atau tubular.
Dengan menggunakan pendekatan filogenetik, Callard (1991) dalam
Takashima dan Hibiya (1995) mengelompokkan semua testis vertebrata ke dalam
tubular (mamalia, burung, reptil) atau lobular (amfibi, ikan teleostei). Menurut
Callard (1991) dalam Takashima dan Hibiya (1995) sebuah tubuli berbentuk seperti sebuah ruangan terpisah yang terbuka, sedangkan sebuah lobuli berbentuk
seperti sebuah kantung yang tertutup. Dengan demikian, testis jenis lobular
umumnya ditemukan pada ikan teleostei, meskipun terdapat perbedaan di dalam
pola distribusi spermatogonia atau ada atau tidaknya keberadaan lumen di dalam
tetapi, Grier (1993) dalam Takashima dan Hibiya (1995) membuat sebuah jenis baru dari testis tubular yang ditemukan pada ikan teleostei, yaitu “anastomosing
tubular testis” (testes tubular anastomosing). Jenis testis tersebut secara
filogenetik khususnya ditemukan di bawah ikan teleostei (contoh: Lepidosteus platyrhinchus, Ictalurus natalis, Ophisthonema oglinum, Dorosoma potense, Esox niger, dan lain – lain) dan dicirikan dengan sebuah jaringan yang bercabang dari tubular, seperti testis tubular pada mamalia, berputar - putar di batas luar gonad
(Grier, 1993 dalam Takashima dan Hibiya, 1995).
Gambar 2. Ilustrasi berbagai jenis testis. A: testis tubular mamalia, B: testis tubular anastomosing, C: testis lobular, T: Tubuli, I: Lumen, RT: Rete Testis, AT: Anastomosing Tubular, MD: Main Longitudinal Testis Duct, dan L: Lobuli. (Grier, 1983 dalam Takashima dan Hibiya, 1995).
Lobuli – lobuli pada testis ikan teleostei dibatasi oleh sebuah ruangan
membran dan sebuah lapisan pembatas sel (myoid). Pada lobuli terdapat tubuli
sebuah tubuli seminiferi dihubungkan secara sitoplasmik dengan jembatan –
jembatan interselular, dan diferensiasi sel – sel tersebut hampir sinkroni.
Pada spesies dengan lobuli – lobuli berlekuk (hampir terdapat pada ikan
teleostei), baik spermatogonia maupun tubuli seminiferi pada berbagai tahap
berkembangan dapat dilihat diseluruh panjang dari lobuli dan spermatozoa yang
matang dikeluarkan pada saat spermiasi ke dalam lumen lobular. Adapun testis
dengan lobuli – lobuli yang padat, tubuli seminiferi disusun berdasarkan tahap –
tahap perkembangan, bermula dari lobuli yang tertutup, yang mengandung
spermatogonia, dan berakhir di saluran efferent, yang spermatozoa dikeluarkan dari tubuli seminiferi. Pada kebanyakan spesies, steroidogenic cell (sel interstisial atau sel Leydig) dapat diamati diantara celah – celah lobuli – lobuli (Billard, 1986
dalam Takashima dan Hibiya, 1995). Adapun pada spesies lainnya, lobuli – lobuli dan sel - sel Leydig ditemukan di daerah yang terpisah dari testis.
Gambar 3. Ilustrasi dua jenis testis lobular pada ikan teleostei. A: lobuli berlekuk dan B: lobuli padat (Nagahama, 1983 dalam Takashima dan Hibiya, 1995).
2.4 Spermatogenesis
Menurut Prasetyaningtyas (2006) spermatogenesis adalah proses
perkembangan spermatogonia menjadi spermatozoa. Adapun Nobrega et al. (2008) menyatakan spermatogenesis adalah proses biologi yang kompleks dari
transformasi selular yang menghasilkan sel germinal jantan yang haploid yang
berasal dari sel stem spermatogonia yang diploid. Spermatogenesis terjadi di
tubuli seminiferi dan baru dimulai setelah mencapai pubertas sampai mengalami
kematian (Wikipedia, 2009). Produksi spermatozoa akan bertambah bersamaan
dengan meningkatnya umur, akan tetapi produksi spermatozoa kemudian akan
mengalami penurunan sesuai dengan meningkatnya umur.
Tiga fase spermatogenesis menurut Dellmann dan Brown (1992) adalah
sebagai berikut :
1. Spermatositogenesis; terjadi pembelahan secara mitosis dan spermatogonia
bertambah banyak menjadi spermatosit primer. Pada fase ini spermatogonia
mempunyai kemampuan untuk memperbaharui diri sehingga menjadi dasar
dalam spermatogonial stem cell (Ogawa et al., 1997).
2. Miogenesis; tahap perubahan dari spermatosit yang haploid menjadi
spermatid yang diploid.
3. Spermiogenesis; proses transformasi spermatid yang bulat menjadi bentuk
spermatozoa yang matang.
Gambar 4. Skema spermatogenesis.
2.5 Histologi Testis
Tubuli seminiferi adalah bagian yang dominan dalam testis yang berupa
buluh bulat dan berliku – liku. Pada tubuli terdapat sel – sel spermatogenik dan sel
Sertoli. Sel – sel spermatogenik terdiri dari spermatogonia, spermatosit,
spermatid, dan spermatozoa. Berbagai sel spermatogenik menunjukkan perbedaan
tahapan dalam perkembangan dan diferensiasi spermatozoa.
