MEmpelajari Aktivitas Protease Bacillus licheniformis Galur Gibson NCTC 10341 Pada Fermentasi Terkontrol Menggunakan Limbah Cair Tahu

MEMPELAJARI AKTlVlTAS PROTEASE

Bacillus l i c h e n i f o r m i s

6ALUR GIBSON NCTC 10341 PADA FERMENTAS1 TEBKONTWOI,

MEMGGUMAKAM LIMBAW CAlR TAHU

LIE WIE SlAN F 24. 1310

1 9 9 2

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN lNSTlTUT PERTANIAN BOGOR

Lie Wie Sian. F24.1310. Mempelajari Aktivitas Protease

Bacillus licheniformis Galur Gibson NCTC 10341 pada

Fermentasi Terkontrol Menggunakan Limbah Cair Tahu. Dibawah bimbingan Dr. Ir. Maggy T. Suhartono dan Dr. Ir. Budiatman

Satiawihardja, MSc.

Dalam percobaan ini dilakukan perbandingan aktivitas

protease Bacillus licheniformis yang ditumbuhkan pada media

limbah cair tahu dengan penambahan glukosa sebagai sumber

karbon dan kasein sebagai sumber nitrogen. Penambahan miner-

al dilakukan untuk melihat pengaruhnya terhadap aktivitas

protease yang dihasilkan. B. lichenifonnis yang digunakan

ditumbuhkan pada suhu 37 OC dalam fermentor Biostat M dengan

pengaturan kondisi fermentasi sebagai berikut : pH 7.0 -

+

0.05, aerasi 0.4 l/menit (setara 0.26 vvm), dan agitasi 400 rpm.

Dari semua percobaan yang dilakukan dapat dilihatbahwa

aktivitas protease mulai ada setelah kultur mulai memasuki

fase stasioner atau

pasta

fase logaritmik, dan meningkat

selama fase stasioner. Dengan membandingkan aktivitas

protease pada media yang ditambah glukosa sebanyak 2 %

dengan media yang ditambah 2% glukosa dan 0.5 % kasein

dapat disimpulkan bahwa protease B. licheniformis disintesis

secara konstitutif, karena penambahan kasein sebagai sub-

strat protease tidak meninykatkan aktivitas enzim protease.

b e r b e d a - b e d a t e r g a n t u n g m e d i a y a n g d i g u n a k a n , y a n g p a l i n g

c e p a t a d a l a h medium LCT

+

2 % g l u k o s a

+

0 . 5 % k a s e i n

+

m i n e r a l ( 3 0 j a m )

,

s e d a n g k a n y a n g l a i n l e b i h d a r i 4 0 jam. A k t i v i t a s

p r o t e a s e t e r t i n g g i d i p e r o l e h d a r i f e r m e n t a s i LCT

+

2 % g l u k o - s a y a i t u 0 . 6 3 0 U / m l d e n g a n w a k t u f e r m e n t a s i 4 8 jam. Plassa

s e l y a n g t e r t i n g g i d i p e r o l e h d a r i f e r m e n t a s e i d e n g a n menggu- n a k a n m e d i a LCT

+

2 % g l u k o s a + 0 . 5 k a s e i n y a i t u 5 . 1 7 g / l .

Penambahan l a r u t a n a l k a l i - a s a m k e d a l a m medium u n t u k m e m p e r t a h a n k a n pH s e l a m a f e r m e n t a s i s a n g a t d i p e n g a r u h i o l e h m e d i a y a n g d i g u n a k a n . A l k a l i l e b i h b a n y a k d i p a k a i b i l a menggunakan s u b s t r a t g l u k o s a d a n asam b i l a menggunakan

MEMPELAJARI AKTIVITAS PROTEASE Bacillus lichcnifol-mis

G A L U R GIBSON NCTC 10341 PADA FERMEN'I'ASI TERI(ONrI'IIOL

MENGGUNAKAN LIMBAH CAIII TAHU

Oleh

LIE WIE SIAN

F24.13 10

SI<RII'SI

Sebagai salah satu syarat untuk mempel-oleli

gelar SARJANA TEICNOLOGI PERTAN IAN

pad;^ Jurusan TEKNO1,OCI PANGAN DAN GIZI

Fakuitas Tek~lologi P e r t ; ~ n i ; ~ ~ ~

Institut Pertaninn Bogor

1092

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

MEMPELAJARI AKTIVITAS PROTEASE B n c i l l ~ ~ r I I ' C I I C I I ~ / ' O I ~ I I Z ~ . S

GALUR GIBSON NCTC 10341 PADA FERMENTASI TERICONTROL

MENGGUNAKAN LIMBAH CAIR TAHU

SICRIPSI

Sehagai salah satu syarat untuk memperoleli

oelar SARJANA TEIOUOLOGI PERTANIAY 3

pada Jurusan TEKNOLOGI PANGAN DAN Ci 121

Institut Pertanian Bogor

Oleh

LIE WIE SIAN

F24.13 I 0

Dilahirkan pada tanggal 7 April 19bS

di Tasikl~ialaya (Jawa Barat)

