ISOLASI DAN SELEKSI BAKTERI TERMOFILIK
PEREDUKSI KROMIUM HEKSAVALEN DARI LIMBAH
PENGOLAHAN BATIK
WIJIASTUTI
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Isolasi dan Seleksi Bakteri Termofilik Pereduksi Kromium Heksavalen dari Limbah Pengolahan Batikadalah benar karya saya denganarahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
RINGKASAN
WIJIASTUTI. Isolasi dan Seleksi Bakteri Termofilik Pereduksi Kromium Heksavalen dari Limbah Pengolahan Batik. Dibimbing oleh I MADE ARTIKA dan NOVIK NURHIDAYAT.
Kromium heksavalen (CrVI) dalam keadaan teroksidasi bersifat toksik karsinogen pada manusia. Kromium banyak digunakan dalam berbagai industri, sehingga Cr(VI) juga dapat ditemukan pada limbah-limbah hasil dari industri tersebut. Limbah logam berat Cr(VI), merupakan salah satu jenis limbah berbahaya, karena tingginya toksisitas Cr(VI) yaitu jauh lebih tinggi dibandingkan toksisitas (III).
Penelitian ini dilakukan untuk mengisolasi bakteri alami pada limbah pengolahan batik yang bepotensi mereduksi Cr(VI) karena memiliki gen penyandi enzim kromat reduktase. Identifikasi gen penyandi kromat reduktase dilakukan dengan menggunakan metode qPCR. Hasil menunjukkan bahwa diperoleh 3 (tiga) isolat yaitu isolat Bacillus sp., Pseudomonas sp. dan Geobacillus sp. yang memiliki gen penyandi enzim kromat reduktase. Oleh karena itu terhadap ketiga isolat tersebut dilakukan uji aktivitas reduksi Cr(VI),
Hasil analisis qPCR, menunjukkan bahwa isolat Bacillus sp. diduga memiliki aktivitas reduksi paling baik. Selanjutnya hasil uji aktivitas reduksi Cr(VI) oleh ketiga isolat menunjukkan bahwa aktivitas tertinggi terjadi pada suhu inkubasi 50°C, yang diikuti oleh 40°C dan 30°C. Aktivitas reduksi isolat Bacillus sp.optimal pada pH 7 dengan nilai reduksi 97 %,isolat Pseudomonas sp.optimal pada pH 5dengan nilai reduksi mencapai 59.36 % dan aktivitas reduksi isolat Geobacillus sp. optimal pada pH 5 dengan nilai reduksi mencapai 59 % Cr (VI) yang tereduksi.
Analisis optimasi terhadap aktivitas reduksi Bacillus sp.menggunakan Surface Respon Analysis(SRA) Minitab 16 diperoleh hasil perlakuan pH, konsentrasi dan suhu inkubasi menunjukkanperbedaan yang signifikan (P< 0.05). Hasil tersebut menunjukkan bahwa masing-masing perlakuan yaitu pH, konsentrasi dan suhu inkubasi berpengaruh terhadap aktivitas reduksi. Interaksi suhu-konsentrasi dan interaksi pH-konsentrasi juga memberikan hasil yang berbeda nyata (P<0.05), yang berarti kedua interaksi tersebut berpengaruh terhadap aktivitas reduksi.Hasil analisis optimasi aktivitas reduksi padaPseudomonas sp.menggunakan Minitab 16 menunjukkan bahwa perlakuan pH,konsentrasi kromium, suhu inkubasidan interaksi konsentrasi kromium-suhu berpengaruh nyata (P< 0.05). Sedangkan uji statistik terhadap aktivitas reduksi isolat Geobacillus sp. menunjukkan perlakuan suhu inkubasi berbeda nyata (P< 0.05), artinya perlakuan suhu inkubasi memberikan pengaruh yang signifikan terhadap aktivitas reduksi. Interaksi suhu-konsentrasi juga memberikan hasil yang berbeda nyata (P<0.05), yang berarti interaksi antara suhu dan konsentrasi juga memberikan aktivitas reduksi yang berbeda.
SUMMARY
WIJIASTUTI. Isolation and Selection of Thermophilic Bacteria as Hexavalent Chromium Reducers from Batik Processing Wastewater. Supervised by I MADE ARTIKA AND NOVIK NURHIDAYAT.
Hexavalent chromium (Cr VI) in the oxidized state is toxic carcinogen in humans. Chromium is widely used in various industries, so that Cr (VI) can also be found in wastes from the industry. Heavy metal Cr (VI) waste, is one type of hazardous wastes, due to the high toxicity of Cr (VI) which is much higher than that of Cr (III).
This study was conducted to isolat naturally occurring bacteria from batik processing wastewater with potency to reduce Cr (VI) because of the presence of chromate reductase coding genes. Identification of chromate reductase gene was conducted using qPCR. The results obtained showed that 3 (three) isolats namely isolats Bacillus sp., Pseudomonas sp. and Geobacillus sp. have chromate reductase coding genes. Based on the results of qPCR analysis, isolats of Bacillus sp. was predicted to have the highest reduction activity.
Cr (VI) reduction by three isolats showed that the highest activity occurred at incubation temperature of 50 ° C, followed by 40 ° C and 30 ° C. The reduction activity of Bacillus sp., was optimum at pH 7 with a 97% reduction level, Pseudomonas sp. was optimum at pH 5 with a reduction value of 59.36% and reduction of activity in isolats Geobacillus sp. was optimum at pH 5 with reduction level of 59%.
Analysis of optimization of the reduction activity of Bacillus sp.using Surface Respon Analysis (SRA)obtained in Minitab 16 treatment results in pH, concentration and temperature of incubation showed significant differences (P <0.05). These results indicated that each treatment in that pH, concentration and incubation temperature affect on the reduction of activity. Interaction of temperature-concentration and pH-concentration interaction also results in significantly different (P <0.05), which means that both of these interactions affect the activity reduction. The results of the optimization analysis of reduction in Pseudomonas sp. activity using Minitab 16 showed that treatment of pH, concentration of chromium, incubation temperature and concentration of chromium-temperature interaction significantly (P <0.05). While the statistical test to isolatGeobacillus sp. reduction activity showed the incubation temperature treatment were significantly different (P <0.05), meaning that the incubation temperature treatment have a significant influence on the activity reduction. Interaction of temperature-concentration also results in significantly different (P <0.05), which means that the interaction between temperature and concentration also gives a different reduction activity.
Retrieved 3 (three) isolats, namely the isolats of Bacillus sp., Pseudomonas sp. and Geobacillus sp. which have a chromate reductase gene. Characterization results with qPCR showed isolats ofBacillus sp. potentially better than the Pseudomonas sp. and Geobacillus sp.isolats.Bacillus sp. is a thermophilic isolate with optimum Cr(VI) reduction activity at pH 7.
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains
pada
Program Studi Biokimia
ISOLASI DAN SELEKSI BAKTERI TERMOFILIK
PEREDUKSI KROMIUM HEKSAVALEN DARI LIMBAH
PENGOLAHAN BATIK
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR 2015
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Prof. Dr. drh. Maria Bintang MS.
Judul Tesis :Isolasi dan Seleksi Bakteri Termofilik Pereduksi Kromium Heksavalen dari Limbah Pengolahan Batik
Nama : Wijiastuti
NIM : G851124031
Disetujui oleh Komisi Pembimbing
Dr. I. Made Artika MAppSc Ketua
Ir. Novik Nurhidayat PhD. Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi Komunikasi Pembangunan Pertanian dan Pedesaan
Prof. Dr.drh.Maria Bintang, MS.
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas segala karunia-Nya sehingga tesis ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Juni 2014 ini ialah isolasi dan seleksi bakteri termofilik pereduksi kromium heksavalen dari limbah pengolahan batik.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr. I. Made Artika MAppSc dan Bapak Ir. Novik Nurhidayat PhD. selaku pembimbing, serta Bapak Drs Ikna S. Jalip MS dan Drs Yeremiah RC. MS, yang telah banyak memberi saran. Di samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada seluruh staf Laboratorium Genetika dan Biokimia, Pusat Penelitian dan Pengembangan Biologi, LIPI yang telah membantu selama pengumpulan data.