Sel – sel spermatogenik dibedakan menurut bentuk dan lokasinya di dalam
tubuli seminiferi. Spermatogonia berbentuk bulat dan terlihat paling besar diantara
sel spermatogenik lainnya dengan warna lebih gelap. Spermatosit letaknya lebih
ke sentral dari spermatogonia dan bentuknya bulat. Spermatid letaknya lebih ke
sentral dari spermatosit, bentuknya bulat kecil dengan inti bulat di tengah. Adapun
spermatozoa letaknya di sentral tubuli, bentuknya jelas karena mempunyai kepala
dan ekor.
Sel lain yang berada dalam tubuli seminiferi adalah sel Sertoli. Sel Sertoli
berbentuk bulat atau segitiga dan letaknya di membran basal tubuli seminiferi
diantara spermatogonia. Ciri dari sel Sertoli adalah mempunyai penjuluran ke arah
lumen tubuli seminiferi. Jumlah sel Sertoli bervariasi antara 5 – 10 sel dalam
setiap tubuli seminiferi. Fungsi sel ini adalah sebagai sel pendukung yang
memberi nutrisi, proteksi, dan menunjang sel – sel spermatogenik. Dalam
kerjanya sel ini dipengaruhi oleh Follicle Stimulating Hormone (FSH) yang mempermudah proses spermatogenesis.
Sel Leydig terletak di daerah segitiga antara tubuli seminiferi dengan
pembuluh darah. Sel Leydig mempunyai bentuk yang tidak beraturan, sel – selnya
polihedral dengan inti bulat. Aktivitas sel Leydig dipengaruhi oleh hormon
Luteinizing Hormone (LH) dan FSH kemudian hormon tersebut berdifusi ke dalam tubuli seminiferi untuk mempermudah proses spermatogenesis dengan
merangsang diferensiasi sel – sel pembentuk spermatozoa (Novelina, 1996).
Melalui pendekatan histologi, di dalam testis terdiri dari jaringan –
jaringan berikut:
1. Tubuli Seminiferi.
Epitel tubuli seminiferi terdiri dari dua macam sel yang berbeda.
i.) Sel Germinatif; adalah sel yang akan mengalami perubahan selama
proses spermatogenesis, sebelum siap untuk mengadakan fertilisasi.
ii.) Sel Sertoli; adalah sel yang mempunyai bentuk panjang dan kadang –
kadang seperti piramid. Sel ini terletak dekat atau diantara sel
germinatif dan berfungsi memberi makan spermatozoa yang masih
muda dan memfagosit sel – sel spermatozoa yang telah mati atau
mengalami degenerasi.
2. Sel Stroma atau tenunan pengikat di luar tubuli seminiferi. Pada jaringan
ini terdapat pembuluh darah, limfe, sel saraf, dan sel makrofag.
3. Sel Interstitial dan Sel Leydig. Sel Leydig menghasilkan hormon
testosteron, namun dihasilkan juga oleh spermatozoa dan kelenjar adrenal.
Pada testis muda biasanya terlihat hanya ada sel spermatogonia dan sel
sertoli pada tubulinya. Tubuli biasanya belum berlumen dan terdapat jaringan ikat
yang tebal di sekitar tubuli. Adapun pada testis dewasa, terlihat tubuli yang belum
berlumen dan terdapat aktivitas spermatogenesis, yaitu adanya sel spermatogenik.
Sel spermatogenik yang terlihat adalah spermatogonia, spermatosit primer,
spermatid, dan bahkan spermatozoa (Prasetyaningtyas, 2001).
Gambar 5. Gambaran histologis tetes ikan carp. 1: sel stem, 2: spermatogonia primer, 3: spermatogonia sekunder, 4: spermatosit primer, 5: spermatosit sekunder, 6: spermatid, dan 7: sel Sertoli (Takashima dan Hibiya, 1995).
Gambar 6. Gambaran histologis testis ikan white perch. : spermatogonia, a: spermatosit, b: spermatid, dan c: spermatozoa (Blazer, 2002).
III. BAHAN DAN METODE
3.1 Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Juli – Desember 2008. Pembuatan
preparat histologi dilakukan di Laboratorium Kesehatan Ikan, Departemen
Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian
Bogor (IPB). Dokumentasi hasil histologi dilakukan di Laboratorium Histologi,
Departemen Anatomi Fisiologi dan Farmakologi, Fakultas Kedokteran Hewan,
IPB. Disosiasi testis dan dokumentasinya dilaksanakan di Balai Besar
Pengembangan Budidaya Air Tawar (BBPBAT) Sukabumi.
3.2Prosedur Kerja
Tahapan yang dilakukan dalam penelitian ini adalah pengamatan preparat
histologi yang bertujuan untuk mengetahui perkembangan morfologi sel testikular
dan disosiasi gonad yang berfungsi untuk menghitung komposisi sel testikular
ikan gurame.
