Ekspresi Gen Protease Bacillus pumilus Y1 dalam Escherichia coli DH5alfa : Orientasi Gen dan Pengaruh Penambahan IPTG (Isopropilthiogalaktosida)

S K R I P S I

EKSPRESI GEN PROTEASE

Badlus pumilus

Y

1

DALAM

Escherichia coli

DH5a: ORIENTASPGEN

DAN

PENGARUH

PENAMBAHAN

IPTG

(Isopropilthiogalaktosida)

Oleh

L I L Y

F 30.0024

1998

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

Lily. F 30.0024. EKSPRESI GEN PROTEASE Bacillus pumi7us Y1 DALAM

Escherichia coli DHScr: ORIENTASI GEN DAN PENGARUEI PENAMBAHAN

IPTG (Isopropilthiogalakto9ida). Di bawab bimbingan Dr. IT. Maggy T.

Subartono dan Dr. IT. Antonius Suwanto, MSc

Bacillus pumilus Y1 yang diisolasi dari limbah cair tahu di Indonesia

diketahui menghasilkan protease s e ~ p a subtilisin (Likumahwa, 1993; Ristiarini, 1996). Gen penghasil protease serupa subtilisin berukuran 3 kilo pasangbasa (kb) telah dicoba diklon dari B. pwnilus Y1 ke &lam Escherichia coli DH5a (Naibaho, 1997). Gen baukwan 3 kb tersebut dipotong dengan enzim restriksi EcoRI,

diligasikan pada vektor pUC19, dan ditransformasikan ke &lam E. _{coli DH5a.} Plasmid rekombinan yang dihasiikan disebut pBN1. Ekspresi protease dari pBNl temyata tidak sebaik protease asalnya. Untuk itu, dilakukan penelitian untuk mempelajari orientasi gen dan pengaruh penambahan

IPTG

(isopropilthiogalaktosida) terhadap ekspresi gen tersebut, dengan h a r a p akan

memperbaiki ekspresi dan meningkatkan produksi enzimnya.

Analisis terhadap orientasi gen pBNl dilakukan dengan meretransformasi pBNI. Plasmid dipotong dengan EcoRI, diberi perlakuan fenol dan presipitasi etanol untuk memurnikan DNA, kemudian diligasikan dan ditransformasikan kembali. Seleksi dilakukan dengan media LA+Ampisilin yang diberi

X-gal.

Dari retransformasi ini diperoleh empat koloni putih, yang selanjutnya disebut TI, T2, T3, dan T4.

Untuk mengetahui orientasi pBNl dan _{plasmid yang dibawa oleh TI, T2, T3,}

dan T4, dicari situs khusus pada pBNl yang diperoleh dengan pemotongan dengan enzim restriksi BamHI. Pemotongan pBNl dengan BamHI menghasilkan dua m e n DNA yang masing-masing berukuran 4.5 kb dan 1.2 kb. Dengan berpedoman pada letak situs BamHI pada pBNl dan pUC19 sebagai vektomya, pembalikan terhadap gen protease pBNl diperkirakan akan menghasilkan potongan DNA dengan ukuran 3.9 kb dan 1.8 kb. Penelitian &vitas protease terhadap gen dengan orientasi beriawanan ini akan menunjukkan arah orientasi gen &lam pBNl terhadap promotor lac dari vektomya. Pemotongan TI, T2, T3, dan T4 dengan

seperti pada pBNI. Dengan demikian, plasmid dengan orientasi yang berlawanan dari pBNl belum dldapatkan.

Analisis aktivitas protease pBNl dan TI setelah diberi IPTG 25 mglml

sampai konsentrasi akhir 37.5 pdml menunjukkan hasil tertinggi pada waktu

fermentasi 15 jam. Aktivitas protease dari pBNl dan TI tersebut masing-masing

adalah 0.062 Ulml dan 0.105 Ulml, sedangkan aktivitas spesifiknya masing-masing

1.069 Ulmg

dan

_{0.981 Ulmg. Aktivitas spesifik protease pUC19 sebagai kontrol juga}

menunjukkan kenaikan yang nyata dengan penambahan

IPTG,

yaitu 0.971 Ulmg

EKSPRESI GEN PROTEASE

Bacillus

pumaus

Y1

DALAM

Escherichia coli

DHSa: ORIENTASK GEN DAN PENGARUH

PENAMBAHAN IPTG

(Isopropilthiogahktosida)

Oleh:

L I L Y

F 30.0024

SKRIPSI

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN

pada JURUSAN TEKNOLOGI PANGAN DAN GIZI

Fakultas Teknologi Pertanian

Institut Pertanian Bogor

1998

JURUSAN TEKNOLOGI PANGAN DAN GIZI

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

EKSPRESI GEN PROTEASE

Bacillus pumilus

Y 1 DALAM

Escherichia coli

DHSa: ORIENTASI GEN DAN PENGARUH

PENAMBAHAN IPTG (Isopropilthiogalaktosida)

SKRIPSI

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

.."

SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN pada JURUSAN TEKNOLOGI PANGAN DAN GIZI

Fakultas Teknofogi Pertanian Institut Pertanian Bogor

Oleh: L I L Y F 30.0024

Dilahirkan pada tanggal 14 April 1975

di Bandung

Tanggal lulus: 14 Februari 1998

Menyetujui Bogor, : E k b ~ . n ₁₉₉₈

: , , , ; x , .

-

. ,

. . . " . .

, :> I

~ . . ,

~.-T) <?. , ' . Z 7 ,---

~-),y,.-~7

- ~ 7 ,;7

,-

, I' /" , /

,/

~ r . Ir.