Penghargaan dan ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada suami, putriku,bapak, mama, adik serta seluruh keluarga, atas pengertian,doa dan kasih sayangnya sehingga tesis ini dapat terselesaikan
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
DAFTAR ISI
1 PENDAHULUAN 1
Latar Belakang 2
Perumusan Masalah 2
Tujuan Penelitian 2
Manfaat Penelitian 2
Ruang Lingkup Penelitian 2
2 TINJAUAN PUSTAKA 2
3 METODE 4
Bahan 4
Alat 5
Cara kerja 5
4 HASIL DAN PEMBAHASAN 7
Hasil 7
Pembahasan 16
5 KESIMPULAN DAN SARAN 21
Kesimpulan 21
Saran 21
DAFTAR PUSTAKA 22
LAMPIRAN 25
DAFTAR TABEL
1 Isolat hasil isolasi dari limbah pengolahan batik 7
2 Karakter biokimia pertumbuhan koloni dan morfologi 9
DAFTAR GAMBAR
1 Isolasi bakteri dari limbah pewarnaan batik 72 Pola amplifikasi gen chromate reductase dari tiap isolat bakteri terseleksi 8
3 Aktivitas reduksi isolat Bacillus sp.1a. pada pH 5 9
4 Aktivitas reduksi isolat Bacillus sp.1a. pada pH 7 10
5 Aktivitas reduksi isolat Bacillus sp.1a. pada pH 9 10
6 Surface plot dari interaksi reduksi, suhu dan konsentrasi pada aktivitas reduksi Cr (VI) oleh isolat Bacillus sp.1a. 11
7 Aktivitas reduksi isolat Pseudomonas sp.1b. pada pH 5 12
8 Aktivitas reduksi isolat Pseudomonas sp.1b. pada pH 7 12
9 Aktivitas reduksi isolat Pseudomonas sp.1b. pada pH 9 13
10 Surface plot dari interaksi reduksi, suhu dan konsentrasi pada aktivitas reduksi Cr (VI) oleh isolat Pseudomonas sp.1b. 14
11 Aktivitas reduksi isolat Geobacillus sp.1c. pada pH 5 14
12 Aktivitas reduksi isolat Geobacillus sp.1c. pada pH 7 15
13 Aktivitas reduksi isolat Geobacillus sp.1c. pada pH 9 15
14 Surface plot dari interaksi reduksi, suhu dan konsentrasi pada aktivitas reduksi Cr (VI) oleh isolat Geobacillus sp.1c. 16
15 Jalur reduksi kromat. Jalur ChrR, nitroreduktase, sitokrom c dan glutaredoksin 17
DAFTAR LAMPIRAN
1 Hasil uji SRA pada Bacillus sp.1a 252 Hasil uji SRA padaPseudomonas sp.1b 25
3 Hasil uji SRA padaGeobacillus sp.1c 26
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Kromium heksavalen dalam keadaan teroksidasi menjadi perhatian utama dalam kesehatan, keselamatan kerja dan lingkungan hidup karena toksisitasnya yang ekstrim dan bersifat karsinogen pada manusia (OSHA 2013). Kromium digunakan sebagai campuran utama seperti pada stainless steel, penyepuhan krom pewarna, sebagai katalis dalam pencelupan dan penyamakan kulit, impregnasi kayu, refraktori batu bata,dan untuk pembuatan pita magnetik (Jacobs and Testa 2005).
Menurut Factfish (2014), Indonesia mengimpor kromium trioksida sebesar 739.347 kg pada tahun 2012 dan pada tahun 2011 Indonesia mengekspor barang-barang, limbah/sisa dan bubuk yang mengandung Cr sebesar 86.711 kg. Limbah-limbah industri dengan kandungan logam-logam berat tidak dapat dibuang langsung ke sungai, waduk atau laut karena keberadaan logam berat sangat berbahaya bagi kehidupan manusia, hewan dan lingkungan (Karamah et al. 2008). Limbah logam berat Cr(VI) merupakan salah satu jenis limbah berbahaya sehingga diperlukan proses pengolahan limbah agar Cr(VI) tereduksi menjadi Cr(III) karena toksisitas Cr(III) jauh lebih rendah bila dibandingkan dengan Cr (VI), yaitu sekitar 1/100 kali (Slamet et al. 2005). Fatmawati et al. (2010) melakukan pemeriksaan parameter logam Cr pada limbah cair industri tekstildan diperoleh kandungan logam Cr(VI) 1.108 mg/L dengan pH 6.88. Sunardi (2011) menguji kandungan Cr(VI) dari limbah industri batik di Solo yaitu 74.298 ppm.
Beberapa cara dapat digunakan untuk mereduksi bentuk kromium (VI) menjadi bentuk trivalen, metode paling mudah dan murah adalah dengan menggunakan bantuan bakteri pereduksi kromat yang memiliki enzim Cr(VI) reduktase. Penggunaan bakteri yang dapat menghasilkan kromat reduktase dalam bioremediasi memiliki peranan penting dalam proses reduksi biologis Cr(VI) menjadi Cr(III). Pattanapipitpaisal dan Reakyai (2013) menyatakan bahwa kromat reduktase dapat bekerja pada variasi suhu dari 28 sampai 80°C pada pH 7.0. Pengamatan serupa dilaporkan pada kromat reduktase dari Pseudomonas putida MK1 yang menunjukkan aktivitas tertinggi pada suhu yang sama (80° C) namun pH optimal berbeda (pH 5.0) (Park et al. 2000).
Penelitian ini dilatar belakangi dari penggunaan kromium (VI) yang bersifat toksik didalam proses pewarna batik sehingga limbah yang dihasilkan dari proses tersebut mengandung logam Cr(VI) dengan suhu limbah yang relatif panas. Oleh karena itu, perlu dikembangkan teknik pengolahan limbah tersebut yang efektif dan efisien untuk mereduksi Cr (VI) menjadi Cr (III) dalam kondisi termofilik, yaitu dengan menggunakan bakteri termofilik yang berpotensi memiliki enzim Cr(VI) reduktase.
Perumusan Masalah
2
Tujuan Penelitian
Mendapatkan bakteri-bakteri termofilik yang mampu mereduksi logam Cr(VI) menggunakan enzim Cr(VI) reduktase dari sampel bakteri yang berasal dari limbah pengolahan batik dan penyamak kulit.
Manfaat Penelitian
Bakteri pereduksi hasil isolasi dapat dimanfaatkan pada sistem pengolahan limbah, dimana pada limbah-limbah yang mengandung Cr(VI) dapat diinokulasi dengan bakteri pereduksi sehingga Cr(VI) secara biologis direduksi menjadi Cr(III) (bioremediasi).
Ruang Lingkup Penelitian
Penelitian dilakukan dengan melakukan isolasi bakteri termofilik pereduksi Cr (VI) yang menghasilkan enzim Cr (VI) reduktase dari limbah yang diperoleh dari industri pengolahan batik.
2
TINJAUAN PUSTAKA
Kromium
Kromium adalah logam tidak berbau dan tidak berasa.Kromium ditemukan secara alami dalam batuan, tanaman, tanah dan debu vulkanik, manusia dan hewan. Bentuk yang paling umum dari kromium yang terjadi di perairan alami dan lingkungan adalah kromium trivalen (Cr III) dan kromium heksavalen (Cr VI). Cr III merupakan elemen penting dalam sumber makanan manusia dan terdapat secara alami pada sayuran, buah-buahan, daging, biji-bijian dan ragi. Cr VI secara alami ada di lingkungan dari erosi deposits kromium alami tetapi dapat juga dihasilkan dari proses industri. Senyawa Cr baik dalam valensi 3 atau 6 digunakan untuk plating chrome, pewarna dan pigmen, pengawetan kulit dan kayu (EPA 2013).