3.2.1 Pengumpulan dan Penanganan Ikan Gurame
Ikan gurame uji untuk sementara waktu dipelihara di akuarium atau bak
tandon. Kemudian sebanyak 18 ekor ikan gurame dikelompokkan berdasarkan
tingkat perkembangan gonadnya, yaitu ikan yang belum berkembang gonadnya,
ikan muda, ikan dewasa, dan ikan yang matang gonadnya. Jumlah ikan gurame
yang belum berkembang gonadnya sebanyak lima ekor. Kemudian secara
berturut-turut jumlah ikan muda, ikan dewasa, dan ikan yang matang gonadnya
adalah 3, 3, dan 7 ekor. Berat tubuh ikan gurame yang digunakan berkisar antara
400 – 3200 g. Berat tubuh tersebut ditentukan dengan menggunakan timbangan
manual dengan tingkat ketelitian 0,1 g. Ikan gurame diperoleh dari petani ikan di
Petir dan Empang (Bogor), pasar swalayan di Bogor, dan BBPBAT Sukabumi.
3.2.2 Penentuan IKG
IKG (%) diketahui dengan cara membandingkan antara berat gonad ikan
Berat gonad ikan uji ditentukan dengan menggunakan timbangan digital dengan
tingkat ketelitian 0,0001 g.
3.2.3 Pembuatan Preparat Histologi Testis
Setelah testis diambil dan ditimbang beratnya, testis dipotong menjadi dua
bagian. Satu bagian digunakan untuk pembuatan preparat histologi testis dan
bagian lainnya untuk disosiasi testis. Sebelum diproses secara histologis, testis
dibersihkan pada larutan Phosphate Buffer Saline(PBS).
Testis difiksasi ke dalam larutan Bouin selama 48 jam. Kemudian
dilakukan dehidrasi dengan cara memasukkan testis ke dalam alkohol 70% selama
24 jam. Setelah itu, testis dipindahkan ke dalam alkohol 80%, 90%, dan 95% yang
masing – masing dilakukan selama 24 jam, sedangkan pada alkohol 100%
(absolut I, II, III), lama pemaparan masing – masing selama satu jam. Selanjutnya
dilakukan penjernihan dengan cara memindahkan testis dari alkohol absolut III ke
larutan penjernih (xylol). Pemaparan dilakukan dalam xylol I (30 menit), xylol II
(30 menit), dan xylol III (1 jam). Tahap berikutnya yang dilakukan adalah
infiltrasi dan embedding. Infiltrasi dilakukan dalam parafin cair yang ditempatkan dalam inkubator bersuhu 60 – 70oC dan dilakukan secara bertahap (tiga tahap),
dengan lama pemaparan masing – masing selama satu jam. Embedding dilakukan dengan memasukkan potongan jaringan ke dalam cetakan embedding yang sebelumnya telah diisi parafin cair hingga cembung di atas plate panas pada
embedding tissue consule. Cetakan embedding selanjutnya dipindahkan ke plate
dingin dan setelah parafin setengah membeku, label jaringan ditempelkan dan
diapungkan di atas air dingin. Setelah parafin beku sempurna, hasil embedding
dapat dilepas dari cetakannya dan diiris – iris berbentuk segi empat, lalu
ditempelkan pada blok kayu. Hal selanjutnya yang dilakukan adalah pemotongan
blok parafin, yaitu diawali dengan memasang blok jaringan pada mikrotom,
selanjutnya dilakukan pemotongan dengan ukuran 4 µm. Proses pemotongan
dilakukan berkali – kali hingga diperoleh potongan yang sempurna. Hasil
potongan diambil dengan cara melekatkan pada kertas basah dan ditempatkan di
atas permukaan air dingin selama beberapa saat, pindahkan ke atas permukaan air
deparafinisasi dan rehidrasi. Sediaan dimasukkan dalam xylol sebanayak tiga kali
untuk melarutkan parafin. Rehidrasi dilakukan bertahap dengan cara memasukkan
sediaan ke dalam larutan alkohol bertingkat dari alkohol absolut tiga kali, 95%,
90%, 80%, dan 70% dengan lama waktu pada masing – masing tahap 2 – 5 menit.
Tahap selanjutnya adalah pewarnaan Hematoksilin Eosin (HE). Sediaan di
rendam di dalam hematoksilin selama lima menit kemudian direndam dalam air
mengalir selama 10 menit. Selanjutnya dilakukan pewarnaan eosin selama 5
menit. Kemudian dilakukan dehidrasi di mulai dengan alkohol 70%, 80%, 90%,
95% dan alkohol absolut I, II, dan III. Untuk penjernihan dilakukan dengan xylol
I, II, dan III. Kemudian dilanjutkan dengan mounting. Mounting adalah proses penutupan sediaan dengan menggunakan cover glass dengan bantuan perekat. Proses mounting diawali dengan meneteskan (1 – 2 tetes entelan) perekat di sisi
sediaan, selanjutnya cover glass diletakkan secara hati – hati agar perekat dapat menyebar secara merata dan dapat menutupi seluruh permukaan sediaan dan
diupayakan agar tidak terbentuk gelembung udara. Tahap terakhir yang dilakukan
adalah dokumentasi dengan menggunakan mikroskop cahaya yang dilengkapi
kamera (Nikon E600, Japan) dengan lensa objektif 40x. Dokumen gambar diambil
dari beberapa lapang pandang.
