Prospek Pengembangan Imunoglobulin Y (lgY) Kering Beku sebagai Nutraceutical Food Anti Enteropathogenic Escherischia coli (EPEC)

PROSPEK PENGEMBANGAN IMUNOGLOBULIN Y (lgY) KERING

BEKUSEBAGAINUTRACEUnCALFOOD

ANTI

ENTEROPATHOGENIC Escherichia coli

(EPEC)

RUDI RAWENDRA

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

PROSPEK PENGEMBANGAN IMUNOGLOBULIN Y (lgY) KERING

BEKU SEBAGAI

NUTRACEUnCALFOOD

ANTI

ENTEROPA THOGENIC Escherichia coli

(EPEe)

RUDI RAWENDRA

Disertasi

Sebagai Salah Satu Syarat untuk Memperoleh Gelar Doktor pada

Program Studi Sains Veteriner Sekolah Pasca Sarjana

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

Judul Oisertasi

Nama NRP

Program Studi

Prospek Pengembangan Imunoglobulin Y (lgY) Kering Beku Sebagai Nutraceutical Food Anti Enteropathogenic Escherichia coli (EPEe) Rudi Rawendra

B 161020041 Sains Veteriner

Disetujui Komisi Pembimbing

Dr.drh. I Wayan Teguh Wibawan, MS Ketua

Prof. Dr. Fachriyan Hasmi Pasaribu Anggota

Dr. Ir. Rahmat Pambudy. MS Anggota

Ketua Program Studi Sains VellerilnE

drh. BarnballlO

iIIok,lah Pascasarjana

vaflnda Manuwoto, M.Sc.

Tanggal Lulu.: 1

3

JUL

1Il6

Abstrak

RUDI RAWENDRA. Prospek Pengembangan Imunoglobulin Y (lgY) Kerlng Beku Sebagai Nutraceutical Food Anti Enteropathogenic Escherichia coli

(EPEC). Dibimblng Oleh : I WAYAN TEGUH WlBAWAN. FACHRIYAN HASMI PASARIBU dan RAHMAT PAMBUDY

Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) merupakan palogen penling penyebab diare pada anak dibawah 2 tahun, khususnya bayi berumur kurang dan 6 bulan di negara ber1<:embang. Isolat lapangan EPEe galur K1.1 setelah

direidentifikasi digunakan sebagai bahan whole killed vaksin yang disuntikkan secara intravena pada ayam petelur single comb white leghom berumur 34 minggu. Setelah imunoglobulin Y (lgY) anli EPEC ditemukan dalam serum darah melalui uji agar gel precipitation test

(AGPn.

telur dikoleksi dan dipisahkan komponen IgY dan kuning telur dengan teknik water dilution method yang kemudian dikering bekukan. IgY Kering Beku Terdenaturasi oleh pH, pepsin, tripsin dan suhu maupun IgY WSF Kering Beku yang tidak didenaturasi kemudian diuji aktivitas netralisasinya dengan teknik enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Selain bertujuan untuk memproduksi IgY Kering Beku, penelitian ini juga mempelajari efikasinya secara in vitro dan in vivo. IgY Kering Beku yan9 dihasilkan mampu menghambat pertumbuhan EPEe pada media trypticase soy broth, mampu menghambat perlekatan EPEe pada sel kultur HEp-2, mampu menghambat perlekatan EPEe dan lesi attaching and effacing pada intestinal anak kelinci yang diinfeksi EPEe. Karakter IgY Kering Beku yang dihasilkan menunjukkan kemampuan cross reactivity terhadap EPEe gaJur K 1.3, K 1.5 dan tidak ditemukan didalam serum darah tikus putih setelah hewan coba tersebut diberi IgY secara per oral. Produksi telur anti EPEe memerlukan tambahan biaya sebesar 6,3 sampai 16,7

%

dari total biaya produksi telur.

Kata Kunci. Imunoglobulin Y (lgY). enteropathogenic Escherichia coli (EPEC).

Abstract

RUDI

RAWENDRA.

Application

Prospect

of

Freeze-Dried

Immunoglobulin

Y

(lgY)

as an

Anti Enteropathogenic Escherichi!,?oli

(EPEC) Nutraceutical Food. Advisory committee:

I WAYAN TEGUH

WIBAWAN, FACHRIYAN HASMI PASARIBU and RAHMAT PAMBUDY

Enteropathogenic Escherichia coli (EPEe) is the most . .important pathogen that causes diarrhea on infants less than 2 years old, especially babies under 6

months old in developing countries. Field isolates of EPEe K 1.1 strain after

reidentification is used as a whole killed vaccine that intravenously applieated to ｾ･･ｫＬＭｯｬ､＠ single comb brown legtrom /tIyer. After immunoglobulin Y (I9Y) anti EPEC was founded in serum by agar gel precipnation test (AGPT). eggs were

collected, IgY was separdted from yolk using water dilution method and then freeze dried. Freeze dried IgY was denaturized by pH, pepsin, trypsin and temperature, as well as the undenaturated then were tested its neutralization activity using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Besides aiming to produce freeze dried IgY, this research also studied its in vitro and in vivo effication. The produced freeze dried IgY were able to inhibit EPEe growth on trypticase soy broth media, EPEe adhesion on HEp-2 cell culture as we.!! as EPEC adherence, lesions attaching and effacing on EPEe infected young rabbits intestine. Characteristic founded from freeze dried IgY showed cross reactivity to EPEe K 1.3, K 1.5 strain and were not founded in mouse serum after the experimental animal were given IgY per oral. The production of anti EPEC IgY

required an additional 6.3 to 16.7% cost from the total egg production

cost.

Keywords: Immunoglobulin Y (lgY). enteropathogenic Escherichia coli (EPEC).

PRAKATA

Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah

SNT

atas segala ｫ｡ｲｵｮｩ｡ｾｎｹ｡＠

sehingga karya ilmiah ini berhasil diseJesaikan. Disartasi ini memuat lima bab

yang menyangkut penelitian tentang produksi, karakterisasi, pengujian in vitro,

pengujian

in vivo

dan analisa tambahan biaya untuk menghasilkan kuning telur

anli enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) maupun imunoglobulin Y (lgY)

Kering Beku anti EPEC. Penelilian yang dilaksanakan sejak bulan April 2003

hingga April 2005 ini mendapal dukungan dana Hibah Pasca tahun 2004.