Kromat (Cr VI) reduktase
Kromat reduktase adalah enzim yang mengkatalisis reaksi reduksi Kromat (Cr VI) menjadi kromium (Cr III) (Nextprot 2011). Aktivitas kromat reduktase dapat diuji menggunakan NADH sebagai donor elektron. Campuran reaksi mengandung 0.1 mL larutan ekstrak kasar enzim, 0.1 mM NADH dan 3.4 µM Cr(VI) dalam 50mM buffer potassium fosfat (pH 6) didalam volume total (1 ml). Campuran uji terdiri dari komposisi serupa di atas, kecuali enzim atauNADH digunakan masing-masing sebagai kontrol.Campuran uji diinkubasi pada 30 C selama 30 menit. Konsentrasi Cr (VI) yang tersisa dalam campuran reaksi diukur (Elangovan et al. 2006) menggunakan reagen 1,5-diphenylcarbazide (DPC) (APHA 1999).
3 metode ultrasonikasi CFE (cell free extract) memiliki aktivitas kromat reduktase 0.24 U/mg pada 5 µg Cr(VI) ml-1, namun fraksi membran sel menunjukkan tidak ada aktivitas reduksi Cr(VI). Penambahan NADH pada campuran reaksi meningkatkan kromat reduktase menjadi 1.1 U/mg di bawah kondisi serupa. Aktivitas kromat reduktase juga diamati ketika NADPH digunakan sebagai donor elektron dan menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan yang besar dalam tingkat aktivitas kromat reduktase antara penggunaan NADH dan NADPH.Protein dari fraksi amonium sulfat menunjukkan peningkatan 2.2 kali aktivitas spesifik (2.4 U/mg) kromat reduktase dan sampel ini digunakan untuk uji lanjut penggunaan NADH sebagai donor elektron.
Suhu optimum aktivitas kromat reduktase oleh CFE Bacillus fusiformis telah diteliti dan didapatkan pada jarak variasi suhu dari 28 sampai 80°C pada pH 7.0. Aktivitas CFE tertinggi ditunjukkan pada jarak suhu yang luas, dengan suhu optimum tertinggi 80°C (0.67 unit). Penurunan aktivitas dengan cepat ketika suhu terus bertambah yang mungkin terjadi adalah denaturasi karena panas (Pattanapipitpaisal dan Reakyai 2013). Pengamatan serupa dilaporkan pada kromat reduktase dari P. putida MK1, yang menunjukkan aktivitas tertinggi pada suhu yang sama (80°C) tapi pH optimal berbeda (pH 5.0) (Park et al. 2000).
Aktivitas kromat reduktase Thermus scotoductus optimal pada pH 6.3 dan aktif pada suhu optimal 65° C, tetapi aktif juga pada rentang temperatur yang luas, pada 80° C dapat mempertahankan >70% aktivitasnya (Opperman et al. 2008). Pada Bacillus sp. aktivitas kromat reduktase diamati pada kisaran pH sempit dengan pH optimal 6.0.Lebih dari 85% dari aktivitas maksimal telah hilang ketika pH 5.0 dan 7.0.Aktivitas enzim pada pH asam (< 6.0) secara drastis menurun sementara stabilitas enzim pH basa (> 7.0) sedikit berkurang. Pada 30°C aktivitas kromat reduktase maksimum ditemukan di pH optimal 6.0 (Elangovan et al. 2006).
Kehadiran logam bivalent Ca2+ atau Mg2+ sangat mempengaruhi aktivitas kromat reduktase, aktivitasnya meningkat 4 kali (13.6 -14.5 µmol/min/mg) jika dibandingkan aktivitas enzim tanpa logam/EDTA (3.1 µmol/min/mg). Sedangkan Zn2+, Mn2+ dan EDTA menghambat reaksi. Kromat reduktase dapat menerima elektron dari NADH maupun NADPH, dengan preferensi pada NADPH. Ternyata nilai Km diperoleh untuk Cr (VI) adalah 3.5 ± 0.3 µM dan 8.4 ± 1.1 µM dengan NADH dan NADPH sebagai donor elektron, masing-masing, sesuai dengan nilai Vmax 6.2 ± 0.2 µmol/min/mg dan 16.0± 0.6 µmol/min/mg. Pada konsentrasi di atas 0.1 mM, NADPH menunjukkan inhibisi substrat, tapi itu masih lebih efisien daripada NADH pada konsentrasi ini (Opperman et al. 2008).
4
menunjukkan pembentukan Cr(V) oleh P. Rhodozyma jauh lebih cepat dibandingkan hasil reduksi dari S. cerevisiae.
Limbah
Limbah adalah sisa proses produksi atau bahan yg tidak mempunyai nilai atau tidak berharga untuk maksud biasa atau utama dalam pembuatan atau pemakaian (kbbi.web.id). Berdasarkan Perda provinsi DI Yogyakarta no 2 tahun 2012, Penghasil Limbah B3 dari Industri, terdiri atas penyamakan kulit, industri lampu, industri tekstil, industri farmasi, industri pangan/susu, home industi batik. Baku mutu limbah cair penyamakan kulit dan tekstil (batik) sudah tertera dalam Kepmen Lingkungan Hidupnomor : KEP- 51/MENLH/10/1995.
Aplikasi
Reduksi kromat secara enzimatik diperankan oleh enzim Cr(VI) reduktase yang mungkin berada pada membran, sitoplasma, atau periplasma. Reduksi Cr(VI) menjadi Cr(III) oleh mikroba telah diselidiki secara ekstensif untuk keperluan bioremediasi. Laporan awal menekankan reduksi Cr(VI) dan sering tidak menentukan bentuk produk akhir Cr(III) (Chenget al. 2012).
3.
METODE
Bahan
Sampel berupa limbah dari pengolahan batik yang terdiri atas limbah pewarnaan, pencucian dan perebusan batik. Bacto agar, pepton, tripton, NaCl, K2HPO4, glukosa, aquadestilata,K2Cr2O4, pereaksidifenil karbazide, HNO3 pekat, Media KIA, Media PIA, Media EMB.
Media HTR (heterotrof) padat dengan komposisi 15 gram bacto agar, 15 gram pepton, 3 gram tripton, 5 gram NaCl dan 2 gram K2HPO4 dilarutkan dalam 1000 ml aquadestilata. Media HTR cair dengan komposisi media cair adalah 15 gram pepton, 3 gram tripton, 5 gram NaCl, 2.5 gram K2HPO4 dan 2.5 gram glukosa dilarutkan dalam 1000 ml aquadestilata. Kedua media tersebut juga ditambahkan K2Cr2O4 sebagai sumber Cr(VI).
Master mix dengan komposisi 7 µL ddH2O, 10 µL Evagreen, 1 µL template, 1 µL Primer F, 1µL primer R.
Primer spesifik kromat reduktase (CRVIRD) F 5’ -CAGCTCAATGGGCGTGATTG-3’ ; R 5’-CGCCCATAAATTCCGGCTTG-3’. Primer dirancang sendiri menggunakan data gen kromat reduktase dari gene bank (NCBI).
Alat
5 Cara Kerja
Pembuatan media isolasi
Media dibuat dengan komposisi 15 gram Bacto agar, 15 gram pepton, 3 gram tripton, 5 gram NaCl dan 2 gram K2HPO4 dilarutkan dalam 1000 mL aquadestilata. Kemudian media disterilisasi pada suhu 121°C, 2 atm selama 20 menit, selanjutnya ditambah dengan K2Cr2O7steril sampai dengan konsentrasi Cr 100 ppm dan selanjutnya media dituang ke dalam Petridis.
Pembuatan media cair untuk uji reduksi
Media cair dibuat dengan komposisi 15 gram pepton, 3 gram tripton, 5 gram NaCl, 2.5 gram K2HPO4 dan 2.5 gram glukosa dilarutkan dalam 1000 mL aquadestilata. Kemudian media dimasukkan ke dalam tabung-tabung reaksi, diberi sumbat dan di sterilisasi pada suhu 121°C, 2 atm selama 20 menit.