3.2.4 Disosiasi Testis
Sebelum dilakukan proses disosiasi, bagian permukaan luar testis
dibersihkan menggunakan larutan PBS. Tahap pertama yang dilakukan adalah
testis dipotong kecil – kecil sepanjang 0,5 cm di cawan petri. Kemudian potongan
testis dicacah sampai sedemikian kecil selama 3 – 5 menit. Setelah itu, larutan
tripsin 0,5% (tripsin dilarutkan di dalam PBS) dimasukkan ke dalam cawan petri
yang berisi potongan testis sebanyak 2 ml. Tahap berikutnya adalah testis tersebut
dicacah kembali dan dipipetteteskan dengan menggunakan mikropipet selama 3 –
5 menit sampai terlihat buih. Selanjutnya, diambil larutan hasil cacahan testis
sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam mikrotube. Dari mikrotube diambil
kembali larutan hasil cacahan testis sebanyak 2 µl dan diteteskan ke dalam gelas
objek cekung. Hal selanjutnya adalah dilakukan pengamatan di bawah mikroskop
komputer yang telah ter – install software DP20. Selang lima menit kemudian, diambil kembali hasil cacahan testis dari mikrotube sebanyak 2 µl dan kembali
dilakukan pengamatan di bawah mikroskop. Sisa larutan cacahan testis yang
terdapat di mikrotube disentrifus selama 10 menit dengan kecepatan 15.800 rpm.
Kemudian supernatan hasil sentrifus dibuang dan diganti dengan PBS sebanyak 1
µl. Hal ini dilakukan agar sel – sel spermatogenik tidak rusak dan memutus kerja
tripsin. Setelah itu, diambil kembali dengan menggunakan mikropipet sebanyak 1
µl dan diteteskan ke dalam gelas objek cekung dan dilakukan kembali
pengamatan.
3.2.5 Pengamatan Hasil
3.2.5.1 Karakterisasi Morfologi Sel Testikular
Karakterisasi morfologi sel testikular ikan gurame dilakukan untuk
mengetahui perbedaan tipe sel – sel spermatogenik pada ikan gurame, yaitu
spermatogonia, spermatosit, spermatid, dan spermatozoa. Karakterisasi dilakukan
dengan mengamati preparat histologi testis yang telah selesai dibuat di bawah
mikroskop cahaya yang dilengkapi kamera (Nikon E600, Japan) dengan lensa
objektif 40x dan kemudian dibandingkan dengan hasil histologi yang telah
dilakukan berdasarkan kriteria Takashima dan Hibiya (1995) dan Blazer (2002).
Preparat histologi testis yang diamati sebanyak enam buah, yang terdiri dari
preparat histologi testis ikan gurame muda sebanyak satu buah, ikan gurame
dewasa sebanyak dua buah, dan ikan gurame yang matang gonad sebanyak tiga
buah.
3.2.5.2 Penghitungan Komposisi dan Pengukuran Diameter Sel Testikular Penghitungan komposisi sel testikular ikan gurame dilakukan untuk
mengetahui jumlah sel – sel spermatogenik, yaitu spermatogonia, spermatosit,
spermatid, dan spermatozoa. Akan tetapi, pada penelitian ini spermatozoa tidak
dihitung. Sel testikular hasil disosiasi dihitung langsung di bawah mikroskop
Olympus SZX16 yang telah dilengkapi kamera dan terhubung ke komputer yang
memiliki software DP20 yang berguna dalam penghitungan sel.
Pengukuran diameter sel testikular bertujuan untuk mengetahui ukuran
sel-sel spermatogenik. Pengukuran diameter sel-sel testikular dilakukan dengan cara
membuat garis skala dan kemudian dibandingkan dengan diameter sel-sel
spermatogenik. Selanjutnya hasil pengukuran dikelompokkan ke dalam beberapa
kelas. Ukuran diameter sel – sel spermatogenik dari yang terkecil sampai yang
terbesar adalah spermatozoa, spermatid, spermatosit, dan spermatogonia.
Untuk mengetahui perbedaan morfologi pada masing – masing sel
spermatogenik hasil disosiasi testis dilakukan perbandingan dengan hasil histologi
testis sebelumnya dan hasil disosiasi testis yang telah dilakukan berdasarkan
kriteria Okutsu et al. (2005). Hasil disosiasi testis yang dihitung komposisi dan diukur sel testikular berasal dari empat ekor ikan gurame, yang terdiri dari
disosiasi testis ikan gurame muda sebanyak satu ekor, ikan gurame dewasa
sebanyak satu ekor, dan ikan gurame yang matang gonad sebanyak dua ekor.
3.2.5.3 Proporsi Spermatogonia
Proporsi spermatogonia diketahui dengan cara membandingkan antara
jumlah sel spermatogonia dengan jumlah total sel testikular, dan hasilnya dalam
bentuk persen (%).
3.3 Analisis Data
Data yang diperoleh disajikan dalam bentuk tabel, grafik, dan gambar serta
dianalisis secara deskriptif untuk setiap penentuan IKG, perkembangan morfologi,
dan proporsi komposisi sel testikular ikan gurame.
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil 4.1.1 IKG
Gambar 7. Grafik hubungan antara berat ikan dengan berat gonad.
Secara keseluruhan nilai rata – rata berat gonad ikan gurame berkisar
diidentifikasi atau ditemukan dari lima ekor ikan gurame yang telah diperiksa.
Dari Gambar 7 dapat dilihat bahwa semakin besar berat ikan maka semakin
meningkat pula berat gonad.