Terima kasih kepada Dr. drh. I Wayan Teguh Wibawan MS, Prof. Dr. drh

Fachriyan Hasml Pasaribu, Dr. Ir. Rahmal Pambudy MS, drh Bambang Ponljo

Priosoeryanlo MS. PhD, Dr. drh. Heru Selijanlo, Dr. drh. Kamalluddin Zarkasie,

Dr. drh. Relno 0 Soejoedono MS, Dr. dr. Sri Budiarti, drh. Sri Laksmi Damayanti

Joesoef PhD, Dr. drh Ita Djuwila M.Ph:l, Dr. Sinis Munandar, Ir. Sapuan Tinggal

M.Ed, Dr. Ir. Momon Rusmono MS, Heri Badjuri M.Sc, drh Roesian Isdhianlo, drh

lia SRi Halimah MSi, Dr. drh. Sri Eslur.ingsih MS, Prof. Dr. drh. Bibiana Lay

M.Sc, Dr. drh. Bambang Purwantara, Prof. Dr. Ir. Rudy Tarumingkeng, drh.

Hemomoadl Huminlo MVS, drh. Ekowati Handrayani MS PhD, drh. Dewi Ralih Agungpriyono PhD, Dr. drh. Risa TIuria Tampubolon MS, Dr. Ir. Bambang

Kiranadl MS, Prof. Ir Wasmen Manalu MSc PhD, Dr. drh. Marthen B Malole MSc,

Prof. Dr. Ir. Zairin MS, drh. Adi Winarto MS PhD, Dr. drh. Setyo Widodo, drh.

Widianlo Dwi Suryo M.Sc PhD, drh. Umi Cahyaningsih MS PhD, drh. I Kelut

Mudile Adyane MSi, Agus Somantri SPd, Suryono, drh Chandramaya

lJamayanti, Yayan Herdiansyah SKH, Binsar Riyadi SKH, Dhodon Ramdhona,

Pipit Surya, Tn Wahono, Indardi, Hellen Fadma dan Oeo Rawendra atas

konstribusi pemikiran, fasilitas dan tenaganya selama pelaksanClar. proses

penelitian maupcn penulisan disertasi ini.

Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Juni 2005

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan pada 30 Juni 1958 di Satu, sebagai anak kedua dari

enam bersaudara dan ayah loekito Handroyo (aim) dan ibu Suhartati.

Setelah lulus dan Sekolah Pertanian Menegah Atas Negeri Malang pada tahun 1976, penulis melanjutkan pendidikan di Tingkat Persiapan Bersama

Institut Pertanian Bogor. Pada tahun 1978 melanjutkan di Fakultas Kedokteran

Hewan Institut Pertanian Bogor, lulus sebagai Sarjana Kedokteran Veteriner

tahun 1981 dan lulus sebagai Dolder Hewan di tahun 1982. Tahun 1989,

melanjutkan program magister pada School of Food Science and Technology,

The University of New South Wales, Sydney-Australia dan lulus tahun 1991.

Mulai tahun 2002 melanjutkan program Doktor pada program studi Sains

Veteriner di Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.

Sejak tahun 1982 sampai 1985 penulis bekerja sebagai Technical Service

PT. Pyridam yang ditempatkan di wilayah Jawa Timur dan Indonesia Bagian

Timur. Tahun 1986 sampai sekarang bekerja di Badan Pengembangan Sumber

Daya Manusia Pertanian - Departemen Pertanian yang saat ini bertugas sebagai

dosen di Sekolah Tinggi Penyuluhan Pertanian Malang.

Penulis menikah dengan drh. Masdiana Chendrakasih Padaga,

M.App.Sc, PhD pada tahun 1982 dan dikaruniai seorang putra. Paduan Deoly

DAFTAR lSI

DAFTAR TABEL... iii

DAFTAR GAMBAR ... iv

DAFTAR LAMPIRAN ... v

DAFTAR SINGKATAN... vi

PENDAHULUAN .... ,...

1

Latar Belakang... 1

Perumusan Masa/ah ... '... 2

Tujuan Penelitian ... ... ... ... 2

Manfaat Penelitian ... ,... 3

Hipotesa ... 3

TINJAUAN PUSTAKA...

4

Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) ... 4

Patogenesis dan Faktor Virulensi... 5

1. Patogenesis...

5

2. Faktor Virulensi ... ...

6

Gejala Klinis, Patologis dan Diagnostik ... 8

1. Gejala Klinis ...

8

2.

Patologis ...

9

3.

Diagnosa...

11

Terapi ... 12

Imunoglobulin Y (lgY) ... 12

Produksi IgY ... 13

Struktur dan Stabilitas IgY... 15

Water Soluble Fraction Ig y... 17

Pemanfaatan IgY Sebagai rmunoterapi Peroral EPEe... 18

PRODUKSIIMUNOGLOBULIN Y (lgY) KERING BEKU ANTI ENTROPA THOGENIC Escherichia coli (EPEC) Abstrak ... ... 20

Abstract ... ... ... ... ... 21

Pendahuluan... ... ... ... 22

Bahan dan Metode.. ... ... ... ... 22

Hasil dan Pembahasan ... ... ... 27

Simpulan... .. ... ... 34

Pustaka... ... ... ... ... 35

AKTIVITAS NETRALISASI FRAGMEN DAN EFEK SISTEMIK IMUNOGLOBULIN Y (lgY) KERING BEKU ANTI ENTROPA THOGENIC Escherichia coli (EPEC) Abstrak ... ... ... 38

Abstract ...

39

Pendahuluan... ... ...

40

Bahan dan Metode... ... 42

Hasil dan Pembahasan... 45

Simpulan... .. ... ... ... 50

EFEKTIVITAS IMUNOGLOBULIN Y (lgY) KERING BEKU ANTI

ENTROPATHOGENIC Escherichia coli (EPEC) DALAM PENGHAMBATAN PERTUMBUHAN DAN ADHESI

Abstrak ... 53

Abs/Tact ... ... 54

Pendahuluan ... '" .... '"... 55

Bahan dan Metode ... '" .. '"... 56

Hasil dan

Pembahasan...

