Identifikasi Karakter Aromatik secara Molekuler dan Organoleptik pada Galur Padi BC5F2 Hasil Persilangan Ciherang dan Pandanwangi

IDENTIFIKASI KARAKTER AROMATIK SECARA MOLEKULER

DAN ORGANOLEPTIK PADA GALUR PADI BC

5

F

2

HASIL

PERSILANGAN CIHERANG DAN PANDANWANGI

MUVITA DIAH SETYANISA

DEPARTEMEN BIOKIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN

SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Identifikasi Karakter Aromatik secara Molekuler dan Organoleptik pada Galur Padi BC5F2 Hasil Persilangan Ciherang dan Pandanwangi adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Penelitian ini didanai oleh BB-Biogen atas nama Dr Tri Joko Santoso SP. MSi. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada BB-Biogen.

ABSTRAK

MUVITA DIAH SETYANISA. Identifikasi Karakter Aromatik secara Molekuler dan Organoleptik pada Galur Padi BC5F2 Hasil Persilangan Ciherang dan Pandanwangi. Dibimbing oleh I MADE ARTIKA dan REFLINUR.

Aroma pada padi menjadi bahan pertimbangan penting untuk meningkatkan selera makan konsumen. Pemetaan gen yang terpaut dengan karakter aromatik pada padi menggunakan marka molekuler dilaporkan terdapat pada lokus mikrosatelit RM223. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi karakter aromatik dari gen badh2 pada galur padi BC5F2 hasil persilangan padi Ciherang dan Pandanwangi, baik secara molekuler dengan marka RM223 maupun organoleptik dengan larutan KOH 1.7%. Berdasarkan hasil analisis seleksi pada daerah target (foreground selection), dari total 272 galur BC5F2 yang diuji, diperoleh sebanyak 105 galur yang memiliki fragmen atau pita DNA yang berukuran sama dengan tetua Pandanwangi yaitu 160 bp. Sedangkan sebanyak 46 galur memiliki pita DNA yang berukuran sama dengan tetua Ciherang (140 bp) dan 121 galur merupakan heterozigot (140 bp dan 160 bp). Hasil uji aroma dengan larutan KOH 1.7% menunjukkan adanya variasi tingkat aroma pada galur padi yang terseleksi dari skor sedikit beraroma hingga beraroma. Melalui kedua pendekatan tersebut diperoleh beberapa galur padi harapan baru dengan latar belakang Ciherang yang membawa sifat aromatik yang berasal dari Pandanwangi. Kata kunci: aroma, badh2, Ciherang, Pandanwangi, RM223

ABSTRACT

MUVITA DIAH SETYANISA. Identification of the Aromatic Character in BC5F2 rice population derived from Ciherang and Pandanwangi crosses based on Molecular and Organoleptic analysis. Supervised by I MADE ARTIKA and REFLINUR.

Aroma in rice has become an important consideration in increasing consumer appetite. Genetic mapping of molecular marker related to the responsible for fragrance in rice was previouslyreported and it was closely linked with microsatellite marker RM223. This study aimed to identify the aromatic character of the gene badh2 in BC5F2 populations derived from crosses between Ciherang and Pandanwangi, both with molecular marker RM223 and organoleptic analysis using KOH 1.7% solution. Based on the foreground selection analysis of the total 272 individual tested lines, 105 lines were found to be homozygous for Pandanwangi (160 bp), 46 lines were homozygous for Ciherang (140 bp) and 121 lines were heterozygous (140 bp and 160 bp). Evaluation of aroma with KOH in selected BC5F2 lines showed variation in quality value, such as slight, moderate, and strong aroma. Thus, through these two selection methods, we were able to select several BC5F2 lines carrying aromatic trait introgressed from Pandanwangi at target region.

Skripsi

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains

pada

Departemen Biokimia

MUVITA DIAH SETYANISA

DEPARTEMEN BIOKIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR 2013

IDENTIFIKASI KARAKTER AROMATIK SECARA MOLEKULER

DAN ORGANOLEPTIK PADA GALUR PADI BC

5

F

2

HASIL

Judul Skripsi : Identifikasi Karakter Aromatik secara Molekuler dan Organoleptik pada Galur Padi BC5F2 Hasil Persilangan Ciherang dan Pandanwangi

Nama : Muvita Diah Setyanisa NIM : G84090085

Disetujui oleh

Dr Ir I Made Artika, MAppSc Pembimbing I

Reflinur, Ph.D Pembimbing II

Diketahui oleh

Dr Ir I Made Artika, MAppSc Ketua Departemen

PRAKATA

Puji dan syukur kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian ini, serta shalawat dan salam semoga tercurahkan pada Rasulullah SAW. Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Dr Ir I Made Artika, MAppSc dan Reflinur, Ph.D, selaku pembimbing pertama dan pembimbing kedua. Terima kasih pula penulis sampaikan kepada Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian, Cimanggu-Bogor yang telah bersedia memberikan kesempatan kepada penulis untuk melaksanakan penelitian di Laboratorium Biologi Molekuler.

Penulis juga menyampaikan terima kasih kepada bapak Syamsudin Amihadi SE dan ibu Ninuk Suhartinah, kakak Mita Febtyanisa M.Si, dan keluarga atas segala doa, kasih sayang, dan motivasinya. Serta kepada Dr Tri Joko Santoso SP. M.Si, Dewi Praptiwi S.Si, Mira Sitepu, dan teman-teman semuanya yang senantiasa memberikan bimbingan, doa, dan bantuannya sehingga penelitian ini dapat diselesaikan dengan baik.