Nilai rata – rata IKG ikan gurame berkisar antara 8,7025 x 10-3– 9,5382 x
10-3% (Gambar 8). Nilai rata – rata IKG tertinggi (9,5382 x 10-3%) juga terdapat
pada ikan yang dikelompokkan ke dalam kelas ikan yang matang gonad (2250 –
ikan yang dikelompokkan ke dalam kelas ikan muda (800 – 1000 g). Ikan yang
dikelompokkan ke dalam kelas ikan yang belum berkembang gonadnya (400 –
600 g), gonad relatif sulit untuk diidentifikasi atau ditemukan, sehingga nilai rata–
rata IKG tidak dapat ditentukan. Dari Gambar 8 dapat dilihat bahwa semakin
besar berat ikan maka semakin meningkat pula nila rata – rata IKG. Semakin
besar berat ikan maka berat gonad juga akan semakin besar yang menyebabkan
nilai IKG akan semakin besar pula.
Gambar 8. Grafik hubungan antara berat ikan dengan IKG.
4.1.2 Karakteristik Morfologi Sel Testikular
Dari hasil pengamatan preparat histologis testis ikan gurame menunjukkan
bahwa terdapat perbedaan fase spermatogenesis dan tipe sel-sel spermatogenik
yang terdapat pada setiap kelas ikan gurame uji. Pada ikan gurame kelas ikan
muda (800 – 1000 g), tipe sel – sel spermatogenik yang ada di dalam testisnya
berbeda dengan ikan gurame kelas ikan dewasa (1100 – 1300 g) dan ikan yang
matang gonad (2250 – 3200 g). Dari 5 ekor ikan gurame dengan berat tubuh
400-600 g yang diamati, tidak berhasil ditemukan testis sehingga tidak dapat dibuat
preparat histologinya. Dalam kelas yang sama juga terdapat perbedaan fase
Gambar 9. Gambaran histologis testis ikan gurame dari berbagai kelas. A: ikan muda, B: ikan dewasa, C: ikan matang gonad, a: spermatogonia, b: spermatosit, c: spermatid, dan d: spermatozoa.
Hasil pengamatan preparat histologi menunjukkan bahwa sel
spermatogenik yang terdapat pada ikan gurame kelas ikan muda, yaitu
spermatogonia. Semua tipe sel – sel spermatogenik, yaitu spermatogonia,
spermatosit, spermatid, dan spermatozoa tampak terlihat mulai ada pada ikan
gurame kelas ikan dewasa. Walaupun demikan jumlah spermatozoanya masih
sedikit. Untuk ikan gurame yang dikelompokkan ke dalam kelas ikan yang
matang gonad tampak telihat dengan jelas semua tipe sel – sel spermatogenik,
yang didominasi oleh spermatozoa. Banyaknya spermatozoa tersebut menandakan
bahwa ikan gurame tersebut telah matang gonad dan siap memijah.
4.1.3 Komposisi dan Pengukuran Diameter Sel Testikular
Tabel 1 menunjukkan bahwa jumlah sel testikular per ekor ikan gurame
dari berbagai kelas bervariasi. Jumlah spermatogonia terbanyak terdapat pada ikan
muda (348.000 sel), yang kemudian jumlahnya semakin menurun baik pada ikan
dewasa (192.000 sel) maupun ikan yang matang gonad (116.000 sel). Proporsi
spermatogonia tertinggi terdapat pada ikan muda, yaitu sebesar 80,56% dan yang
terendah terdapat pada ikan yang matang gonad, yaitu sebesar 6,30%. Adapun sel
testikular yang mempunyai diameter terpanjang secara berturut – turut adalah
spermatogonia, spermatosit, dan spermatid (Tabel 2).
Tabel 1. Jumlah sel testikular per ekor ikan gurame dari berbagai kelas.
Sel testikular Ikan
Tabel 2. Sebaran diameter sel testikular ikan gurame.
Sel Tesitikular Diameter (µm)
Spermatogonia 5,0 – 15,0
Spermatosit 3,0 – 5,0 Spermatid 1,5 – 2,5
Gambar 10. Komposisi sel testikular ikan gurame dari berbagai kelas. A: ikan muda, B: ikan dewasa, C: ikan matang gonad, 1: spermatogonia, 2: spermatosit, dan 3: spermatid.
4.2 Pembahasan
Nilai rata – rata IKG ikan gurame dari masing – masing berat ikan
memperlihatkan pola yang meningkat. Syandri (1996) melaporkan bahwa
terjadinya peningkatan nilai IKG ikan jantan berhubungan dengan proses
spermatogenesis dan peningkatan volume tubuli semineferi. Hal ini diperkuat
dengan pendapat Ketchen (1972) dalam Siregar (1989) dalam Ernawati (1999) yang menyatakan bahwa semakin jauh tingkat perkembangan oogenesis atau
spermatogenesis maka nisbah antara gonad dan berat ikan semakin besar.
Selanjutnya menurut Syandri (1996) TKG juga berhubungan dengan IKG.
Semakin matang gonad ikan dan dekat dengan waktu pemijahan maka nilai rata –
rata IKG semakin tinggi. Faktor penyebabnya antara lain adalah ovari sudah diisi
oleh oosit matang dan testis oleh spermatozoa. Adapun Sukendi (2001)
menyatakan bahwa semakin tinggi TKG maka nilai rata – rata IKG akan semakin
tinggi. Nilai IKG dipengaruhi oleh TKG. Hal ini disebabkan TKG yang
meningkat akan diikuti naiknya berat gonad dan berpengaruh pada meningkatnya
berat ikan. Kecuali pada TKG V terjadi penurunan nilai rata – rata IKG karena
pada TKG V sebagian telur atau spermatozoa telah dikeluarkan pada saat
pemijahan sehingga berat gonad akan turun kembali.