XATA PENGANTAR

Syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa ata berkat clan perto-

1onganNya sehingga tugas akhir dan penyusunan skripsi ini

dapat diselesaikan.

Skripsi ini disusun berdasarkan hasil penelitian selama

5 bulan di laboratorium Teknologi Mikroba dan Biokimia PAU- IPB, Bogor.

Pada kesempatan ini penulis menyampaikan rasa terimaka-

sih yang tak terhingga kepada:

1. Dr. Ir. Maggy T Suhartono dan Dr. Ir. Budiatman Satiawihardja, MSc. sebagai dosen pei~ibimbing yang

banyak memberikan bimbingan dan perh.~tian selama

penelitian

- 2 . Dr. Ir. Jimmy Hariantono, MSc. sebacjiri dosen

pengu j i

3. Papa, Mama dan adik-adik tercinta

4. Kismawan, Hekleman, Sahat, Nelson dan teman-teman di Asrama Gilang Kencana

.

Penulis menyadaril skripsi ini masih ada kekurangan,

untuk itu kritik dan saran yang membangun akan diterima

dengan tangan terbuka.

Akhir kata semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi

yang memerlukan.

DAFTAR IS1

halaman

KATA PENGANTAR

...

vi

DAFTAR GAMBAR

...

vii

DAFTAR TABEL

...

X DAFTAR LAMPIRAN

. . .

xi

I

.

PENDAHULUAN

...

1

I1

.

TINJAUAN PUSTAKA

...

4

A

.

ENZIM PROTEASE

...

4

B

.

PROTEASE B a c i l l u s

. . .

7

C

.

B a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s

. . .

11

D

.

PROTEASE B

.

l i c c h e n i f o r m i s

. . .

1 2 E

.

SINTESIS PROTEASE B a c i l l u s

. . .

16

F

.

MEDIA FERMENTASI

...

13

G

.

BIOREAKTOR

...

22

111

.

METODE PENELITIAN

...

25

A

.

BAHAN DAN ALAT

...

25

B

.

METODE PENELITIAN

. . .

26

IV

.

HASIL DAN PEMBAHASAN

...

37

A

.

LCT

+

2 % GLUKOSA

...

37

B

.

LCT

+

5 % GLUKOSA

...

41

C

.

LCT

+

0.5 % KASEIN

...

43

.

...

D LCT

+

2 % KASEIN 47 E

.

L C T + 2 % GLUKOSA+ 0.5 %KASEIN

. . .

50

F

.

LCT t 2 % GLUKOSA

+

0.5 % KASEIN

+

MINERAL 52 G

.

FEDBATCH

. . .

54

A

.

K E S I M P U L A N

. . .

5 8

...

B

.

S A R A N 59

D A F T A R P U S T A K A

. . .

6 0

DAFTAR GAMBAR

[image:9.602.93.534.141.640.2]

halaman

Gambar 1.

Gambar 2.

Gambar 3.

Gambar 4.

Gambar 5.

Gambar 6.

Gambar 7

Gambar 8 .

Gambar 9.

Gambar 10.

Skema Penggolongan Enzim Protease

Mikroba

...

8 Deret asam amino Subtilisin Carlsberg

...

dibandingkan denqan Subtilisin BPN 15

Diagram alir proses fermentasi

. . .

29 Diagram alir analisis konsentrasi

protein terlarut metode Bradford

. . .

3 3 Kurva massa sel, konsentrasi glukosa,

konsentrasi protein terlarut, dan akti- vitas protease selama fermentasi pada

. . .

media LCT

+

2 % glukosa 3 9

Kurva konsentrasi oksigen terlarut dan akumulasi penambahan larutan alkali-asam selama fermentasi pada media LCT t

2 % glukosa

. . .

3 9

Kurva massa sel, konsentrasi glukosa, konsentrasi protein terlarut, dan akti- vitas protease selama fermentasi pada

. . .

media LCT

+

5 % glukosa 4 2

Kurva konsentrasi oksigen terlarut dan akumulasi penambahan larutan alkali-asam selama fermentasi pada media LCT +

5 % glukosa

. . .