Penulis menyadari masih banyak kekurangan dalam penelitian ini. Oleh karena itu, penulis mengharapkan saran dan kritik yang membangun dan berguna dalam pelaksanaan penelitian ini. Penulis juga berharap penelitian ini dapat bermanfaat bagi semua pihak.

DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL vi

DAFTAR GAMBAR vi

DAFTAR LAMPIRAN vi

PENDAHULUAN 1

METODE 2

Bahan 2

Alat 3

Prosedur Analisis Data 3

Penumbuhan Benih Padi BC5F2 3

Isolasi DNA Padi 3

Pengukuran Kuantitas dan Kualitas DNA Padi 4

Amplifikasi DNA Padi 4

Elektroforesis Hasil Amplifikasi 4

Analisis Padi secara Organoleptik 4

HASIL DAN PEMBAHASAN 5

Hasil 5

Kuantitas dan Kualitas DNA Padi BC5F2 5

Seleksi BC5F2 secara Molekuler 5

Seleksi BC5F2 secara Organoleptik 6

Pembahasan 9

Kuantitas dan Kualitas DNA Padi BC5F2 9

Hasil seleksi BC5F2 secara Molekuler 9

Hasil seleksi BC5F2 secara Organoleptik 10

SIMPULAN DAN SARAN 13

Simpulan 13

Saran 13

DAFTAR PUSTAKA 13

LAMPIRAN 13

DAFTAR TABEL

1 Hasil kuantitas dan kemurnian DNA hasil isolasi sampel 9-12-8 5

2 Hasil scoring pita elektroforegram padi BC5F2 6

3 Hasil uji aroma tanaman padi BC5F2 9-12-8 (Kelompok I) 7 4 Hasil uji aroma semua sampel BC5F2 yang mengandung gen aroma 7

DAFTAR GAMBAR

1 Elektroforegram beberapa DNA templat hasil isolasi DNA 6 2 Elektroforegram PAGE 8% padi Ciherang-Pandanwangi BC5F2 9-12-8 7

3 Jalur pembentukan 2-AP 12

DAFTAR LAMPIRAN

1 Kuantitas DNA Padi 16

PENDAHULUAN

Kebutuhan padi yang merupakan salah satu sumber bahan makanan pokok bagi penduduk lndonesia terus meningkat dari tahun ke tahun. Menurut data BPS (2012), produksi padi tahun 2012 mengalami kenaikan sebesar 68.59 juta ton atau naik sebesar 2.84 ton (4.31%) dibandingkan tahun 2011. Pemerintah terus berupaya merealisasikan program utama ketahanan pangan, seperti usaha peningkatan produktivitas padi dalam rangka mencukupi kebutuhan pangan seluruh penduduk. Namun usaha tersebut mengalami berbagai kendala, antara lain terbatasnya terobosan teknologi baru khususnya dalam hal pengembangan varietas padi unggul serta alih fungsi lahan subur untuk kepentingan industri, perumahan dan penggunaan lahan non pertanian lainnya (Krisnamurthi 2006).

Perkembangan teknik biologi molekuler yang semakin pesat dapat menjadi solusi dalam mengatasi kendala pengembangan produktivitas padi serta mempermudah pekerjaan analisis hingga tahap molekuler (Padmadi 2009). Salah satu pengembangan tersebut yaitu melakukan analisis molekuler terhadap kualitas padi seperti karakter aromatik. Aroma pada padi menjadi bahan pertimbangan penting untuk meningkatkan selera makan konsumen, karena padi aromatik memiliki tekstur yang pulen sehingga disukai oleh konsumen (Praptiwi 2010).

Padi lokal seperti Pandanwangi dari Jawa Barat merupakan salah satu contoh padi aromatik. Padi ini dapat digunakan sebagai tetua donor dalam pembentukkan varietas unggul padi aromatik (Adijono et al. 1995). Selain memiliki aroma, padi aromatik juga memiliki harga jual yang tinggi bagi petani. Namun, sifat agronomi (produktivitas, waktu tanam, ketahanan terhadap hama dan penyakit, kemudahan tanam dan pemeliharaan) padi aromatik ini juga tidak sebaik padi nonaromatik. Hal ini menjadi kendala untuk menanam padi aromatik (Hamiseno et al. 2009). Padi Ciherang yang merupakan varietas padi nonaromatik unggul nasional dilaporkan memiliki produktivitas tinggi, tahan terhadap beberapa jenis penyakit, umur tanam singkat, dan bersifat nontransgenik (Hermanto 2006). Oleh sebab itu, Hamiseno et al. (2009) telah melakukan persilangan antara padi Ciherang (nonaromatik) dan Pandanwangi untuk memperoleh galur padi dengan komposisi genom seperti Ciherang yang memiliki produktivitas tinggi dan unggul dalam karakter agronomi lainnya, tetapi juga membawa sifat wangi (aromatik).

Identifikasi dan seleksi menggunakan marka molekuler yang lebih spesifik terpaut dengan karakter aromatik pada galur-galur turunan hasil persilangan tersebut belum dilakukan. Hal ini disebabkan karena masih dibutuhkannya pengembangan galur-galur persilangan tersebut ke generasi lebih lanjut melalui pendekatan silang balik untuk mendapatkan populasi yang cocok dalam kesuksesan identifikasi karakter aromatik yang bersifat resesif (Hamiseno et al. 2009). Lang & Buu (2008) telah berhasil memetakan marka SSR (Simple Sequence Repeats) yang terkait dengan lokus pengendali sifat aromatik pada padi. Lokus SSR tersebut adalah primer RM223 yang terletak pada kromosom 8 yang dapat membedakan antara padi aromatik-nonaromatik dan diketahui bahwa marka tersebut berkosegregasi dengan lokus target dari gen aroma.

2

pada penelitian ini dilakukan validasi primer RM223 untuk menyeleksi sifat aromatik pada galur padi BC5F2 turunan persilangan antara Ciherang dan Pandanwangi. Galur-galur yang telah terseleksi dengan marka molekuler yakni yang membawa fragmen DNA Pandanwangi pada daerah target dikonfirmasi sifat aromatiknya dengan metode pengujian secara organoleptik menggunakan larutan KOH. Pada akhirnya diharapkan dapat diperoleh galur-galur harapan baru yang membawa sifat aromatik hasil introgresi dari padi Pandanwangi dengan latar belakang Ciherang.

Penelitian ini bertujuan mengidentifikasi karakter aromatik dari gen badh2 pada galur padi BC5F2 hasil persilangan padi Ciherang dan Pandanwangi (padi nonaromatik varietas unggul yang membawa sifat aroma), baik secara molekuler dengan marka SSR maupun organoleptik dengan larutan KOH. Penelitian ini diharapkan dapat membantu dan memberikan informasi mengenai karakter aromatik pada padi galur BC5F2 Ciherang-Pandanwangi secara molekuler dan organoleptik dalam usaha perbaikan kualitas dan kuantitas varietas unggul Ciherang.

METODE

Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilaksanakan selama lima bulan mulai bulan Februari hingga Juni 2013. Tempat pelaksanaannya di laboratorium Biologi Molekuler, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian, Jalan Tentara Pelajar No.3A, Bogor.

Bahan

3 Alat

Alat yang digunakan pada penelitian ini meliputi alat-alat yang dibutuhkan untuk menumbuhkan benih padi seperti cawan petri, kertas saring, bak pembibitan, dan ember. Pada kegiatan isolasi DNA digunakan tabung mikro, alat penggerus/sumpit, satu set pipet mikro, tip pipet mikro, spin, sentrifus, coolbox, ice maker, waterbath, dan inkubator. Sedangkan alat-alat yang digunakan pada analisis PCR antara lain adalah mesin PCR Tetrad PTC-225, dan separasi serta visualisasi hasil PCR menggunakan seperangkat alat elektroforesis yang terdiri atas tangki elektroforesis, Chemidoc gel system BIORADTM, gelas piala, tabung Erlenmeyer, microwave. Selain itu juga digunakan spektrofotometer nanodrop (Thermo Scientific),neraca analitik, pinset, magnetic stirrer, autoklaf, dan vortex.

Prosedur Analisis Data Penumbuhan Benih Padi BC5F2

Penumbuhan benih padi dilakukan secara bertahap. Benih padi yang digunakan pada penelitian ini terdapat lima nomor aksesi yaitu BC5F1 9-12-8 (kelompok I), BC5F1 17-6 (kelompok II), BC5F1 17-8 (kelompok III), BC5F1 45-7-5 (kelompok IV), dan BC5F1 45-11-7 (kelompok V). Benih padi tersebut dipilih masing-masing 60 biji, kemudian disemai dan ditumbuhkan selama satu minggu di dalam cawan petri yang telah dialasi kertas saring. Penyiraman dilakukan setiap hari untuk menjaga kelembaban media kecambah. Padi yang sudah cukup tinggi dipindahkan ke dalam bak secara berkelompok. Setelah tanaman berumur dua minggu pada bak semai, tanaman dipindahkan ke dalam ember yang telah berisi tanah dan pupuk dengan komposisi yang sesuai bagi pertumbuhan padi. Selanjutnya material tanaman tersebut disimpan di rumah kaca dan dipelihara sampai galur-galur padi tersebut menyelesaikan generatifnya.

Isolasi DNA Padi

Isolasi DNA dilakukan mengikuti metode CTAB yang mengacu pada Doyle et al. (1987). Metode ini dilakukan melalui tiga tahap yaitu ekstraksi DNA, pemurnian DNA, dan pemekatan DNA. Preparasi ekstrak sel dimulai dengan menyiapkan daun padi dalam bentuk potongan kecil dan dimasukkan ke dalam tabung mikro berukuran 2 mL, kemudian ditempatkan pada suatu wadah berisi liquid nitrogen (LN). Selanjutnya, sampel daun digerus menggunakan sumpit, dan ditambahkan bufer CTAB sebanyak 800 μL. Hasil gerusan diinkubasi di dalam penangas air pada suhu 65 °C selama 15 menit dan untuk menghomogenkan bufer ekstraksi pada sampel serta penyempurnaan reaksi lisis, tabung dibolak-balik secara hati-hatipada selang waktu setiap 5 menit.

4

Pemekatan DNA dilakukan dengan penambahan Na-asetat sebanyak 70 μL (1/10 volume) dan isopropanol sebanyak 600 μL (2/3 volume) ke dalam supernatan dan dicampur perlahan. Sampel disentrifus pada kecepatan 12000 rpm selama 5 menit. Pelet yang diperoleh dicuci dengan 200 μL etanol 70 %. Campuran disentrifus kembali selama 5 menit dengan kecepatan 12000 rpm. Pelet selanjutnya dikeringkan dalam oven selama 10 menit. Pelet yang telah kering diresuspensi dalam bufer TE 1X yang mengandung ribonuklease 50 μL dan diinkubasi pada 37 °C selama 30 menit.