Effendie (1992) berpendapat bahwa IKG dapat digunakan untuk
mengetahui perubahan yang terjadi pada gonad secara kuantitatif. Nilai IKG
selalu dalam bentuk nilai kisaran pada setiap TKG. Misalnya pada TKG III nilai
IKG berkisar antara 6 – 8% dan pada TKG IV nilai IKG berkisar antara 13 – 20%
(Sukendi, 2001).
Nilai rata – rata IKG ikan gurame jantan yang digunakan, yaitu berkisar
antara 8,7025 x 10-3 – 9,5382 x 10-3% adalah sangat kecil jika dibandingkan
dengan IKG ikan lainnya, yaitu IKG ikan baung (Mystus nemurus CV) jantan berkisar antara 0,02 – 8,27% (Sukendi, 2001) dan IKG ikan bilih (Mystacoleucus padangensis Bleeker) jantan berkisar antara 1,26 – 7,42% (Syandri, 1996). Perbedaan nilai IKG tersebut diduga merupakan karakter spesifik suatu spesies
ikan. Royce (1984) dalam Syandri (1996) menyatakan bahwa ikan jantan dapat memijah jika nilai IKG berkisar antara 5 – 10%. Dari nilai rata – rata IKG ikan
jauh dari periode pemijahan atau berada pada periode pasca-pemijahan. Hasil
penelitian yang telah dilakukan menunjukkan hasil yang berbeda dengan Royce
(1984) dalam Syandri (1996). Pada kelas ikan gurame yang memiliki nilai rata – rata IKG 9,5382 x 10-3%, melalui pengamatan secara histologi dan disosiasi dapat
diketahui bahwa banyak terdapat spermatozoa dalam testisnya. Banyaknya
spermatozoa menunjukkan ikan tersebut matang gonad dan siap memijah.
Pada tingkat perkembangan testis ikan gurame kelas ikan muda (800 g –
1000 g), secara histologi terlihat jaringan ikat dan spermatogonia. Namun
demikian, tipe-tipe spermatogonia; tipe A belum dan telah terdiferensiasi serta
tipeB, tidak dapat diidentifikasi. Menurut Amstrong et al. (2002) dalam Syandri (1996) spermatogonia yang berada pada testis berasal dari sel bakal gonad yang
mengalami proliferasi secara mitosis. Pada tingkat perkembangan ini belum
terlihat tanda perkembangan tubuli. Menurut Murphy dan Taylor (1990) dalam
Sukendi (2001) tingkat ini dinamakan belum matang (immature).
Pada ikan gurame kelas ikan dewasa (1100 g – 1300 g), terbentuknya
spermatosit berasal dari hasil perkembangan spermatogonia. Testis mulai
berkembang ditandai dengan terlihatnya kantung – kantung tubuli semineferi yang
berisi spermatosit. Pada tingkat perkembangan ini spermatosit berada agak jauh
dari jaringan ikat. Pengamatan secara histologi menunjukkan bahwa pada ikan
gurame kelas ikan dewasa, spermatosit mulai berkembang menjadi spermatid.
Sebagian spermatid mulai menyebar dan sebagian lagi masih terlindungi oleh
selaput yang berbentuk kantung. Jaringan ikat testis terlihat lebih sedikit
dibandingkan dengan kelas ikan gurame sebelumnya. Selain itu, pada tingkat
perkembangan ini proses pembentukan spermatozoa mulai berjalan. Menurut
Murphy dan Taylor (1990) dalam Sukendi (2001) tingkat ini dinamakan pematangan (maturing).
Pada ikan gurame yang dikelompokkan ke dalam kelas ikan yang matang
gonad (2250 – 3200 g) spermatid dan spermatozoa terlihat lebih jelas. Spermatid
mulai berkembang menjadi spermatozoa. Kantung tubuli semineferi sudah diisi
pembelahan sel) berkembang menjadi spermatozoa yang fungsional. Pada saat
perubahaan spermatid menjadi spermatozoa maka sel Sertoli, sel interstial, dan sel
Leydig mulia berfungsi. Sel Sertoli mulai berfungsi untuk mensuplai nutrien bagi
spermatozoa, sedangkan sel Leydig mensekresikan hormon steroid. Amstrong et al. (1992) dalam Syandri (1996) melaporkan bahwa perkembangan testis seperti ini ditandai dengan sedikitnya jumlah spermatogonia primer dan sekunder atau
tidak ada sama sekali, spermatid jelas terlihat dan lumen berisi spermatozoa.
Menurut Murphy dan Taylor (1990) dalam Sukendi (2001) tingkat ini perkembangan ini dinamakan tingkat matang (mature). Pada perkembangan testis selanjutnya, pembentukan spermatozoa telah berakhir dan ikan siap untuk
melakukan spermiasi.
Dari hasil pengamatan perkembangan testis secara histologi dapat
menunjukkan TKG yang dialami ikan gurame tersebut. Pada ikan gurame kelas
ikan muda, perkembangan TKG ikan gurame tersebut diduga adalah TKG I.
Selanjutnya, pada TKG III sesuai dengan yang dialami perkembangan testis ikan
gurame kelas ikan dewasa. Adapun pada ikan gurame kelas ikan yang matang
gonad, perkembangan kematangan gonadnya diduga tergolong TKG IV.