4 2 Kurva massa &el, konsentrasi glukosa,

konsentrasi protein terlarut, dan akti- vitas protease selama fermentasi pada

...

media LCT

+

0.5 % kasein 44

Kurva konsentrasi oksigen terlarut dan akumulasi penambahan larutan alkali-asam selama fermentasi pada media LCT

+

0.5 % kasein

...

4 4

[image:10.595.81.528.58.712.2]

Gambar 11.

Gambar 12.

Gambar 13.

Gambar 14.

Gambar 15.

Gambar 16.

Gambar 17.

Gambar 18.

Gambar 19.

Gambar 20.

Kurva massa sel, konsentrasi glukosa, konsentrasi protein terlarut, dan akti- vitas protease selama fermentasi pada media LCT

+

2.5 % kasein

. . .

:

Kurva konsentrasi oksigen terlarut dan akumulasi penambahan larutan alkali-asam selama fermentasi pada media LCT i

...

2.5 % kasein

Kurva massa sel, konsentrasi glukosa, konsentrasi protein terlarut, dan akti- vitas protease selama fermentasi pada media LCT

+

2 % ylukosa

+

0.5 % kasein

Kurva konsentrasi oksigen terlarut dan akumulasi penambahan larutan alkali-asam selama fermentasi pada media LCT +

2 % glukosa

+

0.5 % kasein

. . .

Kurva massa sel, konsentrasi glukosa, konsentrasi protein terlarut, dan akti- vitas protease selama fermentasi pada media LCT

+

2% qlukosa

+

0.5 % kasein i.

mineral

. . .

Kurva konsentrasi oksigen terlarut dan akumulasi penambahan larutan alkali-asam selama fermentasi pada media LCT

+

2 %

glukosa

+

0.5 % kasein

+

mineral

. . .

Kurva massa sel, konsentrasi ylukosa, konsentrasi protein terlarut, dan akti- vitas protease selama fermentasi metode fedbatch I

. . .

Kurva konsentrasi oksigen terlarut dan akumulasi pe'nambahan larutan alkali-asam

....

selama fermentasi metoda fedbatch I

Kurva massa sel, konsentrasi glukosa, konsentrasi protein terlarut, dan akti- vitas protease selama fermentasi metode fedbatch I1

...

DAFTAR

TABEL

halaman

Tabel 1

.

Klasifikasi protease mikroba

...

7

Tabel 2

.

Enzim protease yang dihasilkan

oleh Bacillus

...

10 [image:11.602.103.552.83.780.2]

Tabel 3

.

Komposisi media untuk Bacillus

...

penghasil protease 21

. . .

Tabel 4

.

Komposisi limbah cair tahu 22

DAFTAR LAMPIRAN

halaman

Lampiran 1. Gambar f e r m e n t o r BIOSTAT M

. . .

6 2

Lampiran 2 . P e r a k i t a n dan p e n g o p e r a s i a n f e r m e n t o r

BIOSTAT M

...

6 3

Lampiran 3 . _{Kurva s t a n d a r p e n e t a p a n g l u k o s a metode}

. . .

DNS denyan S p e c t r o n i c 2 0 6 4 am pi ran 4 . Kurva s t a n d a r p e n e t a p a n k o n s e n t r a s i

p r o t e i n t e r l a r u t metode B r a d f o r d dengan

...

S p e c t r o n i c 2 0 65

Lampiran 5 . P e r s i a p a n p e r e a k s i u n t u k a n a l i s i s a k t i v i t a s p r o t e a s e metode Bergmeyer

...

I.

PENDANULUAN

Enzim adalah senyawa protein yang dihasilkan oleh sel-

-~

sel hidup untuk mengkatalisis reaksi-reaksi biokimia di

dalam sel hidup. Protease merupakan enzim yang berperan

dalam reaksi yang melibatkan pemecahan protein. Enzim ini

dalam kerjanya membutuhkan air, dan dimasukkan ke dalam

kelas hidrolase.

Sumber-sumber utama enzim protease adalah tumbuhan,

hewan dan mikroba. Enzim yang dihasilkan oleh mikroba

mempunyai kelebihan dibandingkan dengan yang lainnya, yaitu

dapat diproduksi dalam jumlah besar, produkstivitasnya mudah

ditingkatkan, mutunya lebih seragam dan harganya murah.