~ a k i

T. SUMOKO Dosen Pembimbing

II

S K R I P S I

EKSPRESI GEN PROTEASE

Badlus pumilus

Y

1

DALAM

Escherichia coli

DH5a: ORIENTASPGEN

DAN

PENGARUH

PENAMBAHAN

IPTG

(Isopropilthiogalaktosida)

Oleh

L I L Y

F 30.0024

1998

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

Lily. F 30.0024. EKSPRESI GEN PROTEASE Bacillus pumi7us Y1 DALAM

Escherichia coli DHScr: ORIENTASI GEN DAN PENGARUEI PENAMBAHAN

IPTG (Isopropilthiogalakto9ida). Di bawab bimbingan Dr. IT. Maggy T.

Subartono dan Dr. IT. Antonius Suwanto, MSc

Bacillus pumilus Y1 yang diisolasi dari limbah cair tahu di Indonesia

diketahui menghasilkan protease s e ~ p a subtilisin (Likumahwa, 1993; Ristiarini, 1996). Gen penghasil protease serupa subtilisin berukuran 3 kilo pasangbasa (kb) telah dicoba diklon dari B. pwnilus Y1 ke &lam Escherichia coli DH5a (Naibaho, 1997). Gen baukwan 3 kb tersebut dipotong dengan enzim restriksi EcoRI,

diligasikan pada vektor pUC19, dan ditransformasikan ke &lam E. _{coli DH5a.} Plasmid rekombinan yang dihasiikan disebut pBN1. Ekspresi protease dari pBNl temyata tidak sebaik protease asalnya. Untuk itu, dilakukan penelitian untuk mempelajari orientasi gen dan pengaruh penambahan

IPTG

(isopropilthiogalaktosida) terhadap ekspresi gen tersebut, dengan h a r a p akan

memperbaiki ekspresi dan meningkatkan produksi enzimnya.

Analisis terhadap orientasi gen pBNl dilakukan dengan meretransformasi pBNI. Plasmid dipotong dengan EcoRI, diberi perlakuan fenol dan presipitasi etanol untuk memurnikan DNA, kemudian diligasikan dan ditransformasikan kembali. Seleksi dilakukan dengan media LA+Ampisilin yang diberi

X-gal.

Dari retransformasi ini diperoleh empat koloni putih, yang selanjutnya disebut TI, T2, T3, dan T4.

Untuk mengetahui orientasi pBNl dan _{plasmid yang dibawa oleh TI, T2, T3,}

dan T4, dicari situs khusus pada pBNl yang diperoleh dengan pemotongan dengan enzim restriksi BamHI. Pemotongan pBNl dengan BamHI menghasilkan dua m e n DNA yang masing-masing berukuran 4.5 kb dan 1.2 kb. Dengan berpedoman pada letak situs BamHI pada pBNl dan pUC19 sebagai vektomya, pembalikan terhadap gen protease pBNl diperkirakan akan menghasilkan potongan DNA dengan ukuran 3.9 kb dan 1.8 kb. Penelitian &vitas protease terhadap gen dengan orientasi beriawanan ini akan menunjukkan arah orientasi gen &lam pBNl terhadap promotor lac dari vektomya. Pemotongan TI, T2, T3, dan T4 dengan

seperti pada pBNI. Dengan demikian, plasmid dengan orientasi yang berlawanan dari pBNl belum dldapatkan.

Analisis aktivitas protease pBNl dan TI setelah diberi IPTG 25 mglml

sampai konsentrasi akhir 37.5 pdml menunjukkan hasil tertinggi pada waktu

fermentasi 15 jam. Aktivitas protease dari pBNl dan TI tersebut masing-masing

adalah 0.062 Ulml dan 0.105 Ulml, sedangkan aktivitas spesifiknya masing-masing

1.069 Ulmg

dan

_{0.981 Ulmg. Aktivitas spesifik protease pUC19 sebagai kontrol juga}

menunjukkan kenaikan yang nyata dengan penambahan

IPTG,

yaitu 0.971 Ulmg

EKSPRESI GEN PROTEASE

Bacillus

pumaus

Y1

DALAM

Escherichia coli

DHSa: ORIENTASK GEN DAN PENGARUH

PENAMBAHAN IPTG

(Isopropilthiogahktosida)

Oleh:

L I L Y

F 30.0024

SKRIPSI

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN

pada JURUSAN TEKNOLOGI PANGAN DAN GIZI

Fakultas Teknologi Pertanian

Institut Pertanian Bogor

1998

JURUSAN TEKNOLOGI PANGAN DAN GIZI

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

EKSPRESI GEN PROTEASE

Bacillus pumilus

Y 1 DALAM

Escherichia coli

DHSa: ORIENTASI GEN DAN PENGARUH

PENAMBAHAN IPTG (Isopropilthiogalaktosida)

SKRIPSI

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

.."

SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN pada JURUSAN TEKNOLOGI PANGAN DAN GIZI

Fakultas Teknofogi Pertanian Institut Pertanian Bogor

Oleh: L I L Y F 30.0024

Dilahirkan pada tanggal 14 April 1975

di Bandung

Tanggal lulus: 14 Februari 1998

Menyetujui Bogor, : E k b ~ . n ₁₉₉₈

: , , , ; x , .

-

. ,

. . . " . .

, :> I

~ . . ,

~.-T) <?. , ' . Z 7 ,---

~-),y,.-~7

- ~ 7 ,;7

,-

, I' /" , /

,/

~ r . Ir.

~ a k i

T. SUMOKO Dosen Pembimbing

II