58

Simpulan... ... 64

Pustaka... 64

EFEKTIVITAS PEMBERIAN PERORAL IMUNOGLOBULIN Y (lgY) KERING BEKU ANTI ENTROPA THOGENIC Escherichia coli (EPEC) IN VIVO Abstrak ... 66

Abs/Tact ... ... ... ｾ＠

7

Pendahuluan... 68

Bahan dan Metode... 69

Hasil dar. Pembahasan... 71

Simpulan... ...

76

Pustaka... ... ...

76

TAMBAHAN BIAYA DAN POTENSI NILAI TAMBAH USAHA TELUR BERKASIAT OBAT Abstrak ... ... 79

Abs/Tact ... 80

Pendahuluan... 81

Bahan dan Metode... 82

Hasil dan Pembahasan... 86

Simpulan... ... ... 92

Pustaka... 92

PEMBAHASAN UMUM ... ... 94 SIMPULAN DAN SARAN ... . DAFTAR PUSTAKA ... .

LAMPIRAN ... .

106

107

DAFTAR TABEL

1. Patotipe dan fakter virulens E coli . ... ... ... ... ... 4

2. Pola ｰ･ｾ･ｫ｡Ａ｡ｮ＠ E. coli pada sel kultur ｈｅｾＲ＠ ... 11

3. Perbandingan proses dan produksi IgY terhadap IgG ... 14

4. Perbandingan struktur dan stabilitas IgY terhadap IgG ... 16

5. Penelitian pemanfaatan IgY sebagai Imunisasi pasif peroral... 19

6. Pelaksanaan vaksinasi ... 24

7. Hasil uji biokimiawi isolat Escherichia coli ... 28

8. Awal pembentukan respon imun rute vaksinasi intramuskuler ... 30

9. Konsentrasi protein dan IgY Kering Beku ... 30

10. Respon imun tertinggi n.Jte vaksinasi intramuskuler ... 32

11. Bera! molekul fragmen IgY ... 46

12. ELISA Unit serum darah tikus putih setelah pemberian IgY peroral.. .... 49

13. Rancangan percobaan efektivitas pemberian IgY anti EPEe ... 71

14. Persentase pertambahan berat badan anak kelinci ... 72

15. Rerata produksi telur ayam ... ... ... 88

16. Tambahan biaya produksi telur berkasiat obat ... 89

17. Biaya produksi 1 kglgY Kuning Telur Kering Beku... 90

DAFTAR GAM BAR

1. Patogenesis EPEC ... ;... 5

2. Sistem sekresi Tipe III dan pemindahan TIR ...

7

3. Perkiraan mekanisme diare akibat infeksi EPEe ...

9

4. Struktur pedestal-like dan intimate binding EPEe ... 10

5. Struktur Ig G, IgY, dan deletion IgY (liFe) ... 15

6. Pola perlekatan isolat pada sel kultur HEp-2 ... 28

7. AGPT serum darah ... 29

8.

Aktivitas netralisasi IgY anti EPEe gatur K1.1 ... 31

9. Cross reactivity IgY anti EPEC galur K1.1 ... 34

10. Berat motekul fragmen IgY Kering

Beku...

45

11. Aktivitas netralisasi fragmen IgY Kering Beku ... 47

12. Aktivitas dan kapasitas fagositosis makrofag ... 50

13. Efektivitas penghambatan adhesi berbagai dosis IgY pada Sel HEp-2. 59 14. Sel kultur Hep-2 terinfeksi EPEC ... 59

15. Kurva normal pertumbuhan EPEC pada media TSB ... 60

16. Penghambatan pertumbuhan EPEC di TSB ... 61

17. Penghambatan pertumbuhan EPEC di TSB oleh IgY terdenaturasi ... 63

18. Intestinal normal dan terinfeksi EPEC ...

73

19. Penghambatan periekatan dan lesi AlE EPEe pada permukaan sel epitel anak kelinci .... ... ... 74

20. Lesi attaching and effacing ... 75

21. Pemindahan IgG oleh reseptor FcyRn ... 101

DAFTAR LAMPIRAN

1. PRODUKSI IMUNOGLOBULIN Y (lgY) KERING BEKU ANTI

ENTROPATHOGENIC Escherichia coli (EPEC) ... 116 2. AKTIVITAS NETRALISASI FRAGMEN DAN EFEK SISTEMIK

IMUNOGLOBULIN Y (lgY) KERING BEKU ANTI ENTROPATHOGENIC Escherichia coli (EPEC) ... 127 3. EFEKTIVITAS IMUNOGLOBULIN Y (lgY) KERING BEKU ANTI

ENTROPATHOGENIC Escherichia coli (EPEC) DALAM PENGHAMBATAN PERTUMBUHAN DAN ADHESI... 136 4. EFEKTIVITAS PEMBERIAN PERORAL IMUNOGLOBULIN Y (lgY) KERING

BEKl.I ANTI ENTROPATHOGENIC Escherichia coli (EPEC) IN VIVO ... 141

5. TAMBAHAN BIAYA DAN POTENSI NILAI TAMBAH USAHA TELUR

AGPT

ASI

Baduta

BFP

BHI

BSA

CFU

DAEC

DMEM

eae

EAEC

EAF

EHEC

EIEC

ELISA

EMB

EPEC

EspA

EspB EspD Esps

ETEC

EU

Flab)" Fab

FAS

Fe FeyRn

FDA

FPLC

GRAS

HAMA

HeLa

HEp-2

IL-8

ITP

LA

LDL

LEE

Lesi AlE

LPS

LT

MALT

MLC

NF-K-B

NMEC

N-WASP

OMP

PCR

PMN

DAFTAR SINGKATAN

Agar gel precipitation test Air susu ibu

Bawah 2 tahun Bundle forming pi/lus Brain heart infusion Bovine serum albumin Colony fanning unit

Diffusely adherent Escherichia coli Qubellco minimal essential medium Escherichia coli attaching and effacing Enferoaggregative Escherichia coli EPEe adherence factor

Enterohaemoffhagic

E.

coH Enteroinvasive E. coli

Enzyme-linked immunosorbent assay

Eosin methylene blue

Enteropathogenic Escherichia coli EPEe secreted protein A

EPEC secreted protein

B

EPEe secreted protein D

EPEe

secreted proteins

Enterotoxigenic Escherichia coli

ELISA Unil

Fragman antigen binding sites Fragmen antigen binding site Fluorescent actin staining Fragmen crysfalization