Isolasi, Pemurnian dan Identifikasi Bakteri dari Limbah Pewarnaan Batik (modifikasi Holt and Krieg 1994)
Isolasi dilakukan dengan menggoreskan 1 (satu) ose sampel limbah pada media HTR padat yang diperkaya dengan Cr(VI) 100 ppm dan diinkubasi selama 24-48 jam pada 30ºC. Isolat-isolat yang diperoleh kemudian diambil 1 (satu) ose dan dipindahkan ke media HTR padat, lalu diinkubasi selama 24-48 jam pada 30ºC, sehingga diperoleh isolat-isolat murni.
Isolat yang telah dimurnikan kemudian disiapkan untuk membuat starter dengan menginokulasikan isolat-isolat pada media HTR cair yang diperkaya dengan Cr (VI) 100 ppm dan diinkubasi 24-48 jam. Kultur kemudian diukur Optical Density-nya (OD) pada 540 nm. OD starter yang digunakan memiliki nilai absorbansi 1. Kemudian starter ini digunakan untuk uji aktivitas reduksi Cr(VI).
Identifikasi tahap awal dilakukan denganmengidentifikasi karakter biokimia pertumbuhan dengan menggunakan pewarnaan Gram, inokulasi pada media selektif dan media miring KIA serta pewarnaan spora.
Identifikasi Gen dengan qPCR (modifikasi Sachse 2002)
6
kemudian direaksikan dengan pereaksi master mix dan primer spesifik kromat reduktase (CRVIRD) kemudian dipisahkan pada mesin qPCR (quantitatif PCR). Uji Aktivitas Reduksi Cr(VI) (modifikasi APHA 1999)
Media yang digunakan adalah media HTR cair dengan berbagai tingkat pH dan konsentrasi Cr, yaitu media dengan pH 5, 7 dan 9. Pada masing-masing pH dibuat variasi konsentrasi Cr (VI) yiatu 50, 125 dan 200 ppm. Masing-masing media kemudian diinokulasikan dengan starter isolat sebanyak 10% dan diinkubasi pada suhu 30, 40 dan 50 C selama 24 jam.
Setelah 24 jam, isolat diambil sebanyak 1,5 mL dan disentrifugasi pada 12.197 g selama 10 menit. Dipipet 1,0 mL supernatan dan di tambahkan dengan 50 mL aquadestilata, 2 tetes HNO3 pekat (pH 1,0) dan 0,5 mL pereaksi difenilkarbazid (250 mg 1,5 difenilkarbazid dalam 50 ml aseton). Larutan berwarna kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm. Kontrol adalah media HTR dengan perlakuan pH dan konsentrasi akan tetapi tidak diberi isolat.
Aktivitas reduksi dinyatakan sebagai persentase reduksi Cr. Nilai reduksi Cr(VI) ditentukan berdasarkan jumlah Cr(VI) yang tersisa setelah masa inkubasi. Analisis Data
7
4.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Isolasi Bakteri dari Limbah Pengolahan Batik
Limbah pengolahan batik yang digunakan dalam isolasi berasal dari proses pewarnaan, perebusan dan pencucian batik. Isolat yang diperoleh dari limbah pewarnaan adalah isolat 1a, 1b dan 1c. Isolat dari limbah perebusan adalah isolat 2a, 2b dan 2c sedangkan isolat dari limbah pencucian adalah isolat 3 (Gambar 1).
Selanjutnya masing-masing isolat tersebut dimurnikan dan dikarakterisasi koloninya seperti yang tercantum pada Tabel 1.
Tabel 1 Isolat Hasil Isolasi dari Limbah Pengolahan Batik
No Isolat Karakteristik Koloni
1. 1a berwarna putih berbentuk bulat dengan tepian rata dan elevasinya flat atau datar
2. 1b berwarna hijau transparan berbentuk bulat dengan tepian rata dan elevasinya menonjol
3. 1c berwarna krem bentuk irregular dengan tepian undulate/bergelombang dan elevasinya menonjol
4. 2a berwarna krem bentuk irregular tepiannya undulate/bergelombang dan elevasinya menonjol
5. 2b berwarna krem bentuk irregular tepiannya undulate/bergelombang dan elevasinya umbonate
6. 2c berwarna putih bentuk irregular dengan tepian undulate/bergelombang dan elevasinya menonjol
7. 3 Berwarna krem bentuk irregular tepiannya
undulate/bergelombang dan elevasinya menonjol Gambar 1 Isolasi bakteri dari limbah pengolahan batik
8
Karakterisasi Gen Penyandi Kromat Reduktase
Isolat-isolat yang telah dimurnikan kemudian dilakukan identifikasi gen penyandi kromat reduktase menggunakan metode analisis qPCR (quantitatif PCR) menggunakan primer spesifik Chromium Reductase (CRVIRD). Dari 7 (tujuh) isolat yang dianalisis, hanya isolat 1a, 1b dan 1c dari limbah pewarnaan batik yang memiliki gen penyandi kromat reduktase. Isolat dari limbah pewarnaan batik berpotensi dapat mereduksi Cr(VI) menjadi Cr(III), sedangkan isolat-isolat dari limbah pencucian dan perebusan batik diduga merupakan isolat bakteri yang resisten terhadap Cr(VI).
Isolat 1a, 1b dan 1c kemudian dianalisis kembali dengan qPCR menggunakan primer spesifik CRVIRD sebagai uji karakterisasi gen penyandi kromat reduktase. Hasil dari qPCR kemudian digunakan untuk mengidentifikasi gen berdasarkan jumlah DNA yang teramplifikasi.
Amplifikasi dilakukan dalam rotor dan hasil ditampilkan dalam bentuk grafik pada layar komputer. Grafik yang ditampilkan berupa grafik kontrol negatif dan sample uji yang ditunjukkan sebagai nilai Ct(cycle threshold), yaituperpotonganantarakurvaamplifikasidangarisbatas kontrol (LTC 2011). Pada penelitian ini hasil analisis qPCR dari isolat 1a, 1b dan 1c menunjukkan konsentrasi DNA yang teramplifikasi pada isolat 1a lebih banyak dibandingkan dengan isolat lainnya (1b dan 1c) (Gambar 2). Nilai Ct isolat 1a adalah 27.46, nilai Ct 1b adalah 28.8 dan nilai Ct 1c adalah 31.01.
Nilai Tm (Temperature melt) pada 1a adalah 78.50, 1b 77.50 dan 86.00 serta 1c 84.00 dan 78.00. Kurva melt peak pada Gambar 2 menunjukkan bahwa isolat 1a menghasilkan kurva single peak dan pada isolat 1b dan 1c terbentuk kurva multiple peaks, ini mungkin berarti primer yang digunakan spesifik untuk isolat 1a tetapi tidak spesifik untuk isolat 1b dan 1c.
Hasil tersebut menunjukkan gen penyandi enzim kromat reduktase pada isolat 1a lebih tinggi aktivitasnya dibandingkan isolat 1b dan 1c, maka dilakukan uji lanjutan terhadap isolat tersebut. Uji lanjutan dilakukan untuk mengetahui ekspresi gen penyandi enzim kromat reduktase dengan mengukur aktivitas enzim kromat reduktase pada isolat 1a dalam mereduksi Cr(VI) menjadi Cr(III).
9 Isolat 1b adalah Pseudomonassp., dan isolat 1c adalah Geobacillussp.
Tabel 2 Karakter Biokimia Pertumbuhan Koloni dan Morfologi
No Isolat Media Selektif KIA Gram Spora
Uji aktivitas enzim dilakukan dengan menggunakan media yang telah diperkaya dengan Cr(VI) dan diberi perlakuan dengan beberapa konsentrasi Cr (VI) yaitu 50, 125 dan 200 ppm, perlakuan pH (5,7 dan 9) dan suhu inkubasi (30, 40 dan 50).
Isolat Bacillus sp.