Meskipun telah lama dikenal, pemanfaatan enzim skala indus-

tri baru dimulai tahun 1960-an. Aplikasi protease dari

mikroba meliputi industri pangan dan non panyan. Pemanfaat-

an protease pada industri non pangan yaitu di industri kulit

dan detergen, sedangkan pada industri pangan digunakan di

industri bir, roti, kue,,keju, daging dan pembuatan protein

hidrolisat.

Adanya perkembangan teknologi yang pesat terutama dalam

bidang bioteknologi menjadikan mikroba sebagi salah satu

penghasil enzim yang potensial, sebab enzim dari mikroba

dapat- diproduksi secara masal dan dapat dioptimalkan dengan

penyeleksian galur murni, pengaturan kondisi fermentasi, clan

untuk hidup dan berkembang biak di dalam media yang disusun

dari limbah pertanianf bahan baku yang relatif murah.

Dalam melaksanakan fermentasi secara industri skala

besar, terutama untuk memproduksi produk-produk fementasi

yang membutuhkan tingkat sterilitas yang tinggi, kontaminasi

merupakan masalah yang utama. Dengan digunakannya fermen-

tor, masalah kontaminasi ini dapat diatasi, sekaligus dapat

dilakukan pengontrolan terhadap parameter-parameter ling-

kungan fisik dan kimia selama fementasi berlangsung. Fer-

mentor merupakan bejana fermentasi aseptik dengan semua

kelengkapan serta sistem penggunaannya dirancang sedemikian

rupa sehingga kondisi aseptik dapat dipertahankan selama

fermentasi berlangsung.

Mikroorganisme tumbuh dalam suatu spektrum fisik dan

kimiawi yang sangat luas. Pertumbuhan dan kegiatan-kegiatan

fisiologis lainnya merupakan suatu respon mikroorganisme

terhadap lingkungan fisik dan kimianya. Xinetika fermentasi

menggambarkan pertumbuhan dan pembentukan produk oleh mi-

kroorganise sebagai respon terhadap lingkungannya, bukan

hanya pertumbuhan sel a ~ t i f tetapi juga keyiatan-kegiatan

sel istirahat dan sel mati. Studi kinetika fermentasi dapat

memberikan beberapa informasi penting antara lain waktu yang

tepat untuk pemungutan hasil dan apakah fementasi berlang-

sung secara tidak normal, yang merupakan petunjuk adanya

Tujuan penelitian ini adalh untuk mempelajari aktivitas

protease selama pertumbuhan pada media limbah cair tahu yang

ditambah dengan glukosa dan atau kasein serta garam-garam

11. TINJAUAN PUSTAKA

A . ENZIM PROTEASE

- .

Enzim adalah protein yang disintesis oleh sel

hidup untuk mengkatalisis reaksi-reaksi yang sangat

spesif ik, dengan demikian maka enzim berperan mengat.ur

fungsi biologis mahluk hidup melalui proses metabolisme.

Pada umumnya enzim mempunyai beberapa karakteristik

sebagai berikut: enzim mempunyai spesifitas yang tinggi,

enzim bekerja lebih cepat dibandingkan katalisator

lainnya, tetapi enzim mudah dihambat oleh kondisi-

kondisi fisik seperti tekanan, konsentrasi larutan, pH

dan suhu yang ekstrim. Enzim berperan terutama di dalam

sel hidup, tetapi enzim ekstraseluler disekresikan

keluar dengan tujuan menyederhanakan nutrisi-nutrisi di

luar sel supaya dapat diserap ke dalam sel (Boing,

1982).

Enzim protease merupakan enzim yang mengkatalisis

pemecahan protein. ,Protease termasuk k e dalam kelas

hidrolase karena dalam menghidrolisis substrat membutuh-

kan molekul air. Seringkali protease dibedalcan daiam

dua golongan yakni proteinase dan peptidase. Proteinase

mengkatalisis hidrolisis molekul protein menjadi frag-

men-fragmen besar, sedangkan peptidase mengkatalisis

fragmen polipeptida menjadi asam amino (Frazier dan

dikeluarkan oleh mikroba pada media fermentasi selama

masa pertumbuhan sedangkan peptidase hanya disintesis

bila sel mengalami autolisis (Casida, 1968).

1. Protease dari Mikroba

Protease dan enzim lain yang dihasilkan oleh

mikroba memiliki beberapa keunggulan dibandingkan

sumber lainnya. Keunggulan itu antara lain dapat

diproduksi dalam jumlah besar, produktivitasnya

mudah dikingkatkan (Standbury dan Whitaker, 1984)

,

mutunya lebih seragam dan harganya lebih murah

(Yamamoto, 1975).