Frogmen crystalization gamma receptors Food Drug Administration

Fast performance liquid chromatography Generally regarded as safe

Human anti-mouse IgG antibodies Human laryngotrachealis

Human epidermoid carcinoma Interleukin-B

1 ,4,5-lnositol TriPhosphat Localized adherence Low density lipoprotein

Locus of enterocyte effacement Lesi attaching and effacing Lipopolisakalida

heat-labile toxin

Mucosa-associated lymphoid tissue Myosin light chain

Necrosis factor -1(-8

Neonatal meningitis Escherichia coli Non Wiskoff-Aldrih syndrome

Rantai H Rantai L

ROEC-1

Region V

REPEC

RF

SOS-PAGE

slgA

SLT

SPF

-S-S-ST

Tir

TPC

TSB

TTSS

UPEC

WSF

liFe IgY

v y Rantai Heavy

Ranta; Light

Rabbit diarrheagenic Escherichia cofi-1 Region variable

Rabbit enteropathogenic Escherichia coli Rheumatoid factor

Sodium dodeeyl sulphat<>-poly aerylamide gel electrophoresis Secretory IgA

Shiga-like toxin

Specified pathogen free Ikatan disulfida

Heat-stable toxin

Translocated intimin receptor Total plate count

Trypticase soy broth

Type three secretion systems Uropathogenic Escherichia coli Water soluble fraction.

Deletion Fc IgY Upsilon

PENDAHULUAN

Lata, Belakang

Kasus gang9uan diare dan gastroenteritis di Indonesia pada tahun 2003 sebanyak 160-430 per 1000 penduduk dan menduduki urutan pertama (8,0%) dari 10 peringkat utama pasien rawat inap. Dari jumlah tersebut 70-80% ｴ･ｾ｡､ｩ＠ pada anak-anak dan bayi dibawah 5 tahun (Statistik Rumah Sakit Indonesia 2004). Data WHQ (2003) menunjukkan bahwa lebih dari 2 juta bayi dan anak berusia dibawah 5 tahun di dunia meninggal setiap tahunnya dan berkaitan erat

dengan kondisi malnutrisi. Scaletsky at aJ. (2002) me:aporkan bahwa

enteropathogenic Escherichia coli (EPEe) merupakan penyebab diare paling saring terjadi diantara enteroinvasive E. coli (EIEC), enterohaemorrhagic E. coli

(EHEC), enterotoxigenic E. coli (ETEC), enteroaggregative E. coli (EAEC) dan diffusely adherent E. coli (DAEC) Salmonella spp, Shigella spp., Campylobacter spp., Yersenia entero/ffica, Rotavirus, Giardia lamblia, Entamoeba histolytica, dan Cryptosporidium spp. pada bayi dan anak di negara berkembang. Budiarti (1997) melaporkan bahwa 55% sam pel feses hasil survei bayi dan anak-anak yang menderita diare didaerah Purwodadi Jawa Tengah, Depok, Ciamis dan Ciawi Jawa Barat serta Sambas Kalimantan Barat, positif EPEC.

Infeksi EPEC menyebabkan 30 sampai 40% penderita mengalami kematian akibat dehidrasi pada bayi dibawah 2 tahun (cenderung pada bayi berusia dibawah 6 bulan, prematur atau berat lahirnya dibawah normal) dengan gejala diare akut berair, muntah dan sedikit demam (Co/lington et al. 1998). Program pencegahan infeksi dengan memberikan ASI, memperhatikan sanitasi dan mencegah kontak feca/-oral tidak menunjukkan hasil yang menggembirakan, sedangkan upaya memanfaatkan teknologi vaksinasi belum ada yang melakukan (Nataro & Kaper 1998). Pengobatan dilakukan dengan memberi rehidrasi peroral maupun rehidrasi parenteral (Nataro & Kaper 1998), sedangkan pemberian antibiotik kadang-kadang berhasil, namun sebagain besar mengalami resistensi (Donnenberg et al. 1995). Rancang bangun penggunaan vaksin aktif sulit dilakukan karena sistem imun bayi belurn berkembang (Hatta et al. 1993).

Penggunaan imunisasi pasif peroral dapat menghambat perlekatan bakteri pada permukaan sel intestinal akibat ikata:1 spesifik antara patogen dengan antibodi yang akan membantu musin dan sma untuk mengeluarkan patogen (Sunwoo et 81. 2002). Irnunoterapi pasip peroral biasanya menggunakan

2

memiliki keterbatasan teknis, ekonomis dan animal welfare, sehingga

imunoglobulin (lgY) telur ayam berpeluang sebagai lrnunoterapi peroral

menggantikan IgG (i\lline 1997) dan berperan sebagai nutraceutical food

(Stadelman 1999; Sunwoo et 01. 2003)

IgY merupakan antibodi pada kuning telur ayam yang akan ditransferkan

kepada anak ayam selama proses penetasan untuk digunakan sebagai

kekebalan anak ayam setelah ditetaskan. Jenis dan jumlah antibodi spesifik

dalam kuning telur, .menggambarkan jenis dan jumlah antibodi serum darah induk

yang diperoleh akibat infeksi alami maupun vaksinasi (Davis & Reeves 2002). Produksi IgY melalui kuning telur menunjukkan produktivitas lebih tinggi,

pembiayaan lebih murah dan prosedur pemanenannya lebih memperhatikan

animal welfare dibandingkan produksi IgG melalui serum darah (Li-Chan 2000).

Penggunaan IgY sebagai imunisasi pasif peroral pada kasus Salmonellosis

(Yokoyama et al.1998), Human Rotavirus (Halta et al. 1993) darl Cystic vibrosis

(Car1ender 2002) menunjukkan efikasi yang baik, sehingga penelitian ini

bertujuan untuk menghasilkan IgY anti EPEC.

Pemanfaatan IgY spesifik kuning telur segar memberikan efikasi yang lebih

baik dibandingkan memanfaatkan komponen IgY yang telah dipisahkan dari

komponen kuning telur lainnya (Schmidt et al. 1993), namun penggunaan IgY

kuning telur segar anti EPEe pada bayi merupakan hal yang sulit dilakukan. IgY

kuning telur dapat dipisahkan dari komponen kuning telur lainnnya dengan

menggunakan water dl7ution method yang dlkembangkan oleh Akita & Nakai (1992). Metode ini memenuhi persyaratan teknik pemisahan bahan pangan

disamping praktis, ekonomis dan dapat dilakukan pada skala industri, namun

meningkatkan volome water soluble fraction (WSF) menjadi 10 kali volorne

kuning telur (Akita & Na!<ai 1993). Upctya mengurangi pelarut air pada IgY tersebut disarankan menggunakan teknik freeze drying dibandingkan teknik

spray drying untuk mengurangi kontaminasi mikroba selama proses produksi

(Rousell & McCue 1991) selain dapat mempertahankan aktivitas netralisasim IgY sampai 2 tahun (Sunwoo et al. 2002).