Pengukuran Kuantitas dan Kualitas DNA Padi

Kuantitas DNA padi dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer nanodrop. Blanko yang digunakan adalah larutan TE 1X. Sebelum digunakan lubang optik dibersihkan terlebih dahulu. Larutan TE 1X dimasukkan ke dalam lubang optik sebanyak 2 µL. Selanjutnya alat nanodrop ditutup lalu dipilih menu measure blank pada komputer. Kemudian, lubang optik dibersihkan kembali dan sebanyak 2 µL sampel DNA dimasukkan ke dalam lubang optik. Setelah itu, hasil pengukuran akan muncul dalam bentuk konsentrasi (ng/µ L) dan kemurnian DNA dapat dilihat langsung berdasarkan nilai rasio absorbansi pada panjang gelombang A280 dan A260 nm. DNA yang memiliki kemurnian paling bagus memiliki nilai OD (Optical Density) dari rasio 260/280 berada pada kisaran 1.8 hingga 2.0. Adanya kontaminan protein pada larutan DNA ditunjukan dengan nilai OD kurang dari 1.8 dan untuk menghilangkannya dapat ditambahkan proteinase. Sedangkan kontaminan RNA ditunjukan dengan nilai OD lebih dari 2.0 dan untuk menghilangkannya ditambahkan RNAse. Disamping itu, kualitas dan kuantitas DNA padi juga diuji menggunakan teknik elektroforesis gel agarosa 1% dengan cara membandingkan intensitas sampel DNA dengan marker lambda DNA tertentu yang telah diketahui konsentrasinya. denaturasi awal DNA template pada suhu 94°C selama 5 menit, diikuti dengan 35 siklus proses amplifikasi PCR dibawah parameter berikut: 30 detik proses denaturasi pada suhu 94 °C, 30 detik proses penempelan primer pada suhu 55°C, dan 45 detik proses pemanjangan primer pada suhu 72°C. Proses PCR ini diakhiri dengan proses pemanjangan akhir melalui inkubasi pada suhu 72°C selama 7 menit.

Elektroforesis Hasil Amplifikasi

5 Analisis Padi Secara Organoleptik

Galur-galur BC5F2 yang sudah terseleksi positif membawa fragmen Pandanwangi pada lokus RM223 selanjutnya dikonfirmasi sifat aromanya secara organoleptik menggunakan larutan KOH 1.7%, mengacu pada Dong et al. (2001). Analisis secara organoleptik ini meliputi uji aroma. Tahapan pengujian sifat aroma pada galur-galur tersebut diawali denganpemotongan daun padi menjadi kecil-kecil dan ditempatkan dalam plastik tertutup, serta disimpan di freezer pada suhu -20 °C atau menggunakan nitrogen cair hingga beku. Daun yang telah beku ditimbang sekitar 0.8 g kemudian ditempatkan di dalam tabung reaksi yang sebelumnya telah diisi dengan 5 ml larutan KOH 1.7 %. Kemudian tabung reaksi ditutup dengan aluminium foil dan dimasukkan ke dalam oven 50 °C selama 10 menit. Aroma daun dievaluasi oleh empat panelis dan memberi skor/nilai pada 0-3: skor 0 adalah tidak beraroma, 1 adalah aroma samar, 2 aroma yang sedang, dan 3 merupakan aroma yang kuat. Nilai dari masing-masing panelis dirata-rata dan dibedakan menjadi tiga kelompok, yaitu aromatik (skor> 1.0), sedikit aromatik (skor 0.6-1.0), dan tidak aromatik (skor <0.5).

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil Kuantitas dan Kualitas DNA Padi BC5F2

Uji kuantitas DNA dilakukan untuk mengetahui konsentrasi dan kemurnian DNA sampel yang diperoleh dari hasil isolasi. Konsentrasi DNA galur 9-12-8 pada Tabel 1 yang diperoleh dari hasil pengukuran menggunakan nanodrop berada pada rentang 1000-4000 ng/µ L dan kemurniannya berada pada rentang 1.8-2.0. Gambar 1 menunjukkan hasil uji kualitas beberapa DNA padi BC5F2 9-12-8 hasil isolasi. Elektroforegram tersebut menunjukkan adanya pita DNA dan pola pita DNA yang sudah murni. Lambda DNA yang telah diketahui konsentrasinya digunakan sebagai pembanding.

Tabel 1 Hasil kuantitas dan kemurnian DNA hasil isolasi sampel 9-12-8

6

Seleksi BC5F2 secara Molekuler

Seleksi galur-galur tanaman padi pada generasi BC5F2 yang membawa segmen target yang berasal dari tetua donor (Pandanwangi) menggunakan primer RM223 telah berhasil dilakukan. Kelompok I terdiri atas 58 galur, kelompok II berjumlah 56 galur, kelompok III berjumlah 56 galur, kelompok IV berjumlah 53 galur, dan kelompok V berjumlah 49 galur (Tabel 2). Hasil PCR (amplikon) menunjukkan bahwa masing-masing sampel menghasilkan ukuran pita DNA yang berbeda-beda (Gambar 2). Berdasarkan hasil analisis seleksi pada daerah target (foreground selection), dari total 272 galur BC5F2 yang diuji, diperoleh sebanyak 105 galur yang memiliki fragmen atau pita DNA yang berukuran sama dengan tetua donor (Pandanwangi). Sedangkan sebanyak 46 galur memiliki pita DNA yang berukuran sama dengan tetua Ciherang dan 121 galur merupakan heterozigot yang memiliki dua pita (160 bp dan 140 bp). Diantara 105 galur terseleksi, sebanyak 7 galur (12.07%) berasal dari dari kelompok I, 18 galur (33.96%) berasal dari kelompok II, 9 (16.07%) berasal dari kelompok III, 50 galur (100%) berasal dari kelompok IV, dan 15 (30.61%) berasal dari kelompok V.