Hasil uji aktivitas reduksi isolat Bacillus sp. dengan pH 5,menunjukkan aktivitas terendah pada perlakuan konsentrasi 125 ppm dengan suhu inkubasi 30°C yaitu hanya 6.58 % Cr (VI) yang tereduksi dan aktivitas tertinggi pada perlakuan 50 ppm dengan suhu inkubasi 50°C yaitu 66.64 % Cr (VI) yang tereduksi(Gambar 3).
10 inkubasi 50°C yaitu 97.36% Cr (VI) yang tereduksi (Gambar 4).
Pada pH 9, aktivitas reduksi terendahterlihat pada perlakuan 125 ppm yang diinkubasi pada suhu 30 °C yaitu 14,62 % Cr (VI) yang tereduksi dan aktivitas tertinggi pada perlakuan 50 ppm dengan waktu inkubasi 50°C (90.64%) (Gambar 5).
Gambar 4 Aktivitas reduksi isolatBacillus sp. pada pH 7
11 Isolat Bacillus sp. menunjukkan pola aktivitas reduksi Cr(VI) yang sama pada perlakuan pH yang berbeda seperti terlihat pada gambar 3,4 dan 5, dimana nilai aktivitas terendah maupun tertinggi pada perlakuan konsentrasi yang sama yaitu 125 ppm dan 50 ppm. Perlakuan pH pada uji aktivitas ini menunjukkan hasil optimal pada pH 7 suhu inkubasi 50°C dengan nilai reduksi mencapai 97 %. Perlakuan suhu inkubasi menunjukkan hasil uji aktivitas reduksi paling tinggi pada perlakuan suhu 50°C, hasil paling rendah pada perlakuan dengan suhuinkubasi 30°C. Hasil uji interaksi dengan SRA menggunakan Minitab 16 menunjukkan hasil yang sama seperti terlihat pada Gambar 6.
Hasil analisis interaksi pada surface plot menunjukkan bahwa aktivitas reduksi tertinggi terjadi pada suhu inkubasi 50ºC, baik pada perlakuan konsentrasi 50, 125 maupun 200 ppm. Aktivitas reduksi menengah terjadi pada suhu 40ºC dan aktivitas terendah terjadi pada suhu 30ºC dengan perlakuan konsentrasi yang sama 50, 125 maupun 200 ppm (Gambar 6).
Hasil uji statistik terhadap aktivitas reduksi (persentase reduksi) menggunakan SRA pada Minitab 16 diperoleh hasil perlakuan pH, konsentrasi dan suhu inkubasi menunjukkan perbedaanyang signifikan (P< 0.05). Hasil tersebut menunjukkan bahwa pada masing-masing perlakuan yaitu pH, konsentrasi dan suhu inkubasi memberikan perbedaan aktivitas reduksi. Interaksi suhu-konsentrasi dan interaksi pH-konsentrasijuga memberikan hasil yang berbeda nyata (P<0.05), yang berarti interaksi suhu-konsentrasi serta interaksi pH-konsentrasi juga memberikan pengaruh yang berbeda terhadap aktivitas reduksi yang berbeda (Lampiran 1).
Pseudomonassp.
Uji aktivitas reduksi pada isolat Pseudomonas sp. pada pH 5 menunjukkan aktivitas terendah pada perlakuan konsentrasi Cr awal 125 ppm suhu inkubasi suhu 30°C yaitu 0 % dan aktivitas tertinggi pada perlakuan konsentrasi Cr awal 50 ppm dengan suhu inkubasi 50°C yaitu 59.36 % (Gambar 7).
12
Aktivitas reduksi isolat Pseudomonas sp. pada pH 7 menunjukkan hasil terendah pada perlakuan konsentrasi 125 ppm dengan suhu inkubasi 30°C (0 %) dan aktivitas reduksi tertinggi terjadi pada perlakuan konsentrasi 50 ppm dengan suhu inkubasi 50°C yaitu 45.00% Cr (VI) tereduksi (Gambar 8).
Gambar 7 Aktivitas reduksi isolat Pseudomonas sp. pada pH 5
13 Sedangkan aktivitas reduksi yang dilakukan uji dengan perlakuan pH 9menunjukan aktivitas terendah pada perlakuan 125 ppm yang diinkubasi pada suhu 30 °C(6.29 %) dan aktivitas reduksi Cr (VI) tertinggi pada perlakuan 50 ppm dengan waktu inkubasi 50°C yaitu 55.91 % (Gambar 9).
Perlakuan pH pada uji aktivitas reduksi isolat Pseudomonas sp.menunjukkan pola aktivitas yang berbeda seperti yang terlihat pada Gambar 7, 8 dan 9.Nilai aktivitas terendah maupun tertinggi pada perlakuan konsentrasi 125 ppm dan 50 ppm. Perlakuan pH pada uji aktivitas ini menunjukkan hasil optimal pada pH 5 suhu inkubasi 50°C dengan nilai reduksi mencapai 59.36 %.
Perlakuan suhu inkubasi menunjukkan hasil uji aktivitas reduksi paling tinggi pada perlakuan suhu 50°C, hasil reduksi paling rendah pada perlakuan suhu inkubasi 30°C.
Hasil analisis interaksi pada surface plot menunjukkan bahwa aktivitas reduksi tertingi terjadi pada suhu inkubasi 50ºC, baik pada perlakuan konsentrasi 50, 125 maupun 200 ppm. Aktivitas reduksi menengah terjadi pada suhu 40ºC dan aktivitas terendah terjadi pada suhu 30ºC (Gambar 10).
Uji statistik terhadap aktivitas reduksi (persentase reduksi) diperoleh hasil perlakuan pH, perlakuan konsentrasi dan suhu inkubasi menunjukan hasil berbeda nyata (P< 0.05). Hasil tersebut menunjukkan bahwa pada masing-masing perlakuan yaitu pH, konsentrasi dan suhu inkubasi memberikan perbedaan aktivitas reduksi yang signifikan. Interaksi suhu-konsentrasi juga memberikan hasil yang berbeda nyata (P<0.05), yang berarti interaksi antara suhu dan konsentrasi juga memberikan pengaruh terhadap aktivitas reduksi yang berbeda (Lampiran 2).
14
Geobacillussp.
Aktivitas reduksipada pH 5 oleh isolat Geobacillus sp.menunjukkan reduksiterendah pada perlakuan konsentrasi 125 ppm dengan suhu inkubasi 30°C (3.85 %) dan aktivitas tertinggi pada perlakuan 50 ppm suhu inkubasi 50°C yaitu 45.09 % Cr (VI) yang tereduksi (Gambar 11).
Gambar 10Surface plot dari interaksi reduksi, suhu dan konsentrasi pada aktivitas reduksi Cr (VI) oleh isolat Pseudomonas sp.
15 Uji aktivitas reduksiGeobacillus sp.yang dilakukan pada pH 7 menunjukkan aktivitas terendah pada perlakuan konsentrasi 125 ppm dengan suhu inkubasi 30°C (0 %) dan aktivitas tertinggi pada perlakuan konsentrasi 50 ppm dengan suhu inkubasi 50°C yaitu 47.55% Cr (VI) tereduksi (Gambar 12).
Aktivitas reduksi pada pH 9 terendah terlihat pada perlakuan 125 ppm yang diinkubasi pada suhu 30 °C yaitu hanya 6 % Cr (VI) tereduksi dan aktivitas tertinggi pada perlakuan 50 ppm dengan waktu inkubasi 50°C yaitu 56 % Cr (VI) tereduksi (Gambar 13).
16
Perlakuan pH pada uji aktivitas reduksidengan isolat Geobacillus sp.menunjukkan pola aktivitas yang berbeda seperti yang terlihat pada gambar 11,12 dan 13.Nilai aktivitas terendah maupun tertinggi pada perlakuan konsentrasi yang sama yaitu 125 ppm dan 50 ppm. Perlakuan pH pada uji aktivitas ini menunjukkan hasil optimal pada pH 5 suhu inkubasi 50°C dengan nilai reduksi mencapai 59 % Cr (VI) yang tereduksi.