Perumusan Masalah

1. EPEC merupakan patogen yang hanya menyerang bayi dan anak (Tobe &

Sasakawa 2002), sehingga vaksinasi EPEC pada ayam be/um dapat

dipastikan dapat memberikan respon pembentukan antibodi dalam jumlah

3

imunoterapi peroral memer1ukan dosis yang besar akibat denaturasi pH dan

enzim saturan pencemaan setelah diberikan melalui peroral pada bayi (Hatta

et al. 1993).

2.

Aktivitas netralisasi IgY akan berkurang atau hilang akibat proses pemisahan

IgY dan komponen kuning telur (Schmidt et al. 1993) dan pengenngan beku

(Skrabanja et al. 1994).

Tujuan Penelitian

1.

Menghasilkan fwtraceutical food berupa imunoglobulin Y (lgY) Kering Beku

anti EPEe yang memiliki efikasi untuk mencegah infeksi EPEe.

2. Menghitung biaya tambahan untuk menghasilkan telur berkasiat obat.

Manfaat Penelitian

Menghasilkan teknologi produksi nutraceutical food IgY Kering Beku anti

EPEe dan menghasilkan kajian prospek pengembangan teknologi tersebut

dalam mengembangkan usaha produksi telur berkasiat obat.

Hipotesa

1. IgY Kering Beku anti EPEe dapat digunakan sebagai imunoterapi infeksi

EPEe

2. Teknologi produksi telur yang mengandung IgY berkasiat obat memberi

peluang nilai tam bah bagi usaha petemakan ayam petelur dan industri hilir

TINJAUAN PUSTAKA

Enterophatogenic Escherichia coli

(EPEe)

Selain sebagai bakteri commensal, Escherichia coli merupakan patagen ekstraintestinal dan intestinal manusia dan hewan. Gangguan ekstraintestinal berupa i ... feksi uropathogenic E. coli (UPEC) dan neonatal meningitis E. coli (NMEC) sedangkan gangguan intestinal menyebabkan diare yang berdasarkan

patogenesisnya ､ｩｾ･ｬｯｭｰｯｫｫ｡ｮ＠ sebagai enteropathogenic E. coli (EPEe). enteroinvasive E.

cO/i

(EIEC), enterohaemorrhagic E. coli (EHEC), enteroloxigenic

E.

coli (ETEC), enteroaggregative

E.

coli (EAEC) dan diffusely adherent

E.

coli (DAEC) (Donnenberg & Nataro 2000). Gambaran klinik, epidemiologi dan faktor virulensi E. coli patagen disajikan pada Tabel 1.

T abel 1 Patotipe dan fakter virulens

E.

coli

Patotipe Gambaran Klinik Gambaran Faldor Virulensi

Epidemiologi

EPEe Oiare berair, Bayi di negara BFP; intimin; Tir; TTSS;

muntah berkembang

?;

non invasit, bukan

L T, ST maupun SL T EHEC Diare berair, kolitis Food-borne; water- Adhesin; Sl T; attaching

berdarah, borne; di negara and effacing, invasif;

hemolytic-uremic maju bukan l T maupun ST

syndrome (HUS)

ETEC Diare berair, tidak Anak di negara Pili; non invasit, l T dan

demam dan berkembang; ST

peradangan travelers' diarrhea

EAEC Diare mukus- Anak-anak Pili; cytotoxins; non

EIEC

DAEC UPEC

NMEC

persisten, tidak invasff; Sl T;

demam dan hemolisin,

peradangan

Disentri, diare berairFood-bome Non fimbria adhesin; OMP invasi seluler; SL T dan motilitas intraseluler Sedikit kajian

Cystitis,

pyelonephritis

Acute meningitis

Anak besar

?

Organ kelamin wClnita Type I and P fimbria; hemolysin;

Bayi baru lahir

pathogenicity islands K1 capsule; S fimbria;

cellular invasion

Keterangan. BFP (Bundle forming pilus), Tir (Translocated inlimin receptors), TTSS (Type three secretion systems), LT (Heat labile toxin), ST (Heat stable toxin), SLT

(Shiga like toxin), OMP (Outer membrane proteins), ? (belum diketahui) (Nataro & Kaper 1996).

5

sebagai EPEC (Nataro & Kaper 1998). Scaletsky et al. (2002) melaporkan bahwa

EPEe

merupakan penyebab diare paling sering ｴ･ｾ｡､ｩ＠ diantara EIEC, EHEC, ETEC, EAEC, DAEC, Salmonella spp., Shigella spp., Campylobacter

spp., Yersenia enterolitica, Rotavirus, Giardia Jamblia, Entamoeba histo/ytica, dan Cryptosporidium spp. pada bayi dan anak di negara berkembang.

Patogenesis dan Faktor Virulensi

1. Patogenesis

I"feksi EPEe terjadi akibat kontak ora/-fecal (Goosney et al. 2000) dimana

penularan orang-perorang merupakan kasus yang paling sering terjadi (WU & Peng 1992). Inteksi akibat pangan terkontaminasi jarang terjadi meskipun dapat

ditularkan melalui air dan produk-produk daging tercemar yang tidak dimasak

dengan baik (Viljanen et al. 1990).

Kegagalan sistern pertahanan mukosa intestinal berupa produksi musin

(sebagai penghalang fisik, pelumas, menghasilkan senyawa bakteriostatik maupun bakteriosidal sel) oleh sel goblet, aktivitas sel MALT (yang memproduksi secretory IgA) dan mikropili (yang mendorong musin dan bakteri keluar dari membrana mukosa) dalam mencegah adhesi EPEC akan mengawali

infeksi EPEe (Salyer & Whitt 1994).

,

-

Ｍｾ＠

-

--

-•

-=-

Ｍｾ＠

-

-,

--

_ｾﾭ

-

_.