Tabel 2 Hasil scoring pita elektroforegram padi BC5F2

Sampel Jumlah Hasil scoring

Ciherang Pandanwangi Heterozigot

I (9-12-8) 58 14 (24.14%) 7 (12.07%) 37 (63.79%)

II (17-6) 53 11 (20.75%) 18 (33.96%) 24 (45.28%)

III (17-8) 56 9 (16.07%) 9 (16.07%) 38 (68.86%)

IV (45-7-5) 56 - 56 (100%) -

V (45-11-7) 49 12 (22.49%) 15 (30.61%) 22 (44.89%)

Total 272 46 105 121

7

Seleksi BC5F2 secara Organoleptik

Uji aroma menggunakan larutan KOH ini mengikutsertakan beberapa sampel sebagai pembanding yang memiliki fragmen heterozigot, sampel yang mengikuti tetua Ciherang, dan kontrol tetua (Ciherang sebagai kontrol negatif dan Pandanwangi sebagai kontrol positif sifat aromatik). Sebanyak empat panelis diminta untuk memberikan penilaian terhadap aroma sampel sehingga diperoleh skor evaluasi masing-masing sampel. Pada Tabel 2 disajikan hasil scoring evaluasi tingkat aroma dari sampel yang diuji. Hasil pengujian seluruh sampel yang mengandung gen aroma menunjukkan adanya variasi tingkat aroma pada galur terseleksi, dari skor sedikit beraroma sampai beraroma (Tabel 3).

Tabel 3 Hasil uji aroma tanaman padi BC5F2 9-12-8

* sampel padi yang mengikuti tetua ciherang ** sampel padi heterozigot

+++ : beraroma, ++ : sedikit beraroma, - : tidak beraroma

Gambar 2 Elektroforegram padi Ciherang-Pandanwangi BC5F2 9-12-8. Marker: DNA 50bp; (cih): padi Ciherang; (pw): padi Pandanwangi; (nomor 1-58): padi BC5F2 9-12-8 atau kelompok I.

160 bp 140 bp

8

Tabel 4 Hasil uji aroma seluruh sampel BC5F2 yang mengandung gen aroma

Sampel positif RM223 Skor evaluasi KOH

I.1 +++

9 Pembahasan

Pandanwangi merupakan padi aromatik varietas lokal yang telah terkenal sejak tahun 1973 di pasaran beras lokal maupun internasional. Aroma yang menyerupai pandan merupakan karakter paling menarik dari padi Pandanwangi. Aroma tersebut berasal dari 2-acetyl-1-pyrroline (Natalia 2007). Menurut Buttery et al. (1983) komponen ini juga merupakan komponen yang mudah menguap dari daun pandan (Pandanus amaryllifolius). Pandanwangi merupakan varietas javanica dengan ciri bulat, berbulu, tahan rontok, dan usia tanam 155 hari dan tingginya mencapai 168 cm. Pandanwangi mengandung kadar amilosa 24.96% dan bertekstur pulen. Akan tetapi, padi Pandanwangi memiliki kekurangan dimana tingkat produktivitasnya rendah dan tidak tahan terhadap hama dan penyakit (Deptan 2004).

Padi Ciherang merupakan kelompok padi sawah varietas unggul populer hasil beberapa kali persilangan, yang mempunyai produktivitas tinggi dan nontransgenik (Hermanto 2006). Padi Ciherang memiliki karakteristik umur tanamannya cukup singkat yaitu 116 hingga 125 hari, bentuk tanaman tegak, tingginya mencapai 107 hingga 115 cm, menghasilkan anakan produktif 14 hingga 17 batang, warna batang hijau, warna daun hijau, muka daun kasar pada sebelah bawah, posisi daun tegak, bentuk gabah panjang ramping, warna gabah kuning bersih, tekstur nasi pulen, kadar amilosa 23%, bobot 1000 butir 27-28 g, rata-rata produksi 5-8,5 ton/ha, tahan terhadap bakteri hawar daun (HDB) strain III dan IV, tahan terhadap wereng coklat biotipe 2 dan 3 (LITBANG 2006).

Introgresi sifat aroma dari padi Pandanwangi ke dalam genom Ciherang dapat menghasilkan varietas dengan sifat agronomi yang sama dengan karakter tanaman induk (Ciherang) ditambah dengan sifat aroma dari tanaman donor Pandanwangi. Hamiseno et al. (2009) telah melakukan persilangan antara Ciherang dan Pandanwangi hingga memperoleh tanaman hasil persilangan (F1). Mereka juga melakukan proses persilangan balik antara F1 dan tetua induk. Proses ini dilakukan sampai silang balik yang kelima (BC5F1) agar mendapatkan tanaman hasil persilangan yang stabil jika dilakukan pembuahan sendiri (selfing), karena menghasilkan sifat yang mendekati 98.4% tetua induk (Mackill et al. 2007). Selfing ini dilakukan untuk mendapatkan turunan homozigot resesif (BC5F2) sebab aroma timbul jika gen aroma dalam keadaan homozigot resesif (Bradbury et al. 2005a).

Seleksi secara molekuler berbasis PCR dilakukan terhadap tanaman hasil persilangan untuk menyeleksi tanaman yang positif mengandung gen aroma yaitu gen badh2. Proses seleksi ini dilakukan pada setiap tanaman hasil silang balik. Setelah didapatkan BC5F2 masih harus dilakukan identifikasi gen aroma untuk memastikan bahwa tanaman yang dihasilkan memiliki gen aromatik. Sebelum dilakukan proses PCR dan seleksi lebih lanjut, DNA padi BC5F2 harus diketahui kuantitasnya untuk mempermudah proses tersebut.