Perlakuan suhu inkubasi menunjukkan hasil uji aktivitas reduksi paling tinggi pada perlakuan suhu 50°C, hasil reduksi paling rendah pada perlakuan suhu inkubasi 30°C. Hasil uji interaksi dengan SRA menggunakan Minitab 16 menunjukkan hasil yang sama seperti terlihat pada Gambar 10.
Hasil analisis interaksi pada surface plot menunjukkan bahwa aktivitas reduksi tertingi terjadi pada suhu inkubasi 50ºC, baik pada perlakuan konsentrasi 50, 125 maupun 200 ppm. Aktivitas reduksi menengah terjadi pada suhu 40ºC dan aktivitas terendah terjadi pada suhu 30ºC (Gambar 14).
Uji statistik terhadap aktivitas reduksi (persentase reduksi) diperoleh hasil perlakuan suhu inkubasi menunjukkan hasil berbeda nyata (P< 0.05)artinya perlakuan suhu inkubasi memberikan pengaruh yang signifikan terhadap aktivitas reduksi. Interaksi suhu-konsentrasi juga memberikan hasil yang berbeda nyata (P<0.05), yang berarti interaksi antara suhu dan konsentrasi juga memberikan pengaruh terhadap aktivitas reduksi (Lampiran 3).
Pembahasan
Hasil uji karakter dengan menggunakan pewarnaan Gram menunjukkan bahwa isolat 1a dan 1b adalah isolat dengan Gram positif batang dan isolat 1b adalah batang Gram negatif. Selanjutnya ketiga isolat yang diinokulasikan pada media selektif EMB, PIA, dan YM. Pada media EMB ketiga isolat membentuk koloni yang terbentuk pada berwarna merah muda, hal tersebut menunjukan
17 ketiga isolat tersebut tidak termasuk kedalam Escherichia coli maupun Coliform, karena E. coli dan Coliform membentuk koloni berwarna ungu gelap dengan pusat koloni hitamdan bersinar hijau metalik. Hasil inokulasi pada media PIA yang merupakan media selektif untuk genus Pseudomonas menunjukkan hanya isolat 1b yang tumbuh pada media PIA, ini berarti bahwa isolat tersebut termasuk kedalam genus Pseudomonas. Pada media YM hanya isolat 1a dan 1c yang tumbuh. Media YM adalah media selektif untuk jamur, ragi dan mikroorganisme tahan asam seperti Bacillus dan Laktobacillus. Uji kemampuan fermentasi menggunakan media KIA menunjukkan bahwa isolat 1a dan 1b tidak memfermentasi laktosa dan dekstrosa, sedangkan isolat 1c hanya memfermentasi dextrose. Uji spora menunjukkan isolat 1a dan 1c membentuk spora sedangkan isolat 1b tidak membentuk spora (Lampiran 7-10).
Hasil tersebut diatas dapat menggambarkan bahwa isolat bakteri hasil isolasi pada penelitian ini yaituisolat 1a teridentifikasi sebagai Bacillus sp., Isolat 1b adalah Pseudomonassp. dan isolat 1c adalah Geobacillussp.Penelitiansebelumnya telah menguji aktivitas enzim kromat reduktase pada bakteri-bakteri seperti Bacillus fusiformis NTR9, Pseudomonas putida, Thermus scotoductus, Acinetobacter haemolyticus dangenus Geobacillus (Park et al. 2000; Zakaria et al. 2007; Opperman et al. 2008; Pattanapipitpaisal and Reakyai 2013; Jain et al. 2014). Zakaria et al. (2007) mengisolasi bakteri Acinetobacter haemolyticus yang berpotensi mereduksi Cr (VI) dari limbah tekstil mengandung logam berat. B. fusiformis NTR9 diisolasi dari sampel limbah industri dari tenun sutra (Pattanapipitpaisal and Reakyai 2013), dan genus Geobacillus diisolasi dari sedimen di suatu lokasi ekosistem panas bumi di Tantloi, India (Jain et al. 2014).
Umumnya mikroba sensitif terhadap kehadiran Cr (VI), namun pada beberapa spesies tertentu ada yang tahan dan toleran terhadap kromat konsentrasi tinggi. Bakteri dengan Cr (VI) resistensi ditanggulangi secara genetikdengan adanya plasmid, sedangkan gen kromat reduktase ditemukan baik di plasmid dan kromosom utama (Ramirez-Díaz et al. 2008). Secara fisik mungkin suatu bakteri menjadi resisten karena (1) bakteri tersebut terlindungi oleh suatu lapisan yang membuat Cr(VI) tidak dapat masuk seperti kapsul bakteri. (2) atau bakteri tersebut tidak memiliki jalan masuk atau pompa regulasi yang dapat dilalui oleh logam seperti Cr(VI). (3) atau bakteri tersebut memiliki pompa regulasi tetapi ketika Cr(VI) masuk kemudian oleh pompa dikeluarkan kembali. (4) atau modifikasi antara pompa dan enzim pereduksi Cr(VI) (Zou et al. 2013).
18
Berdasarkan hasil qPCR isolat Bacillus sp., Pseudomonas sp. dan Geobacillus sp. terdeteksi memiliki gen penyandi kromat reduktase. Ketiganya memiliki gen kromat reduktase yang mirip dengan gen kromat reduktase pada mikroba lain yang sudah tersimpan pada gene bank (NCBI) seperti nemA, yieF, chrR padaEscherichia coli dan BBPR_1806 padaBifidobacterium bifidum PRL2010. Akan tetapi data gen kromat reduktase dari genus Bacillus, Pseudomonas dan Geobacillus belum tersimpan pada gene bank.
Metode qPCR adalah metode analisis yang dapat mengukur DNA berpotensi dengan akurat (Bustin et al. 2009). Nilai Ct didefinisikan sebagai jumlah siklus yang diperlukan untuk sinyal fluoresensi untuk mendeteksi tercapainya ambang batas tertentu dan korelasinyaberbanding terbalik dengan jumlah template asam nukleat yang hadir dalam reaksi (Walker 2002). Nilai CtBacillus sp. adalah 27.46, nilai CtPseudomonas sp.adalah 28.8 dan nilai CtGeobacillus sp.adalah 31.01. Pada penelitian ini hasil dari analisis qPCR gen kromat reduktase menunjukan bahwa jumlah template DNA gen penyandi kromat renteduktase pada populasi DNA Bacillus sp. relatif lebih banyak gen penyandi gen kromat reduktasenya jika dibandingkan dengan populasi DNA yang sama dari Pseudomonas sp.dan Geobacillus sp.
Nilai Tm (Melting temperature) isolat Bacillus sp. adalah 78.50, isolat Pseudomonas sp adalah 77.50 dan 86,00 serta untuk isolat 1c adalah 84.00 dan 78,00. Melting curvepada Gambar 2 menunjukkanbahwa puncak grafik pada isolat Bacillus sp.berupasingle peak dan pada isolat Pseudomonas sp dan Geobacillus sp.berupa multiple peaks, yang berarti bahwa amplikon pada isolat Bacillus sp.
19 bersifat homogen dan amplikon pada isolat Pseudomonas sp dan Geobacillus sp. tidak homogen, yang menandakan bahwa primer yang digunakan bersifat spesifik untuk isolat Bacillus sp. tetapi tidak spesifik untuk isolat Pseudomonas sp dan Geobacillus sp. Ukuran amplikon kedua pada Pseudomonas sp lebih besar dari amplikon pertama, ini menunjukkan amplikon kedua adalah molekul yang berbeda dengan molekul yang membentuk amplikon pertama. Sedangkan pada Geobacillus sp. amplikon pertama lebih besar dari amplikon kedua dan ini menunjukan amplikon pertama adalah molekul yang berbeda dengan molekul yang membentuk amplikon kedua.
Enzim kromat reduktase (ChrR) merupakan unit asimetris yang mengandung empat monomer dan masing-masingnya terikat FMN tunggal. Massa dari molekul ChrR adalah 80 kDa dan sebagai massa unit monomernya adalah 21.3 kDa(Jin et al. 2012). Kromat reduktase mereduksi Cr(VI) langsung dengan mentransfer empat elektron. Tiga elektron ditransfer ke Cr(VI) dan satu elektron dipindahkan ke oksigen untuk menghasilkan H2O2 (Zou et al. 2013).