--

-Gambar 1 Patogenesis EPEe. Model 3 tahapan patogenesis EPEe menurut Nataro & Kaper (1998) (A) dan model 4 tahapan patogenesis EPEe menurut Hicks et al (1998) (B). Terdapat perbedaan peran BFP pada tahap pertama dan keempat, sedangkan mekanisme lain dan faktor viruJensi lainnya (sekresi protein,Tir, intimin dan molekul efektor lainnya) adalah sarna.

6

Donnenberg & Kaper (1992) yang menggunakan sel kultur HEp-2, Nataro & Kaper (1998) menduga bahwa patogenesis EPEe ｴ･ｾ｡､ｩ＠ dalam 3 tahap; tahap pertama, localized adherence (LA) yang ditandai perlekata:-, tidak erat (non-intimate binding) yang diperantarai oleh bundle forming pi/us (BFP): tahap kedua, transduksi sinyaJ yang diperantarai sekresi protein EPEe (Esps); dan tahap

ketiga, pengikatan erat (intimate binding) yang melibatkan intimin dan Tir

(Translocated intimin receptor').

Analisa lain dikemukan Hicks et al. (1998) yang menggunakan jaringan usus manusia. menduga adanya 4 tahap patogenesis EPEe. Tahap pertama, ditandai nO'l-intimate binding yang dimediasi adhesin dan bukan oleh BFP;

Tahap kedua, transduksi sinyal yang dimediasi oleh sekresi protein; Tahap

ketiga, intimate binding antara intimin dan Tir yang menyebabkan lesi attaching and effacing (AlE); Tahap keempat, kolonisasi yang dimediasi oleh BFP.

2. Faldor Virulensi

Bundle forming pilus (BFP)

Perlekatan EPEC pada sel intestinal diawali dengan perlekatan tidak erat (non intimate binding) antara EPEC yang diperantarai pili (Vallance & Finlay 2000). Urutan amino struktur protein utama pili menunjukan sebagai fimbria tipe IV (Giron et aJ. 1991) seperti ekspresi patogen Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholera, Neisseria gonorrhoeae, Moraxella bovis dan DicheJobacter nodusus (Stone et s/. 1996). Fimbria tipe IV ini cenderung membentuk bundles pada kondisi kultur tertentu, sehingga Giron et al. (1991) mengusulkan disebut sebagai

bundle forming pilus (BFP). Kajian-kajian tersebut menjadi terbuka setelah Cravioto et al. (1979) menunjukkan bahwa EPEC mampu melekat pada sel kultur human epidenl10id carcinoma (HEp-2).

Sekresi Protein dan Translocated Intimin Reseptor (Tir)

Menurut Nataro & Kaper (1998), keberadaan enterotoksin EPEe belum dapat menjelaskan kejadian diare akibat infeksi EPEC, meskipun telah diketahui bahwa EPEC mensekresikan 4 jenis EPEe secreted proteins (Esps) dan tiga diantara menimbulkan lesi AlE, yaitu EspA (EPEe secreted protein A), EspB (EPEe secreted protein B) dan EspD (EPEe secreted protein D).

7

atau sistem sekresi tipe III (DeVinney et al. 1999). Mutasi salah satu gen penyandi sekresi protein tersebut akan menghilangkan kemampuan EPEe dalam melakukan transduksi sinyal , namun penambahan supematan sekresi protein-protein tersebut pada kultur tidak menunjukkan kemampuan melakukan transduksi sinyal. Hal tersebut menunjukkan bahwa ada faklor penting lain yang belum diketahui dalam melakukan transduksi sinyal (Nataro & Kaper 2000).

EspA merupakan filamen pendek menyerupai tabung yang melekatkan pada permukaan 5el inang (Knutton et al. 1998). Sekresi berikutnya bergantung pada keberadaan EspA , yallu Esp8 yang dipindahkan kedalam membrana inang Knutton et al. 1998) dan EspO dimasukkan kedalam sel membran sebagai ujung jarum dari molekul syringe tersebut (Kresse et al. 1999).

Gambar 2 Sistem sekresi tipe III dan pemindahan tlanslocated intimin receptor (fir).

EspA membentuk filamen pendek yang dilekalkan pada permukaan sel inang. kemudian Esp8 dan EspD dimasukkan dalam sel membran inang yang memungkinkan terbentuknya lubang sehi ngga protein efektor lainnya dapat dimasukkan (misalnya Tlr) (Vallance & Finlay 2000).

8

tersusun dari protein dengan berat molekul 90 kOa yang disebut HP-90 atau

selanjutnya disebut sebagai Tir (Nataro & Kaper 1998) (Gambar 2).

Intimin

Perlekatan kuat EPEe pada sel epitel, dimediasi oleh outer membrane

protein (OMP) yang disebut sebagai intimin. Gen-gen penyandi intimin adalah eae (E. coli attaching and effacing) dan gen tersebut berperan dalam

menimbulkan lesi AlE (Jerse et al. 1990). Gen eae juga terdapat pada EHEC,

C. rodentium dan

H.

alve; yang juga berkemampuan menimbulkan lesi AlE,

namun eae tidak ditemukan pada E. coli commensalis atau bakteri-bakteri yang

tidak membentuk lesi AlE. Jika gen penyandi ini disingkirkan, maka efek

perlekatan kuat menjadi hilang, "amun masih dapat melakukan transduksi sinyal (Nataro & Kaper 1998).

Pada infeksi EPEe, reseptor untuk intirnin adalah Tir, namun pada infeksi

Yersenia sp., reseptor untuk intiminnya adalah

/3-1

integrin (Lancer et al. 1995).

Hal ini menunjukkan bahwa intimin dapat mengikat lebih dari 1 reseptor

meskipun belum diketahui dengan jelas reseptor-reseptor apa saja yang dapat

mengikat intimin (Clarke

et

al. 2003). Antibodi intimin menunjukkan efektivitasnya dalam mencegah infeksi EPEC pada sukarelawan (Levine et al.

1985), namun infeksi EPEC mutan dengan menghilangkan peran gen

eae tetap

menunjukkan infeksi EPEC (Donnenberg

et

al. 1993).