Kuantitas dan Kualitas DNA Padi BC5F2

10

mendegradasi senyawa-senyawa metabolit sekunder yang terdapat dalam tanaman dan membantu hidrolisis membran sel dengan baik dalam proses isolasi DNA. Selain itu, CTAB dalam bufer ekstraksi berfungsi untuk mengurangi senyawa polisakarida yang juga merupakan kontaminan pada proses isolasi sehingga diharapkan kemurnian DNA yang diperoleh akan lebih tinggi.

Hasil uji kuantitas DNA berupa kuantitas dan kemurnian DNA padi. Konsentrasi DNA padi BC5F2 yang diperoleh relatif besar yaitu berada pada rentang 1000-4000 ng/μL. Konsentrasi DNA yang diperlukan untuk amplifikasi tidak begitu besar, sehingga konsentrasi yang sudah diperoleh cukup untuk amplifikasi. Konsentrasi DNA yang diperoleh tidak seragam. Oleh karena itu, konsentrasinya diseragamkan dengan pengenceran menjadi 50 ng/μL. Hal tersebut dilakukan untuk menjamin bahwa jumlah DNA yang akan diamplifikasi dengan PCR mempunyai konsentrasi yang sama. Hasil kemurnian DNA padi BC5F2 menunjukkan bahwa DNA padi tersebut sudah murni karena berada pada rentang 1.8-2.0 (Sambrook dan Russel 1989).

Hasil uji kualitas DNA beberapa padi BC5F2 9-12-8 berupa elektroforegram (Gambar 1) menunjukkan adanya pita DNA dan pola pita DNA yang sudah murni. Hal ini dibuktikan tidak adanya pita atau band lainnya selain pita DNA. Elektroforesis sampel padi menggunakan pembanding berupa DNA lambda yang sudah diketahui konsentrasinya. Konsentrasi DNA lambda ini juga dapat digunakan untuk mengetahui konsentasi DNA namun tidak dilakukan karena ketebalan pita DNA sampel berbeda dengan DNA lambda. Konsentrasi DNA lambda yang digunakan 75, 100, dan 200 ng/μL.

Hasil seleksi BC5F2 secara Molekuler

Berdasarkan penelitian sebelumnya oleh Nasodikin (2013), primer RM223 dapat membedakan pola amplifikasi yang disebabkan oleh adanya polimorfisme pada kromosom 8 antara padi Ciherang dan Pandanwangi dengan jelas. Primer ini terdiri atas primer forward (GAGTGAGCTTGGGCTGAAAC) dan reverse (GAAGGCAAGTC- TTGGCACTG) (Lang & Buu 2008).

Primer RM223 dapat mengamplifikasi DNA padi Ciherang yang nonaromatik dengan ukuran basa sebesar 160 bp dan padi Pandanwangi yang aromatik dengan ukuran basa sebesar 140 bp sehingga sampel padi yang heterozigot akan menghasilkan dua pita yaitu pada ukuran 160 bp dan 140 bp. Hal ini sesuai dengan hasil penelitian pada Gambar 2 yang menunjukkan 14 sampel mengikuti tetua Ciherang ukuran 160 bp, 7 sampel mengikuti tetua Pandanwangi dengan ukuran 140 bp. Sedangkan 37 sampel menghasilkan dua pita yaitu 160 bp dan 140 bp (heterozigot).

11 galur menggunakan sejumlah primer SSR yang meliputi semua kromosom padi. Apabila hasil seleksi background menunjukkan tidak ada perbedaan komposisi genomik pada masing-masing galur tersebut, berarti galur-galur tersebut sebenarnya memiliki genotipe yang sama dan untuk pengembangan selanjutnya cukup dipilih salah satu galur.

Hasil penelitian Bradbury (2005b) menunjukkan bahwa gen yang menyandi protein betain aldehid dehidrogenase (BADH2) memiliki polimorfisme di daerah ekson pada genotip tanaman. Polimorfisme gen tersebut terdiri atas gen badh1 dan gen badh2 yang memiliki kesamaan bentuk namun berbeda fungsinya. Gen badh1 disandi oleh kromosom nomor 4 yang berkaitan dengan toleransi tanaman ketika dalam kondisi cekaman. Gen ini terdapat pada tanaman padi, jagung, jelai, dan sorgum. Gen badh2 terdapat di kromosom nomor 8 yang berperan dalam menimbulkan aroma pada tanaman padi (Bradbury 2005b), sehingga gen aroma ini terkait dengan primer RM223 yang letaknya juga di kromosom 8. Akumulasi senyawa 2-asetil-1-pirolin (2-AP) disebabkan oleh berkurangnya aktivitas enzim BADH2. Adanya mutasi delesi 8 basa pada padi aromatik mengakibatkan stop kodon (TAA) lebih awal dan diduga adanya delesi tersebut menyebabkan aktivitas enzim BADH2 pada tanaman menjadi berkurang (Bradbury et al. 2005a).

Sampel DNA hasil PCR diseparasi dengan teknik elektroforesis vertikal menggunakan gel poliakrilamid 8%. Menurut Sudjadi (2008) keunggulan gel poliakrilamid dibanding gel agarosa adalah kekuatan pemisahannya sangat besar sehingga dapat memisahkan satu pasang basa dalam 500 pasang basa, dan dapat menampung jumlah sampel yang lebih banyak.

Hasil seleksi BC5F2 secara Organoleptik

Galur-galur yang membawa gen aromatik dari hasil seleksi primer RM223 selanjutnya diuji aromanya menggunakan larutan KOH 1.7%. Menurut Sarhadi et al. (2009) uji aroma pada daun padi menggunakan larutan KOH untuk membedakan padi aromatik dan nonaromatik. Penggunaan larutan KOH 1.7% pada uji aroma disebabkan larutan ini dapat membantu senyawa aromatik mengeluarkan aroma. Meskipun uji aroma ini dapat mengakibatkan kerusakan pada bagian rongga nasal di hidung, bersifat subjektif (Lorieux et al. 1996). Namun metode ini hanya digunakan untuk mengkonfirmasi kembali galur-galur padi yang positif mengandung gen aromatik sehingga diperoleh galur yang beraroma.

12

dan nonaromatik dibedakan berdasarkan sekuen DNA yang terdelesi pada kromosom 8 (Bradbury et al. 2005a).

Hasil pengujian juga menunjukkan adanya galur-galur yang secara molekuler positif membawa fragmen Pandanwangi pada lokus RM223, tetapi pada skor evaluasi tidak beraroma (Lampiran 3). Hal ini kemungkinan disebabkan sifat yang mudah menguap dari senyawa aromatik (2-AP) sehingga pada saat panelis melakukan penilaian sifat aroma sudah tidak terdeteksi. Oleh sebab itu galur-galur yang telah terseleksi tersebut perlu diuji lebih lanjut sifat aromatiknya (aroma nasi). Sebaliknya ada pula yang menunjukkan bahwa galur-galur yang mengikuti pola tetua Ciherang pada lokus RM223, ternyata diskor sedikit beraroma oleh panelis. Hal ini dapat terjadi karena ada kemungkinan sifat aroma yang berasal dari Pandawangi juga terintrogresi pada lokus yang berbeda selain dari RM223. Akan tetapi yang menjadi fokus seleksi atau target pada penelitian ini adalah pada lokus RM223. Jadi hanya galur-galur padi yang terseleksi positif mengikuti tetua pandanwangi pada lokus RM223 saja yang akan dipilih dan dipelihara untuk dikembangkan pada generasi berikutnya.

Akumulasi dari senyawa 2-AP dalam genotip padi aromatik dapat disebabkan oleh adanya mutasi delesi pada ekson 7 yang mengakibatkan stop kodon sehingga menyebabkan hilangnya aktivitas enzim BADH2 dalam mengkatalisis proses konversi prolin menjadi asam gama-aminobutirat (GABA) (Lorieux et al. 1996, Bradbury et al. 2005a). Penghambatan lintasan ini akan meningkatkan ketersediaan prolin untuk mensintesis 2-AP (Bradbury et al. 2005a,b). Berbeda dengan padi non aromatik, pada kromosom nomor 8 tidak terjadi delesi ekson 7 sehingga prolin lebih mengarah ke pembentukan asam gama-aminobutirat dan pembentukan 2-asetil-1-pirolin lebih sedikit (Lorieux et al. 1996).

13 Jalur pembentukkan 2-asetil-1-pirolin (Gambar 3) dimulai dari pemecahan prolin menjadi putresin kemudian membentuk senyawa gama-aminobutiraldehid (GABald), sebuah substrat dari enzim BADH2. Jika enzim BADH2 aktif, maka enzim ini dapat mengubah GABald menjadi asam gama-aminobutirat (GABA), tetapi jika enzim BADH2 tidak aktif, GABald mengalami asetilasi (penambahan gugus asetil) membentuk 2AP (Bradbury et al. 2005b). Prolin pada tanaman berfungsi sebagai zat pelindung terhadap kerusakan daun ketika terjadi dehidrasi. Prolin diakumulasi dalam jumlah yang sangat tinggi di dalam daun ketika tanaman terpapar oleh cekaman kekeringan atau terdapatnya kandungan garam yang tinggi di dalam tanah (Heldt 2005).

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Identifikasi karakter aromatik secara molekuler dan organoleptik pada tanaman padi BC5F2 hasil persilangan Ciherang dan Pandanwangi telah berhasil dilakukan. Primer RM223 telah berhasil melacak introgresi gen aroma tanaman padi Pandanwangi ke dalam genom padi Ciherang, dibuktikan dengan teramplifikasinya DNA padi BC5F2 pada 140 bp dan 160 bp. Aroma pada padi BC5F2 yang membawa gen aroma dengan uji aroma menggunakan larutan KOH dapat terdeteksi oleh panelis.

Saran

Perlu dilakukan seleksi lanjutan untuk mengetahui letak gen aroma yang berada di kromosom 8, dan seleksi background untuk memperoleh varietas baru yaitu ciherang yang membawa sifat aroma sehingga kualitas dan kuantitas padi unggul Ciherang dapat diperbaiki dan ditingkatkan. Selain itu, perlu juga dilakukan penentuan urutan basa nukleotida pada padi aromatik dan padi non-aromatik varietas lokal asli Indonesia sehingga dapat menentukan primer yang lebih spesifik lagi dalam menentukan padi aromatik dan padi non-aromatik tersebut.

DAFTAR PUSTAKA

14 for fragrance in rice. Plant Biotechnology. 3(3): 363–370.

Bradbury LMT, Henry RJ, Jin Q, Reinke RF, Waters DLE. 2005b. A perfect marker for fragrance genotyping in rice. Mol Breed. 16(4): 279–283.

Buttery RG, Ling LC, dan Juliano BO. 1983. Identification of Rice Aroma Compound 2-acety-1-pyrroline in Pandan Leaves. J Agric Food Chem. 31: 823-826.

[DEPTAN] Departemen Pertanian. 2004. Keputusan Menteri Pertanian Nomor 163 Tahun 2004 tentang Pelepasan Galur Padi Sawah Lokal Pandanwangi Cianjur sebagai Varietas Unggul dengan Nama Pandanwangi. Jakarta (ID): Deptan.

Dong Y, E Tsuzuki, and H Terao. 2001. Genetic analysis of aroma in three rice cultivars (Oryza sativa L.). J Genet Breed. 55: 39-44.

Doyle JJ, Doyle JL. 1987. A rapid DNA isolation from small amount of fresh leaf tissue. J Phytachem Bull 19: 11-15.

Hamiseno DS, Santoso TJ, Trijatmiko KR, Padmadi B, Praptiwi D. 2009. Kontruksi Padi Nonaromatik yang Beraroma Wangi Menggunakan PCR Berbantuan Marka Gen BADH2.Prosiding Seminar Hasil-hasil Penelitian IPB 2009. 8: 678-688.

Heldt W. 2005. Plant Biochemistry. German: Elvesier All Right Reserved.

Hermanto. 2006. Padi Ciherang Makin Populer. Warta Litbang PI [Internet]. [diunduh 2013 Feb 7]; 28(2): 14-15. Tersedia pada: pustaka.litbang.deptan.go.id/bppi/lengkap/wr282068.pdf.

Krisnamurthi B. 2006. Produksi Padi Nasional Naik Minimum Sama Dengan Kenaikan Penduduk 1,5 %. Sinartani. 36(3140): 5.

Lang NT, Buu BC. 2008. Development of PCR based markers for aroma (fgr) gene in rice (Oryza sativa L.). J Omonrice 16: 16-23.

Lestari AP, Abdullah B, Junaedi A, Aswidinnoor H. 2011. Performance of grain quality and aroma of aromatic new plant type promising rice lines. Indones J Agricultural Sci. 12(2): 84-93.

[LITBANG] Balai Penelitian Bahan Pangan.2006. Mengenal padi VUTB Fatmawati.http://jakarta.litbang.depta n.go.id/klinika gribisnis. J Litbang 12:1-6.

Lorieux M, Petrov M, Huang N, Guiderdoni E, Ghesquiere A. 1996. Aroma in rice: genetic analysis of a quantitative trait. Theor App Genet. 93:1145–1151. Nasodikin M. 2013. Identifikasi Gen Aroma pada Padi BC5F1

Ciherang-Pandanwangi dan BC4F1 Ciherang-Mentikwangi [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Bogor.

Natalia. 2007. Karakterisasi Beras Pandanwangi dan Pengaruh Jenis Kemasan Terhadap Stabilitas Mutu Selama Penyimpanan [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Bogor.

15 Praptiwi D. 2010. Pembentukan dan Seleksi F1 Padi Ciherang-Pandanwangi dan Fatmawati–Mentikwangi Menggunakan Marka Aromatik [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.

Sarhadi WA, T Ookawa, T Yoshihashi, AK Madadi, W Yosofzai, Y Oikawa, and Y Hirata. 2009. Characterization of aroma and agronomics traits in Afghan ative rice cultivar. Plant Prod Sci. 12(1): 63-69.

18

No Sampel Konsentrasi DNA (ng/µL) 260/280

98 II42 5525.8 1.94

99 II43 8916.3 2.02

100 II44 10498.9 2.02

101 II45 9578.8 2.02

102 II46 9127.6 2.03

103 II47 10315.8 1.99

104 II48 9192.7 1.98

105 II49 4307.7 1.97

106 II50 9036.3 2.01

107 II51 9264.2 2.01

108 II52 5495.2 1.95

109 II53 4207.7 1.98

19 Lampiran 2 Elektroforegram PAGE 8% padi BC5F2 17-6 (sampel II), 17-8

20

Lampiran 3 Hasil uji aroma tanaman padi BC5F2 kelompok II-V

No Galur _Panelis Rata-rata Skor evaluasi

rata-rata

No Galur Panelis Rata-rata Skor evaluasi

21

No Galur Panelis Rata-rata Skor evaluasi

rata-rata

No Galur _Panelis Rata-rata Skor evaluasi

rata-rata

22

Lampiran 4 Komposisi larutan yang digunakan dalam penelitian Bufer CTAB

Bahan kimia Jumlah (untuk 1 L) Jumlah (untuk 500 mL)

Tris-Cl pH 8 (1 M) 100 mL 50 mL

EDTA 0.25 M 80 mL 40 mL

NaCl 5 M 280 mL 140 mL

CTAB 20 g 10 g

PVP 20 g 10 g

β-Mercaptoetanol 2 mL 1 mL

dH2O ~530 mL ~260 mL

Larutan PAGE (Poliakrilamid Gel Elektroforesis) 40% untuk 500mL

Bahan-bahan Jumlah

Akrilamid 190 gram

Bis-akrilamid 10 gram

dH2O Tera hingga 500 mL

Larutan PAGE (Poliakrilamid Gel Elektroforesis) 8% untuk 1 liter

Bahan-bahan Jumlah

40% akrilamid 200 mL

TBE 10x 50 mL

dH2O 750 mL

Larutan TBE (Tris Borat EDTA) 10x untuk 1 liter

Bahan-bahan Jumlah

Trisma-base 108 gram

EDTA (ethylenediaminetetraacetate) 9.2 gram

Boric Acid 55.2 gram

dH2O 827.6 mL

Gel poliakrilamid untuk 1 kali running

Bahan-bahan Jumlah

Larutan PAGE 8% 50 mL

APS(amonium persulfat) 10% 500 µL

23

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Pulau Gebe provinsi Maluku Utara pada tanggal 4 September 1991 dari ayah Syamsudin Amihadi, SE dan Ibu Ninuk Suhartinah. Penulis merupakan putri kedua dari dua bersaudara. Penulis menyelesaikan pendidikan menengah atas di SMAN 1 Pomalaa, Sulawesi Tenggara tahun 2009. Pada tahun yang sama, penulis meneruskan pendidikan di Departemen Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.