Berdasarkan hasil pengamatan histologi dan disosiasi, ikan gurame uji
mengalami fase spermatogenesis yang berbeda – beda dari masing – masing kelas,
yaitu pada ikan muda fase spermatogenesis yang dialaminya adalah
spermatositogenesis, ikan dewasa mengalami miogenesis, dan ikan yang matang
mengalami spermiogenesis. Hal ini berdasarkan ada atau tidaknya tipe – tipe sel
testikular yang terdapat pada masing – masing kelas ikan gurame.
Jumlah spermatogonia ikan gurame (sekitar 120.000 – 350.000 sel) yang
didapat cukup berbeda jauh dengan jumlah spermatogonia hewan lainnya. Pada
tikus dewasa jumlah spermatogonianya lebih sedikit, yaitu 2 – 3 x 104 sel (Olive
dan Cuzin, 2004). Jumlah spermatogonia pada ikan nila yaitu 5 x 106 sel per ml
(Lacerda et al., 2008).
Dalam penelitian ini cara penghitungan jumlah spermatogonia ikan
gurame dilakukan secara kasar. Hal ini menyebabkan jumlah spermatogonia yang
diperoleh mungkin tidak menggambarkan jumlah spermatogonia yang
Leydig ikut tercampur dengan sel testikular lainnya. Selain itu, dalam proses
disosiasi terdapat sel yang belum terdisosiasi secara sempurna sehingga sel
tersebut tidak ikut dihitung. Lamanya waktu disosiasi yang tepat dan banyaknya
tripsin juga mempengaruhi sel testikular yang dapat dihitung. Waktu disosiasi
dalam penelitian ini adalah 10 menit. Kurang dari 10 menit, sel testikular sulit
untuk dihitung karena sel testikular masih banyak yang belum lepas satu sama lain
(berkoloni) dan bertumpuk – tumpuk. Adapun pada waktu lebih dari 10 menit,
mulai terlihat sel testikular yang rusak. Banyaknya tripsin yang digunakan akan
mempengaruhi aktifnya sel testikular. Semakin banyak tripsin yang digunakan
maka sel testikular akan semakin cepat rusak. Untuk membedakan tipe sel
testikular dengan tipe sel testikular lainnya dilakukan berdasarkan ukuran
diameter sel testikular tersebut. Pedoman ukuran diameter sel testikular mengikuti
Quintana et al. (2004).
Dari jumlah spermatogonia ikan gurame yang diketahui maka ikan gurame
kelas ikan muda sebaiknya dijadikan sebagai donor untuk transplantasi. Dengan
proporsi spermatogonia yang lebih tinggi dibandingkan dengan kelas ikan gurame
lainnya maka peluang keberhasilan transplantasi diduga lebih besar. Okutsu et al. (2006) menyatakan bahwa usia ikan donor yang efisien untuk aplikasi
transplantasi bisa saja bervariasi. Hal ini disebabkan proses kolonisasi,
diferensiasi, dan perkembangan sel germinal pada penelitian – penelitian
sebelumnya diketahui bervariasi pada beberapa jenis ikan.
Metode disosiasi yang dilakukan dalam penelitian ini perlu dioptimalkan.
Hal ini betujuan agar jumlah sel yang diperoleh dan yang hidup banyak. Pada
metode disosiasi ini, jumlah sel testikular yang masih hidup atau telah mati tidak
dapat diketahui. Verifikasi sel hidup dan yang mati dapat dilakukan menggunakan
pewarna Trypan Blue (TB). Dengan menggunakan pewarnaan TB maka sel testikular yang masih hidup akan transparan, sementara yang mati akan berwarna
biru.
V. KESIMPULAN
5.1Kesimpulan
Proporsi sel spermatogonia yang paling besar terdapat pada ikan gurame
dengan nilai rata – rata IKG paling kecil, yaitu 8,7025 x 10-3, yang terdapat pada
kelas ikan muda (800 – 1000 g).
5.2Saran
Jika dilakukan transplantasi maka ikan gurame yang digunakan sebagai
ikan donor sebaiknya adalah ikan gurame kelas ikan muda, yaitu sekitar 800 –
1000 g. Metode disosiasi yang dilakukan perlu dioptimalkan, seperti lamanya
DAFTAR PUSTAKA
Anonimous. Spermatogenesis. http://www.wikipedia.com [4 Januari 2009].
Blazer, V.S. 2002. Histopathological assessment of gonadal tissue in wild fishes. Fish Physiology and Biochemistry, 26: 85 – 101.
Brinster, R.L. and Zimmerman, J.W. 1994. Spermatogenesis following male germ cell transplantation. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91:11298-11302.
Cerda, J., Calman, B.G, Lafleur Jr., G.J., and Limesan, S. 1996. Pattern of vitellogenesis and follicle maturation competence during the ovarian folicular cycle of Fundulus heteroclitus. General and Comparative Endocrinology, 103: 24 – 45.
Dellmann, H.D. dan Brown, E.M. 1992. Histologi veteriner. Edisi ke–3. Hartono, R. Penerjemah. Jakarta: UI Press. Terjemahan dari: Text book of veterinery histology.
Effendie, M.I. 1992. Metoda biologi perikanan. Yayasan Agromedia. Bogor.
Ernawati, Y. 1999. Efisiensi implantasi analog LH–RH dan 17α– metiltestosteron serta pembekuan semen dalam upaya peningkatan produksi benih ikan jambal siam (Pangasius hypophthalmus). Program Pascasarjana. Institut Pertanian Bogor.
Jangkaru, Z. 2003. Memacu pertumbuhan gurami. Penebar Swadaya. Jakarta.
Johnston, D.S., Russel, L.D., and Griswold, M.D. 2000. Advances in spermatogonial stem cell transplantation. Review of Reproduction 5 : 183-188.
Lagler, K.F., Bardach, J.E., Miller, R.H., and Passino, D.R.M. 1977. Ichthyology. John Willey and Son, Inc. Toronto. Canada.
Lacerda, S.M.S.N., Batlouni, S.R., Assis, L.H., Resende, F.M., Campos – Silva, S.M., Campos – Silva, R., Segatelli, T.M., and Franca, L.R. 2008. Germ cell transplantation in tilapia (Oreochromis niloticus). Cybium, 32 suppl.: 115 – 118.
Nobrega, R.H., Batlouni, S.R., and Franca, L.R. 2009. An overview of functional and stereological evaluation of spermatogenesis and germ cell transplantation in fish. Fish Physiol. Biochem., 35:197–206.
Okutsu, T., Suzuki, K., Takeuchi, Y., Takeuchi, T., and Yoshizaki, G. 2005. Testicular germ cells can colonize sexually undifferentiated embryonic gonad and produce functional eggs in fish. Proc. Nat. Acad. Sci., 103: 2725 – 2729.
Okutsu, T., Takeuchi, Y., and Yoshizaki, G. 2006. Manipulation of fish germ cell: visualization, cryopreservation and transplantation. Journal of Reproduction and Development, 52: 685 – 693.
Okutsu, T., Takeuchi, Y., and Yoshizaki, G. 2008. Spermatogonial transplantation in fish: production of trout offspring from salmon parents. Fisheries for Global Welfare and Environment, 5th World Fisheries Congress 2008, pp. 209 – 219.
Olive, V. and Cuzin, F. 2005. The spermatogonial stem cell: from basic knowledge to transgenic technology. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 37: 246 – 250.
Ogawa, T., Arechaga, J.M., Avarbock, M.R., and Brinster, R.L. 1997. Transplantation of testis germinal cells into mouse seminiferous tubules. International Journal Development Biology, 41:111 – 122.
Prasetyaningtias, W.E. 2001. Studi histokimia lektin pada distribusi glikokonjugat di epitel tubuli seminiferi testis babi rusa Babyrousa babyrussa. Skripsi. Fakultas Kedokteran Hewan. Institut Pertanian Bogor.
Prasetyaningtias, W.E. 2006. Transplantasi testis muda sebagai upaya preservasi gonad in vivo. Laporan penelitian dosen muda. Institut Pertanian Bogor.
Quintana, L., Silva, A., Berois, N., and Macadar, O. 2004. Temperature induces gonadal maturation and affects electrophysiological sexual maturity indicators in Brachyhypopomus pinnicaudatus from a temperate climate. The Journal of Experimental Biology 207, 1843 – 1853.
Saanin, H. 1984. Taksonomi dan kunci identifikasi ikan. Jilid I dan Jilid II. Binacipta. Bandung.
Sendjaja, J.T. dan Riski, M.H. 2002. Usaha pembenihan gurami. Jakarta: Penebar Swadaya.
Sukendi. 2001. Biologi reproduksi dan pengendaliannya dalam upaya pembenihan ikan baung (Mystus nemurus CV) dari perairan sungai Kampar, Riau. Program Pascasarjana. Institut Pertanian Bogor.
Syandri, H. 1996. Aspek reproduksi ikan bilih, Mystacoleucus padangensis
Bleeker dan kemungkinan pembenihannya di Danau Singkarak. Program Pascasarjana. Institut Pertanian Bogor.
Takashima, F. and Hibiya, T. 1995. An atlas of fish histology : normal and pathological features. Second Edition. Tokyo. Kondasha Ltd.
Tang, M.U. dan Affandi, R. 2002. Biologi reproduksi ikan.
Tim Agromedia Pustaka. 2007. Panduan lengkap budidaya gurami. Jakarta: Agromedia
Yani, A. 1994. Pola reproduksi ikan bentulu (Barbichtys laevis CV, Cyprinidae, Ostariophysi) di Sungai Indragiri, Riau. Program Pascasarjana. Institut Pertanian Bogor.
i
Lampiran 2. Klasifikasi sel testikular berdasarkan ukuran dan karakteristik utamanya (Quintana et al., 2008).
Sel Testikular Diameter
(µm) Nukleus Sitoplasma Lokasi
Lampiran 3. Ilustrasi testis ikan zebra (Danio rerio) menunjukkan tiga fase berbeda dari spermatogenesis pada ikan (Nobrega et al., 2009).
Keterangan:
A und : spermatogonia A yang tidak berdiferensiasi
A : spermatogonia A
B : spermatogonia B
L/Z : spermatosit primer pada fase leptoten/zygoten P : spermatosit primer pada fase pakiten
D : spermatosit primer pada fase diploten MI : spermatosit primer pada fase metafase I S : spermatosit sekunder
MII/E1: metafase II/ spermatid awal E1 : spermatid awal
E2 : spermatid pertengahan E2 : spermatid akhir
Z : spermatozoa