Gejala Klinis, Patologis dan Diagnosis

1. Gejala Klinis

Infeksi EPEC menimbulkan gejala umum berupa diare berair akut (kadang

persisten), muntah dan sedikit demam pada bayi dan anak-anak di bawah 2

tahun (Baduta). Umumnya,

3040%

penderita mengalami kematian akibat

dehidrasi pada bayi berusia di bawah 6 bulan, prematur atau berat lahimya di bawah nonnal (Cotlington

et

al. 1998). Kejadian EPEe pada orang dewasa

biasanya terjadi akibat adanya penyakit ikutan lainnya, misalnya diabetes dan

ketuaan (Dannenberg & Nataro 2000).

Mekanisme kejadian diare akibat infeksi EPEe sampai saat ini belum

diketahui dengan pasti. Analisa yang dilakukan oleh Goosney

et

al. (2000)

menduga bahwa mekanisme diare disebabkan hildngnya mikropili sehingga

kemampuan absorbsi dan enzjm-enzjm yang beperan dalam proses absorbsi

9

penyebab diare karena : (a). hiJangnya mikropili bersifat lokalitas di tempat

perlekatan bakteri (Knutton et al 1987) artinya kondisi ini tidak memberikan

dampak kerusakan pada area yang luas pada intestinal, (b). kejadian diare

bersifat akut, sehingga kerusakan yang bersifat lokalitas sulit untuk dipahami.

Faktor lain yang diduga berperan adalah : (a). pembentukan pedistallike yang

diikuti dengan hilangnya mikropili dan perubahan sitoskeletal di tempat

perlekatan balderi , (b) . fosfori/asi myosin light chain (MLC) mengkoyak tight junction mengakibatkan peningkatan permeabilitas paraseluler. Terkoyaknya tight junction memfasilitasi migrasi sel PMN yang juga berdampak pada kejadian diare (Gambar 3). Kejadian diare akut merupakan efek dari sekresi ion CI- atau HC03- , sedangkan kejadian diare persisten cenderung disebabkan oleh

perubahan sitoskeleton dan migrasi sel PMN (Goosney et al. 2000) .

- - -

...

""

.-·'r

-Gambar 3 Perkiraan mekanisme diare akibat infeksi EPEC. Peningkatan permeabltitas dan perubahan sekresi ion

cr

dan HCOl ' menyebabkan perubahan strukturat

yang berdampak pada hitangnya kemampuan absorbsl permukaan, rusaknya

tight junction dan jaringan (Vallance & Finlay 2000).

2. Patologis

Localized Adherence (LA)

[image:196.612.75.536.19.782.2]

10

Walaupun telah diketahui bahwa BFP berperan dalam fenotipe LA dan kemungkinannya berperan dalam adhesi spesies-spesifik (Tabe & Sasakawa 2002), namun belum diketahui apakah BFP terlibat dalam tahap awal adhesi bakteri dan diduga terdapat adhesi lain yang berperan dalam interaksi awal (Clarke et al. 2003). Penggunaan antiserum terhadap BFP hanya dapat

mengurangi LA EPEe pada sel kurtur HEp-2, sehingga BFP bukan satu-satunya

penyebab perlekatan EPEe pada 5el kurtur HEp-2 (Nataro & Kaper 1998). Menurut Dannenberg et 81. (1992) , BFP digunakan untuk perlekatan Ｈ｡､ｾｾｾｾｮｦ･Ｉ＠ antar ｾｐｉＧｃ＠ o"n pukan sebagai al.t perlekatan temadap sel inang.

. Diantara serojipe E'PE'C memiliki gan homolog EAF sel<itar 00 • 90 o/q ,

malahan ｾＮｲｯｴｩｰ･＠ 0 :' 8 tioak momilil<i gan plasmid EAF. ｡･ｲｱＮＤ｡ｲｫｾｮ＠

ｾ･｢ｅｬｲＬＬｾ｡｡ｮ＠ gen plasmid EA,F tersebut, maka dikenal EPEC Typic,,' ＨｮＬＮｲｮｩｬｩｾｩ＠ ｾ･ｮ＠ plasmid EAF) dan EPEC Atypical (tidak merT]ilil<i gen plasmid EAF) Ｈｃｉｾｲｫｾ＠ ｾｴ＠ al. 2003) .

Infeksi EPFC memicu kondisi histopatologi intestinal khas ｰ｡､ｾ＠ biopsi

penderita ｢･ｲｵｰｾ＠ lesi ｎｾＮ＠ Lesi AlE dicirikan adanya lesi ultrastruktur, pada

ｾ･ｭｰｃＧｬｴ＠ EPEe melakukan pertekatan (attaching) kuat antara bakteri ､ｾｮ＠

permukaan sel epitel , hilangnya (effacing) mikropili lokalitas (Moon et al. 1983) , perubahan sitoskeleton dan akumulasi polimerasi aklin di bawah perlekatan bakteri pada set epitel intestinal inang (Frankel et al. 1998). Lesi AlE diperkirakan menganggu produksi enzim sehingga mengganggu sistem absorbsi yang berakibat malabsorbsi nulris; (Fagundes-Neto 1996).

Il'ltimin

PedesCal Base - lTI'fO$ln

n

tropomyOSin

Gambar 4 Struktur pedestal-like dan intimate binding EPEe . Perlekatan kual

[image:197.625.80.530.22.778.2]

11

Pada saat pembentukan pedestal, terjadi fosforilasi protein sitoskeleton.

Diantara protein yang mengalami fosforilasi adalah MLC sehingga mengurangi

ikatan tight junction. Fosforilasi MLC akan membentuk dua isoform protein

berbeda (Manjarrez-Hernandez 1996). Pada awat infeksi fosforilasi MLC menjadi

treonin dan pada saat infeksi berlanjut, MLC mengalami fosforilasi menjadi serin

dan bergabung dengan fraksi sitoskeleton sel inang lain yang mengakibatkan

tight junction terkoyak sehingga terjadi peningkatan permeabilitas paraseluler

dan terganggunya keseimbangan elektrolit (Goosney et al. 2000).

Pada percobaan menggunakan sel kultur, EPEe menghambat proses

fa905it05i5 sehingga mampu membentuk pedestal like dan TTSS (Goosney at a/

1999). Saat protein disekresikan, terjadi aktivasi tirosin fosfat inang sehingga

terjadi defosforilasi protein inang yang diperlukan pada proses fagositosis

(Goosney et al. 2000). Infeksi EPEC juga menginduksi respon peradangan

dengan memicu NF-K-8 yang k3mudian memicu transkripsi IL-8 dan migrasi

PMN dan sel MALT (Savkovic at a/. 1997), disamping memicu sekresi JgA

(Dannenberg et al. 1998).