Penelitian sebelumnya telah menguji aktivitas enzim kromat reduktase pada bakteri-bakteri seperti Bacillus fusiformis NTR9, Pseudomonas putida, Thermusscotoductus (Park et al. 2000; Opperman et al. 2008; Pattanapipitpaisal dan Reakyai 2013).
Penelitian oleh Chaturvedi (2011) strain Bacillus circulans MN1 mereduksi Cr (VI) lebih efisien pada suhu 30 °C jika dibandingkan pada 25 °C dan 35 °C dan pH optimum awal 5,6. pH optimum enzim dalam mereduksi Cr (VI) adalah pH 7,0 dalam buffer fosfat, penurunan aktivitas terjadi pada saat pH sama dengan penggunaan buffer Tris-HCl. Pada suhu 20 ºC terdeteksi adanya aktivitas enzim mencapai 80%. Kecepatan reaksi meningkat hingga mencapai suhu 30°C. Peningkatan suhu hingga 40°C mengakibatkan penurunan aktivtas, mungkin karena terjadi denaturasi enzim. (Conceição et al. 2009).
Pada penelitian ini aktivitas reduksi isolat Bacillus sp.1apada pH 5 optimal terjadi pada suhu 50°C yaitu 66.64 %, pada pH 7 dan pH 9 aktivitas reduksi paling optimal juga terjadi pada suhu 50°C yaitu 97.36% dan 90.64%. Hasil tersebut menunjukkan bahwa dalam mereduksi Cr(VI) isolat bakteri Bacillus sp. bersifat termofilik, karena pada penelitian ini aktivitas reduksi optimalnya pada suhu 50°C dengan pH optimal 7.
Aktivitas reduksi optimal oleh isolat Pseudomonas sp. pada pH 5 suhu inkubasi 50 °C yaitu 59.36%, dan aktivitas reduksi pada pH 7 dan pH 9 adalah 45% dan 55.91% dengan suhu inkubasi yang sama yaitu 50 °C. Aktivitas reduksi optimal oleh isolat Geobacillus sp. pada pH 9 suhu inkubasi 50 °C yaitu 56%, aktivitas reduksi pada pH 5 dan pH 7 adalah 45.09% dan 47.55% dengan suhu inkubasi 50 °C. Hasil uji aktivitas reduksi oleh Pseudomonas sp. dan Geobacillus sp. pada penelitian ini menunjukkan aktivitas enzimnya bersifat termofilik, dengan pH optimum aktivitas pada Pseudomonas sp. adalah pH 5 dan Geobacillus sp. pada pH 9.
Hasil aktivitas enzim kromat reduktase pada penelitian ini menunjukkan isolat Bacillus sp. memiliki aktivitas yang lebih baik sebanding dengan hasil yang ditampilkan pada saat menguji tingkat ekspresi gen penyandi kromat reduktase menggunakan metode qPCR.
20
karena pada populasi Bacillus sp. yang digunakan dalam penelitian ini, jumlah sel bakteri yang resisten dan memiliki aktivitas reduksi lebih banyak dibandingkan pada populasi Pseudomonas sp. dan Geobacillus sp.(2) atau jumlah gen enzim kromat reduktase pada Bacillus sp. lebih banyak dibandingkan dengan isolat lainnya, maksudnya adalah mungkin pada Bacillus sp. gen penyandi kromat reduktase tidak hanya terdapat pada DNA inti, juga terdapat pada plasmid yang membawa gen penyandi kromat reduktase.(3) atauBacillus sp. mempunyai mekanisme reduksi ganda seperti yang terlihat pada Gambar 15. Yaitu mekanisme reduksi intra dan ekstra seluler sehingga aktivitas reduksinya menjadi lebih optimal.
Reduksi Cr (VI) menjadi Cr (III) dapat dipengaruhi oleh potensial redoks dan pH (Hawley et al. 2004). Mikroorganisme dapat mengkatalisis reaksi redoks dengan beberapa kombinasi mekanisme, termasuk reduksi enzimatik ekstraselluler. Mikroorganisme yang mampu mereduksi Cr (IV) menjadi Cr (III) termasuk bakteri (Pseudomonas, Micrococcus, Escherichia, Enterobacter, Bacillus, Aeromonas, Achromobacter, dan Desulfomamaculum) (McLean andBeveridge, 2001), alga (Cervantes et al. 2001), ragi, dan jamur.
Faktor lingkungan seperti oksigen, pH dan intensitas cahaya dapat mempengaruhi aktivitas reduksi Cr(VI), akan tetapi pada penelitian ini nilai reduksi pada kontrol perlakuan menunjukkan bahwa selama proses inkubasi faktor tersebut tidak mempengaruhi aktivitas reduksi karena pada kontrol tidak ditemukan terjadinya reduksi Cr(VI)(Gambar 2-4).
Hasil penelitian ini menunjukkan dari ketiga isolat, isolat Bacillus sp. berpotensi lebih baik dibandingkan dua isolat lainnya. Berdasarkan sifat isolat Bacillus sp. yang pada penelitian ini dapat beraktivitas pada suhu 50ºC dengan pH 7, maka isolat ini dapat diaplikasikan pada proses pengelolaan limbah (bioremediasi) dengan karakteristik limbah yang suhunya berkisar 50ºC dan mengandung Cr(VI) konsentrasi tinggi. Agar isolat bakteri ini dapat mudah diaplikasikan pada sistem pengolahan limbah, maka sel dapat dimobilisasi, atau ditumbuhkan pada matriks. Sehinggaisolat dapat digunakan pada proses pengolahan limbah yang menggunakan bioreaktor atau pengolahan limbah yang menggunakan membran dimodifikasi. Proses remediasi juga dapat dilakukan dengan langsung menyebarkan isolat Bacillus sp. pada tanah atau lingkungan yang terkontaminasi Cr(VI).
21
5.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Diperoleh 3 (tiga) isolat, yaitu isolat dari Bacillus sp., Pseudomonas sp., dan Geobacillus sp. yang memiliki gen penyandi kromat reduktase. Hasil karakterisasi dengan qPCR menunjukkan isolat Bacillus sp. berpotensi lebih baik dibandingkan dengan isolat Pseudomonas sp. dan Geobacillus sp. Aktivitas reduksi Cr(VI) isolat Bacillus sp. bersifat termofilik, optimum pada pH 7.
Saran
22
DAFTAR PUSTAKA
[APHA] American Public Health Association. 1999. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater.
[LTC] Life Technologies Corporation. 2011. Real-Time PCR : Understanding Ct. Life technologies corporation[internet]. [diacu 2014 November 24]. Tersedia dari :www.lifetechnologies.com. Carlsbad
[OSHA] Occupational Safety & Health Administration. 2013. Chromium. [internet]. [diacu 2014 Februari 21]. Tersedia dari :www.osha.gov/SLTC/ chromium/.
[EPA] Environmental Protection Agency. 2013. Basic Information about
Chromium in Drinking Water.
water.epa.gov/drink/contaminants/basicinformation/chromium.cfm. Diunduh pada tanggal 15 Agustus 2014.
Alvarez AH, Moreno-sánchez R, Moreno-sa R. 1999.Chromate Efflux by Means of the ChrAChromate Resistance Protein fromPseudomonas aeruginosa. J. bacteriol. 181(23):7398-7400. 0021-9193/99/$04.0010
Bustin SA, Benes V, Garson JA, Hellemans J, Huggett J, Kubista M, Mueller R, Nolan T, Pfaffl MW, Shipley GL,Vandesompele Jo,and Wittwer CT. 2009. The MIQE Guidelines:Minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry 55(4):1-12. DOI: 10.1373/clinchem.2008.112797.
Cervantes C, Campos-García J, Devars S, Gutiérrez-Corona F, Loza-Tavera H, Torres-GuzmánJC, Moreno-Sánchez R. 2001. Interactions of chromium with microorganisms and plants, FEMS Microbiology Reviews, 25(3):335-347 PII: S0168-6445 (01) 00057-2.