Langkah awal dalam memproduksi enzim dari

mikroorganisme adalah seleksi mikroorganisme yang

akan digunakan sebagai penghasil enzim yang diingin-

kan, baik mutu maupun kwalitasnya. Menurut Neubeck

(1970), yang dikutip oleh Schwimmer (1981), terdapat

syarat umum yang dapat diterapkan dalam pemilihan

galur mikroba yaitu :

1. mikroba tersebut mudah tumbuh

2. tidak terdapat faktor yang tidak diinginkan dalam mikroba tersebut seperti patogenesis

3. enzim yang dikehendaki terdapat dalam jumlah jauh lebih banyak dibandingkan produk lainnya

4 . mikroba tersebut stabil (tidak mudah mutasi!

5. enzim mudah dipisahkan dari massa sel mikroba Protease dihasilkan oleh berbagai jenis mikroba

mulai dari bakteri, kapang dan khamir. Berbagai

macam bakteri seperti Bacillus, Pseudomonas, Clos-

-

tridiun~

,

Proteus, Seratia, jenis kapang Aspergilus,

Penicillium dan Mucor merupakan penghasil protease

yang cukup potensial (Casida, 1968).

2. Klasifikasi dan Sifat

Protease mikroba dapat dikelompokan berdasarkan

beberapa cara. Cara pengelompokan yang paling

sederhana adalah berdasarkan pH optimum mikroba

penghasilnya. Dengan cara ini protease dapat di

kelompokkan menjadi tiga golongan yakni protease

netral, alkali dan asam. Protease mikroba dapat

dibagi menjadi empat kelompok berdasarkan mekanisme

kerja, yaitu (1) protease serin, (2) protease metal, (3) protease thiol, (4) protease asam. Dengan sedikit kekecualian, protease Bacillus kebanyakan

terdiri dari enzim serin atau metal (Priest, 1977).

Klasifikasi yang lebih terinci diberikan oleh Ward

(1983) seperti yang tercantum dalam Tabel 1. Nama enzim dan nomor EC ditulis sesuai dengan rekomendasi dari Komisi Penamaan dan Penggolongan Enzim Interna-

Tabel 1. Klasifikasi protease mikroba

(Subgrup 3.14-peptida hidrolase ) *

Nomor EC Nama yang direkomendasikan

a-Aminopeptidase hidrolase

Dipeptida hidrolase

Dipeptidil dipeptida hidrolase

Karboksipeptidase serin

Karboksipeptidase metal

Protease serin

Protease thiol

Proteinase karboksil (asam)

Proteinase logam

Protease yang belum diketahui

mekanisme katalitiknya

*

_{Ward, 1983}

Penggolongan* enzim tersebut dapat dilihat lebih

jelas pada skema 6i Gambar 1.

B. ENZIM PROTEASE Bacillus

Pada dekade ini penggunaan enzim semakin pesat dan

enzim mikrobial makin nyata berperan dalam berbagai

bidang seperti medis, industri bir, roti dan lain-lain.

[image:19.595.127.542.51.624.2]

karboksipetidase

-4

serin

karboksipeptidase

peptidase karboksipeptidase

loyam, aminopeptidase

rpr~tease mirip tripsin

C

proteinase alkali

- proteinase serin

proteinase mik- sobakter a-litik

Lproteinase staf i- lokokal

klostripain

I

proteinase thiol

I

proteinase strep

tokokal

-proteinase m i r i p

pepsin proteinase asam

proteinase mirip renin

r

proteinase netral proteinase alkali proteinase logam

proteinase mikso- bakter I

[image:20.595.55.541.72.580.2]

proteinase mikso- 'bakter 11

Gambar 1. Penggolongan protease yang dihasilkan oleh mikroba (Ward, 1983)

an ini, dibuktikan dengan distribusi makalah yang diba-

wakan pada Simposium Internasional Fermentasi ke V tahun

Industrial Interest" tak kurang dari 10 berkenaan dengan

enzim yang berasal dari Bacillus. Ada beberapa

.

alasan *

mengapa peranan bakteri ini agak dominan dalam bidang

ini. Pertama mereka terdiri dari grup yang bersifat

kemoorganotropik yang mudah dipelihara dan dikembangbi-

akkan dan mempunyai karakter yang beraneka ragam yaitu

psikrofilik

,

mesofilik thermofilik disamping itu alkal-

ofilik, neutrofilik, dan asidofilik (Priest,1977).

Enzim ekstraseluler atau eksoenzim adalah enzim yang

terpisah sama sekall dari sel dan terdapat secara bebas

dalam medium sekelilingnya. