PROSPEK PENGEMBANGAN IMUNOGLOBULIN Y (lgy) KERING BEKUSEBAGAINUTRACEUnCALFOOD ANTI ENTEROPATHOGENIC Escherichia coli (EPEC) RUDI RAWENDRA

(1)

PROSPEK PENGEMBANGAN IMUNOGLOBULIN Y (lgY) KERING

BEKUSEBAGAINUTRACEUnCALFOOD

ANTI

ENTEROPATHOGENIC Escherichia coli (EPEC)

RUDI RAWENDRA

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR

(2)

PROSPEK PENGEMBANGAN IMUNOGLOBULIN Y (lgY) KERING

BEKU SEBAGAI NUTRACEUnCALFOOD

ANTI ENTEROPA THOGENIC Escherichia coli (EPEe)

RUDI RAWENDRA

Disertasi

Sebagai Salah Satu Syarat untuk Memperoleh Gelar Doktor pada

Program Studi Sains Veteriner Sekolah Pasca Sarjana

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR

(3)

Judul Oisertasi Nama

NRP

Program Studi

Prospek Pengembangan Imunoglobulin Y (lgY) Kering Beku Sebagai Nutraceutical Food Anti Enteropathogenic Escherichia coli (EPEe) Rudi Rawendra

B 161020041 Sains Veteriner

Disetujui Komisi Pembimbing

Dr.drh. I Wayan Teguh Wibawan, MS Ketua

Prof. Dr. Fachriyan Hasmi Pasaribu Anggota

Dr. Ir. Rahmat Pambudy. MS Anggota

Ketua Program Studi Sains VellerilnE

drh. BarnballlO

iIIok,lah Pascasarjana

vaflnda Manuwoto, M.Sc.

Tanggal Lulu.: 1

3

JUL

1Il6

(4)

Abstrak

RUDI RAWENDRA. Prospek Pengembangan Imunoglobulin Y (lgY) Kerlng Beku Sebagai Nutraceutical Food Anti Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC). Dibimblng Oleh : I WAYAN TEGUH WlBAWAN. FACHRIYAN HASMI PASARIBU dan RAHMAT PAMBUDY

Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) merupakan palogen penling penyebab diare pada anak dibawah 2 tahun, khususnya bayi berumur kurang dan 6 bulan di negara ber1<:embang. Isolat lapangan EPEe galur K1.1 setelah

direidentifikasi digunakan sebagai bahan whole killed vaksin yang disuntikkan secara intravena pada ayam petelur single comb white leghom berumur 34

minggu. Setelah imunoglobulin Y (lgY) anli EPEC ditemukan dalam serum darah melalui uji agar gel precipitation test (AGPn. telur dikoleksi dan dipisahkan komponen IgY dan kuning telur dengan teknik water dilution method yang

kemudian dikering bekukan. IgY Kering Beku Terdenaturasi oleh pH, pepsin, tripsin dan suhu maupun IgY WSF Kering Beku yang tidak didenaturasi kemudian diuji aktivitas netralisasinya dengan teknik enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Selain bertujuan untuk memproduksi IgY Kering Beku, penelitian ini juga mempelajari efikasinya secara in vitro dan in vivo. IgY Kering Beku yan9 dihasilkan mampu menghambat pertumbuhan EPEe pada media trypticase soy broth, mampu menghambat perlekatan EPEe pada sel kultur HEp-2, mampu menghambat perlekatan EPEe dan lesi attaching and effacing pada intestinal anak kelinci yang diinfeksi EPEe. Karakter IgY Kering Beku yang dihasilkan menunjukkan kemampuan cross reactivity terhadap EPEe gaJur K 1.3, K 1.5 dan tidak ditemukan didalam serum darah tikus putih setelah hewan coba tersebut diberi IgY secara per oral. Produksi telur anti EPEe memerlukan tambahan biaya sebesar 6,3 sampai 16,7 % dari total biaya produksi telur.

Kata Kunci. Imunoglobulin Y (lgY). enteropathogenic Escherichia coli (EPEC).