ChaturvediMK. 2011. Studies on chromate removal by chromium-resistant bacillus sp. isolatd from tannery effluent.Journal of Environmental Protection, 2011(2):76-82.Doi:10.4236/jep.2011.21008.
Chwastowski and Kołoczek. 2013. The kinetic reduction of Cr(VI) by yeast Saccharomycescerevisiae, Phaffia rhodozyma and their protoplasts. Acta Biochimica Polonica (ABP), 60(4):829–834. www.actabp.pl.
Cheng Y, Holman HY, Lin Z. 2012.Remediation of chromium and uranium
contamination by microbial activity. Elements, 8:107–112. DOI: 10.2113/gselements.8.2.107
Conceição DP, dos Passos CT, Jacques RJS, Bento FM, Simonetti AB, and Camargo FAO. 2009. A novel chromate reductase from Bacillus sp. ES29: characterization and partial purification.Revista Ciências Exatas e Naturais, 11(2): 237-256.
ElangovanR, Abhipsa S, Rohit B, LigyP and Chandraraj K. 2006. Reduction of Cr(VI) by a Bacillus sp.Biotechnology Letters2006(28): 247–252, Springer. Factfish, 2014.Indonesia: Chromium trioxide, import value [internet]. [diacu 2014
April 22]. Tersedia dari :http://www.factfish.com.
23 Fatmawati, Sajidan, Suranto. 2010. Potensi mikroorganisme sebagai agen bioremidiasi dalam menurunkan kadarCr (VI) dalam Limbah cair tekstil hasil pewarnaan. Seminar Nasional Pendidikan Biologi, FKIP, UNS.
Hawley EL, Deeb RA, Kavanaugh MC, Jacobs J. 2004. Treatment Technologies for Chromium(VI). Chromium (VI) Handbook. ISBN 1-56670-608-4, CRC Press, New York.
Holt JG and Krieg NR. 1994. Enrichment and Isolation. Methods for General and Molecular Bacteriology. American Society for Microbiology.
Jacobs JA, Testa SM. 2005. Overview of chromium(vi) in theenvironment: background and history.Chromium (VI) Handbook. ISBN 1-56670-608-4, CRC Press, New York.
Jain P, Reza HM, and Pal S. 2014.Molecular phylogenetic analysis of bacterial community and characterization of Cr(VI) reducers from the sediments of Tantloi hot spring, India. Aquatic Biosystems. 10(7):1-11DOI:10.1186/2046-9063-10-7.
Jin H, Zhang Y, Buchko GW, Varnum SM, Robinson H, Squier TC, Long PE. 2012. Structure determination and functional analysis ofa chromate reductase from Gluconacetobacter hansenii.PLoS ONE 7(8): e42432. doi:10.1371/journal.pone.0042432
Karamah EF, Setijo B, dan Simbolon HM. 2008. Pengaruh ozon dan konsentrasi zeolit terhadap kinerja proses pengolahan limbah cair yang mengandung logam dengan proses flotasi. Makara. Teknologi. 12(1):43-47.ISSN 1693–4393. McleanJ. and Terry J. Beveridge. 2001. Chromate Reduction by A Pseudomonad
Isolatd From A Site Contaminated with Chromated Copper Arsenate. Applied
and Environmental Microbiology60(30):1076–1084, DOI:
10.1128/Aem.67.3.1076–1084.2001.
Nextprot. 2011. www.nextprot.org/db/term/GO%3A0034567. Diunduh pada tanggal 15 agustus 2014.
Nies DH and SilverS. 1995. Ion efflux systems involved in bacterial metal resistances. Journal of Industrial Microbiology, 14, 186-199. 0169-4146/95/$09.00.
Opperman, Piater, dan van Heerden. 2008. A novel chromate reductase from Thermus scotoductus SA-01related to old yellow enzyme.Journal of bacteriology,190(8):3076–3082.DOI: 10.1128/JB.01766-07.
Park CH, Keyhan M, Wielinga B, Fendorf S and Matin A. 2000.Purification to homogeneity and characterization of a novelPseudomonas putida chromate reductase. Applied and Environmental Microbiology,66 (5):1788–1795. DOI: 10.1128/AEM.66.5.1788-1795.2000.
Pattanapipitpaisal P and Reakyai T. 2013. Cr(VI) reduction by cell-free extract of thermophillic Bacillus fusiformis NTR9. Songklanakarin J. Sci. Technol. 35 (4): 407-414.
Ramírez-Díaz MI, Díaz-Pérez C, Vargas E, Riveros-Rosas H, Campos-Garcia J, Cervantes C. 2008. Mechanisms of bacterial resistance to chromium compounds. BioMetals 21: 321-332.
24
Slamet, Arbianti, Daryanto. 2005. Pengolahan limbah organik (fenol) dan logam berat (Cr6+ atau Pt4+) secara simultan dengan fotokatalis TiO2, ZnO-TiO2, dan CdS-TiO2. Makara. Teknologi. 9(2):66-71.
Sunardi. 2011. Penurunan kadar krom(VI) dengan Sargassum sp, Saccharomyces cerevisiae dan kombinasinya pada limbah cair industri batik.Jurnal Ekosains. 3(1):27-3.
Walker NJ. 2002.Tech.Sight :A technique whose time has come,Science.296:557– 559.
Zakaria ZA, Zakaria Z, Surif S, AhmadaWA. 2007. Hexavalent chromium reduction by Acinetobacter haemolyticusisolatd from heavy-metal contaminated wastewater. Journal of Hazardous Materials. 146:30–38. DOI:10.1016/j.jhazmat.2006.11.052
25
Lampiran 1.Hasil uji SRA pada Bacillus sp.
Analysis of Variance for reduksi
Lampiran 2. Hasil uji SRA pada Pseudomonas sp.
26
Lampiran 3. Hasil uji SRA pada Geobacillus sp.
Analysis of Variance for reduksi
27
pH 1 13.57 13.57 13.57 0.29 0.616 Square 3 1499.17 1499.17 499.72 10.85 0.022 suhu*suhu 1 229.32 64.73 64.73 1.41 0.301 konsentrasi*konsentrasi 1 1253.76 1259.92 1259.92 27.37 0.006 pH*pH 1 16.09 16.09 16.09 0.35 0.586 Interaction 3 621.72 621.72 207.24 4.50 0.090 suhu*konsentrasi 1 619.51 619.51 619.51 13.46 0.021 suhu*pH 1 2.10 2.10 2.10 0.05 0.841 konsentrasi*pH 1 0.10 0.10 0.10 0.00 0.965 Residual Error 4 184.15 184.15 46.04
Lack-of-Fit 3 181.78 181.78 60.59 25.50 0.144 Pure Error 1 2.38 2.38 2.38
Total 13 3031.65
Lampiran 4. Alat PCR
28
Lampiran 6. Spektrofotometer
29
Bacillus sp.
30
Lampiran 8 Hasil Pewarnaan Spora
Bacillus sp.
31
Lampiran 9 Isolat pada media selektif
MSA
PIA
32
Lampiran 10 Isolat pada media KIA
33
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta tanggal 10 April 1980 dari ayah Sardju dan ibu Suryawati. Penulis adalah putri pertama dari tiga bersaudara. Telah menikah dengan Hardian Rosadi Satrianie dan dikaruniai seorang putri Laura Angelita Satrianie.
Pada tahun 1998 penulis lulusdari Sekolah Menengah Analis Kesehatan, Departemen Kesehatan RI, Jakarta. Gelar sarjana Sains diraih pada tahun 2004 lulus dari Fakultas Biologi, Universitas Nasional, Jakarta.
Penulis pernah bekerja sebagai Dosen mata kuliah di STIKes Bhakti Husada, Cikarang Bekasi (2012-2014) dan Guru mata pelajaran di SMK Bina Husada Mandiri, Jatiasih, Bekasi (2012-2014).