3.Diagnosa

Nataro & Kaper (1998) menyebutkan bahwa pada Second International Symposium On EPEe ditahun 1995 menetapkan tipikal EPEe diamati adanya

lesi AlE, penggunaan gen EAF plasmid phrobe dan ketidak beradaan shigella

like toxin (SLT). Teknik diagnosa kemudian berkembang untuk membedakan

infeksi EPEC dan infeksi E. coli penyebab diare lain dan E. coli non patogen

melalui uji fenotip menggunakan sel kultur HEp-2 atau HeLa dan uji genotip

menggunakan DNA hybridization atau peR

Tabel2

Tidak Melekat

E. coli non patogen, EIEC, dan ETEC

Pola perlekatan E coli pada sel kultur HEp-2

Patogen EPEC

EAEC

Melekat Pola Perlekatan

Perlekatan lokalitas (Localized adherence)

Perlekatan membentuk agregat

(aggregative adherence)

DEAC Perlekatan dWusi (diffuse Adherence)

Sumber: Mathewson & Cravioto (1989).

Diarrheagenic E. coli dapat diidentifikasi berdasarkan perlekatannya pada

12

kali dijelaskan oleh Cravioto at al. (1979) dan kemudian digunakan untuk

membedakan EPEe dari diarrheagenic

E.

coli lainnya (Tabel 2).

Penggunaan adherence test pada sel kultur HEp-2 ini paling sering

digunakan (Pakpinyo et al. 2002). Teknik pewamaan fluorescent actin staining

(FAS) disarankan untuk mendeteksi fila men aktin, khususnya pada pengamatan

kasus EPEC dan EHEC (Nataro & Kaper 199B).

Terapi

Pengobatan pEmderita EPEe yang belum terlalu parah dapat dilakukan

dengan memberikan rehidrasi peroral, namun pada kasus berat harus dilakukan

pemberian rehidrasi parenteral (Nataro & Kaper 1998). Menurut Dannenberg

(1995) pemberian antibiotik kadang-kadang efektif, namun pada sebagian besar kasus telah menimbulkan resistensi. Cara penanganan lainnya telah diajukan oleh beberapa peneliti diantaranYl3 Mietens et al. (1979) menggunaan kolostrum

susu sapi yang mengandung IgG EPEC, Cravioto et .,. (1991) yang

menggunakan kolostrum susu ibu menyusui yang mengandung IgA, Findlay et

.,. (1992) menggunakan bistmuth subsafieylate, dan Mack et .,. (1999)

menggunakan probiotik Lactobacillus plantarum dan

L.

rhamnosus. Rancang bangun penggunaan imunisasi aktif untuk mencegah infeksi pada bayi sulit dilakukan karena sistem imun bayi yang baru lahir belum berkembang (Hatta et .1. 1993).

Penggunaan antibiotik yang tidak tepat dosis dan waktu pemberiannya akan menyebabkan resistensi, sehingga saat ini semakin banyak dattar patogen yang resisten terhadap beberapa antibiotik (Donnenberg 1995). Menurut Coleman (2002) kecenderungan peningkatan kasus imunosupresi dan penyakit kronis lainnya, memerlukan upaya terapi dengan sediaan yang lebih efektif, murah, aman dan inovatif untuk menghindari kejadian resistensi antibiotik.

Imunoglobulin Y (lgY)

Imunogtobulin Y (lgY), kadang-kadang disebut IgG ayam, IgG kuning telur

13

imunoglobulin Y (lgY). Nama lain dari IgY adalah Chicken IgG, Egg Yolk IgG

alau 7 s/gG (Carlender 2002) (Tabel 4) (Gambar 5). Selain IgY, ayam

mengh&silkan 2 kelas imunoglobulin (Ig) lainnya, yailu IgA dan IgM (Loeken & Roth 1983). Keberadaan IgE dan IgO pada ayam diperkirakan ada namun belum

dibuklikan (Chen et al. 1982).

Produksi IgY

Sistem imul') ayam 5angat responsif terhadap protein asing atau

mikroorganisme yang memapamya (akibat vaksinasi atau infeksi alami) sehingga

kuning telur ayam mengandung lebih dari 200 antibodi yang berbeda (Davis &

Reeves 2002). Menurut Carlender (2002), ayam memiliki sensitivitas tin99i

terhadap protein asing sehingga dalam jumlah sedikit dapat memberikan respon pembentukan antibodi. Keberadaan Hadrian gland didaerah nasotrakheal, payer patches dan Bursa Fabricius disamping organ sistem imun lainya sebagaimana

mamalia memungkinkan unggas 5angat responsif terhadap berbagai protein asing (Coleman 2000).

IgY kuning telur merupakan hasil transfer IgY serum darah kedalam

folikular epitelium ovari dan terakumulasi pada kuning telur selama oogenesis

untuk memberi kekebalan maternal pada anak ayam yang ditetaskan (Loeken &

Rolh 1983). Rose & Orlans (1981) menjelaskan bahwa Iransfer IgY melalui 2 tahapan, yaitu: (a) IgY dipindahkan dari serum kedalam kuning telur

sebagaimana transfer antibodi cross-placental mamalia. Keberadaan reseptor

IgY pada oosit akan mengikat dan memindahkan seluruh IgY serum ke telur. (b).

Pemindahan IgY dari kuning telur kepada embrio.

IgA dan 19M ditransferkan pada putih telur dalam jumlah terbatas (Rose et

al. 1974). Perbedaan isctipe Ig pada lokasi komponen telur ini mungkin

diakibatkan perbedaan tempat sintesa protein. Protein putih telur (albumin) dan

cangkang telur disintesa di dalam oviduk, sedangkan sintesa protein kuning telur

ｬ･ｾ｡､ｩ＠ didalam hali (Davis & Reeves 2002).

Titer antibodi serum darah ayam dapat diperoleh dengan sekali vaksinasi,

namun untuk mendapatkan titer tertinggi dan dipertahankan selama lebih dari 3

bulan perlu imunisasi boostersetiap bulan (Wooley & London 1995). Ayam yang tidak mendapatkan booster, titer antibodinya sama dengan titer antibodi yang

mendapal booster di han ke-200 selelah vaksinasi (Losch et a/. 1986). Jumlah