(5)

Abstract

RUDI RAWENDRA. Application Prospect

of

Freeze-Dried

Immunoglobulin Y (lgY) as an Anti Enteropathogenic Escherichi!,?oli

(EPEC) Nutraceutical Food. Advisory committee: I WAYAN TEGUH

WIBAWAN, FACHRIYAN HASMI PASARIBU and RAHMAT PAMBUDY Enteropathogenic Escherichia coli (EPEe) is the most . .important pathogen that causes diarrhea on infants less than 2 years old, especially babies under 6

months old in developing countries. Field isolates of EPEe K 1.1 strain after

reidentification is used as a whole killed vaccine that intravenously applieated to ~eek,-old single comb brown legtrom /tIyer. After immunoglobulin Y (I9Y) anti EPEC was founded in serum by agar gel precipnation test (AGPT). eggs were

collected, IgY was separdted from yolk using water dilution method and then freeze dried. Freeze dried IgY was denaturized by pH, pepsin, trypsin and temperature, as well as the undenaturated then were tested its neutralization activity using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Besides aiming to produce freeze dried IgY, this research also studied its in vitro and in vivo effication. The produced freeze dried IgY were able to inhibit EPEe growth on trypticase soy broth media, EPEe adhesion on HEp-2 cell culture as we.!! as EPEC adherence, lesions attaching and effacing on EPEe infected young rabbits intestine. Characteristic founded from freeze dried IgY showed cross reactivity to EPEe K 1.3, K 1.5 strain and were not founded in mouse serum after the experimental animal were given IgY per oral. The production of anti EPEC IgY

required an additional 6.3 to 16.7% cost from the total egg production

cost.

Keywords: Immunoglobulin Y (lgY). enteropathogenic Escherichia coli (EPEC).

(6)

PRAKATA

Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SNT atas segala karunia~Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diseJesaikan. Disartasi ini memuat lima bab

yang menyangkut penelitian tentang produksi, karakterisasi, pengujian in vitro, pengujian in vivo dan analisa tambahan biaya untuk menghasilkan kuning telur

anli enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) maupun imunoglobulin Y (lgY)

Kering Beku anti EPEC. Penelilian yang dilaksanakan sejak bulan April 2003 hingga April 2005 ini mendapal dukungan dana Hibah Pasca tahun 2004.

Terima kasih kepada Dr. drh. I Wayan Teguh Wibawan MS, Prof. Dr. drh Fachriyan Hasml Pasaribu, Dr. Ir. Rahmal Pambudy MS, drh Bambang Ponljo Priosoeryanlo MS. PhD, Dr. drh. Heru Selijanlo, Dr. drh. Kamalluddin Zarkasie, Dr. drh. Relno 0 Soejoedono MS, Dr. dr. Sri Budiarti, drh. Sri Laksmi Damayanti Joesoef PhD, Dr. drh Ita Djuwila M.Ph:l, Dr. Sinis Munandar, Ir. Sapuan Tinggal M.Ed, Dr. Ir. Momon Rusmono MS, Heri Badjuri M.Sc, drh Roesian Isdhianlo, drh lia SRi Halimah MSi, Dr. drh. Sri Eslur.ingsih MS, Prof. Dr. drh. Bibiana Lay M.Sc, Dr. drh. Bambang Purwantara, Prof. Dr. Ir. Rudy Tarumingkeng, drh. Hemomoadl Huminlo MVS, drh. Ekowati Handrayani MS PhD, drh. Dewi Ralih Agungpriyono PhD, Dr. drh. Risa TIuria Tampubolon MS, Dr. Ir. Bambang Kiranadl MS, Prof. Ir Wasmen Manalu MSc PhD, Dr. drh. Marthen B Malole MSc, Prof. Dr. Ir. Zairin MS, drh. Adi Winarto MS PhD, Dr. drh. Setyo Widodo, drh. Widianlo Dwi Suryo M.Sc PhD, drh. Umi Cahyaningsih MS PhD, drh. I Kelut Mudile Adyane MSi, Agus Somantri SPd, Suryono, drh Chandramaya lJamayanti, Yayan Herdiansyah SKH, Binsar Riyadi SKH, Dhodon Ramdhona,

Pipit Surya, Tn Wahono, Indardi, Hellen Fadma dan Oeo Rawendra atas konstribusi pemikiran, fasilitas dan tenaganya selama pelaksanClar. proses

penelitian maupcn penulisan disertasi ini. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Juni 2005

(7)

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan pada 30 Juni 1958 di Satu, sebagai anak kedua dari

enam bersaudara dan ayah loekito Handroyo (aim) dan ibu Suhartati.

Setelah lulus dan Sekolah Pertanian Menegah Atas Negeri Malang pada tahun 1976, penulis melanjutkan pendidikan di Tingkat Persiapan Bersama Institut Pertanian Bogor. Pada tahun 1978 melanjutkan di Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor, lulus sebagai Sarjana Kedokteran Veteriner tahun 1981 dan lulus sebagai Dolder Hewan di tahun 1982. Tahun 1989, melanjutkan program magister pada School of Food Science and Technology, The University of New South Wales, Sydney-Australia dan lulus tahun 1991.

Mulai tahun 2002 melanjutkan program Doktor pada program studi Sains Veteriner di Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.

Sejak tahun 1982 sampai 1985 penulis bekerja sebagai Technical Service PT. Pyridam yang ditempatkan di wilayah Jawa Timur dan Indonesia Bagian Timur. Tahun 1986 sampai sekarang bekerja di Badan Pengembangan Sumber Daya Manusia Pertanian - Departemen Pertanian yang saat ini bertugas sebagai dosen di Sekolah Tinggi Penyuluhan Pertanian Malang.

Penulis menikah dengan drh. Masdiana Chendrakasih Padaga, M.App.Sc, PhD pada tahun 1982 dan dikaruniai seorang putra. Paduan Deoly Ananthur Rawendra dan seorang putri. Reynetha Soliandra Rawendra.

(8)

DAFTAR lSI

DAFTAR TABEL... iii

DAFTAR GAMBAR ... iv DAFTAR LAMPIRAN ... v DAFTAR SINGKATAN... vi PENDAHULUAN .... ,... 1 Latar Belakang... 1 Perumusan Masa/ah ... '... 2 Tujuan Penelitian ... ... ... ... 2 Manfaat Penelitian ... ,... 3 Hipotesa ... 3 TINJAUAN PUSTAKA... 4

Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) ... 4

Patogenesis dan Faktor Virulensi... 5

1. Patogenesis... 5

2. Faktor Virulensi ... ... 6

Gejala Klinis, Patologis dan Diagnostik ... 8

1. Gejala Klinis ... 8 2. Patologis ... 9 3. Diagnosa... 11 Terapi ... 12 Imunoglobulin Y (lgY) ... 12 Produksi IgY ... 13

Struktur dan Stabilitas IgY... 15

Water Soluble Fraction Ig y... 17

Pemanfaatan IgY Sebagai rmunoterapi Peroral EPEe... 18

PRODUKSIIMUNOGLOBULIN Y (lgY) KERING BEKU ANTI ENTROPA THOGENIC Escherichia coli (EPEC) Abstrak ... ... 20

Abstract ... ... ... ... ... 21

Pendahuluan... ... ... ... 22

Bahan dan Metode.. ... ... ... ... 22

Hasil dan Pembahasan ... ... ... 27

Simpulan... .. ... ... 34

Pustaka... ... ... ... ... 35

AKTIVITAS NETRALISASI FRAGMEN DAN EFEK SISTEMIK IMUNOGLOBULIN Y (lgY) KERING BEKU ANTI ENTROPA THOGENIC Escherichia coli (EPEC) Abstrak ... ... ... 38

Abstract ... 39

Pendahuluan... ... ... 40

Bahan dan Metode... ... 42

Hasil dan Pembahasan... 45

Simpulan... .. ... ... ... 50

(9)

EFEKTIVITAS IMUNOGLOBULIN Y (lgY) KERING BEKU ANTI

ENTROPATHOGENIC Escherichia coli (EPEC) DALAM PENGHAMBATAN PERTUMBUHAN DAN ADHESI

Abstrak ... 53

Abs/Tact ... ... 54

Pendahuluan ... '" .... '"... 55

Bahan dan Metode ... '" .. '"... 56

Hasil dan

Pembahasan...

58

Simpulan... ... 64

Pustaka... 64

EFEKTIVITAS PEMBERIAN PERORAL IMUNOGLOBULIN Y (lgY) KERING BEKU ANTI ENTROPA THOGENIC Escherichia coli (EPEC) IN VIVO Abstrak ... 66

Abs/Tact ... ... ... ~ 7

Pendahuluan... 68

Bahan dan Metode... 69

Hasil dar. Pembahasan... 71

Simpulan... ... 76

Pustaka... ... ... 76

TAMBAHAN BIAYA DAN POTENSI NILAI TAMBAH USAHA TELUR BERKASIAT OBAT Abstrak ... ... 79

Abs/Tact ... 80

Pendahuluan... 81

Bahan dan Metode... 82

Hasil dan Pembahasan... 86

Simpulan... ... ... 92

Pustaka... 92

PEMBAHASAN UMUM ... ... 94 SIMPULAN DAN SARAN ... . DAFTAR PUSTAKA ... .

LAMPIRAN ... .

106 107 116

(10)

DAFTAR TABEL

1. Patotipe dan fakter virulens E coli . ... ... ... ... ... 4

2. Pola pe~eka!an E. coli pada sel kultur HE~2 ... 11

3. Perbandingan proses dan produksi IgY terhadap IgG ... 14

4. Perbandingan struktur dan stabilitas IgY terhadap IgG ... 16

5. Penelitian pemanfaatan IgY sebagai Imunisasi pasif peroral... 19

6. Pelaksanaan vaksinasi ... 24

7. Hasil uji biokimiawi isolat Escherichia coli ... 28

8. Awal pembentukan respon imun rute vaksinasi intramuskuler ... 30

9. Konsentrasi protein dan IgY Kering Beku ... 30

10. Respon imun tertinggi n.Jte vaksinasi intramuskuler ... 32

11. Bera! molekul fragmen IgY ... 46

12. ELISA Unit serum darah tikus putih setelah pemberian IgY peroral.. .... 49

13. Rancangan percobaan efektivitas pemberian IgY anti EPEe ... 71

14. Persentase pertambahan berat badan anak kelinci ... 72

15. Rerata produksi telur ayam ... ... ... 88

16. Tambahan biaya produksi telur berkasiat obat ... 89

17. Biaya produksi 1 kglgY Kuning Telur Kering Beku... 90

(11)

DAFTAR GAM BAR

1. Patogenesis EPEC ... ;... 5

2. Sistem sekresi Tipe III dan pemindahan TIR ... 7

3. Perkiraan mekanisme diare akibat infeksi EPEe ... 9

4. Struktur pedestal-like dan intimate binding EPEe ... 10

5. Struktur Ig G, IgY, dan deletion IgY (liFe) ... 15

6. Pola perlekatan isolat pada sel kultur HEp-2 ... 28

7. AGPT serum darah ... 29

8. Aktivitas netralisasi IgY anti EPEe gatur K1.1 ... 31

9. Cross reactivity IgY anti EPEC galur K1.1 ... 34

10. Berat motekul fragmen IgY Kering

Beku...

45

11. Aktivitas netralisasi fragmen IgY Kering Beku ... 47

12. Aktivitas dan kapasitas fagositosis makrofag ... 50

13. Efektivitas penghambatan adhesi berbagai dosis IgY pada Sel HEp-2. 59 14. Sel kultur Hep-2 terinfeksi EPEC ... 59

15. Kurva normal pertumbuhan EPEC pada media TSB ... 60

16. Penghambatan pertumbuhan EPEC di TSB ... 61

17. Penghambatan pertumbuhan EPEC di TSB oleh IgY terdenaturasi ... 63

18. Intestinal normal dan terinfeksi EPEC ... 73

19. Penghambatan periekatan dan lesi AlE EPEe pada permukaan sel epitel anak kelinci .... ... ... 74

20. Lesi attaching and effacing ... 75

21. Pemindahan IgG oleh reseptor FcyRn ... 101

(12)

DAFTAR LAMPIRAN

1. PRODUKSI IMUNOGLOBULIN Y (lgY) KERING BEKU ANTI

ENTROPATHOGENIC Escherichia coli (EPEC) ... 116

2. AKTIVITAS NETRALISASI FRAGMEN DAN EFEK SISTEMIK

IMUNOGLOBULIN Y (lgY) KERING BEKU ANTI ENTROPATHOGENIC

Escherichia coli (EPEC) ... 127

3. EFEKTIVITAS IMUNOGLOBULIN Y (lgY) KERING BEKU ANTI

ENTROPATHOGENIC Escherichia coli (EPEC) DALAM PENGHAMBATAN

PERTUMBUHAN DAN ADHESI... 136 4. EFEKTIVITAS PEMBERIAN PERORAL IMUNOGLOBULIN Y (lgY) KERING

BEKl.I ANTI ENTROPATHOGENIC Escherichia coli (EPEC) IN VIVO ... 141 5. TAMBAHAN BIAYA DAN POTENSI NILAI TAMBAH USAHA TELUR

(13)

AGPT

ASI

Baduta

BFP

BHI

BSA

CFU

DAEC

DMEM

eae

EAEC

EAF

EHEC

EIEC

ELISA

EMB

EPEC

EspA

EspB EspD Esps

ETEC

EU

Flab)" Fab

FAS

Fe FeyRn

FDA

FPLC

GRAS

HAMA

HeLa

HEp-2

IL-8

ITP

LA

LDL

LEE

Lesi AlE

LPS

LT

MALT

MLC

NF-K-B

NMEC

N-WASP

OMP

PCR

PMN

DAFTAR SINGKATAN

Agar gel precipitation test

Air susu ibu Bawah 2 tahun

Bundle forming pi/lus Brain heart infusion Bovine serum albumin Colony fanning unit

Diffusely adherent Escherichia coli Qubellco minimal essential medium Escherichia coli attaching and effacing Enferoaggregative Escherichia coli

EPEe adherence factor

Enterohaemoffhagic E. coH Enteroinvasive E. coli

Enzyme-linked immunosorbent assay

Eosin methylene blue

Enteropathogenic Escherichia coli EPEe secreted protein A

EPEC secreted protein B EPEe secreted protein D EPEe secreted proteins

Enterotoxigenic Escherichia coli

ELISA Unil

Fragman antigen binding sites Fragmen antigen binding site Fluorescent actin staining Fragmen crysfalization

Frogmen crystalization gamma receptors Food Drug Administration

Fast performance liquid chromatography Generally regarded as safe

Human anti-mouse IgG antibodies Human laryngotrachealis

Human epidermoid carcinoma Interleukin-B

1 ,4,5-lnositol TriPhosphat

Localized adherence Low density lipoprotein

Locus of enterocyte effacement

Lesi attaching and effacing Lipopolisakalida

heat-labile toxin

Mucosa-associated lymphoid tissue Myosin light chain

Necrosis factor -1(-8

Neonatal meningitis Escherichia coli Non Wiskoff-Aldrih syndrome

Outer membrane proteins Polimerase chain reaction Polymorphonuclear neutrophil

(14)

Rantai H Rantai L

ROEC-1

Region V

REPEC

RF

SOS-PAGE

slgA

SLT

SPF

-S-S-ST

Tir

TPC

TSB

TTSS

UPEC

WSF

liFe IgY v y Rantai Heavy Ranta; Light

Rabbit diarrheagenic Escherichia cofi-1

Region variable

Rabbit enteropathogenic Escherichia coli Rheumatoid factor

Sodium dodeeyl sulphat<>-poly aerylamide gel electrophoresis Secretory IgA

Shiga-like toxin

Specified pathogen free

Ikatan disulfida

Heat-stable toxin

Translocated intimin receptor Total plate count

Trypticase soy broth

Type three secretion systems Uropathogenic Escherichia coli Water soluble fraction.

Deletion Fc IgY Upsilon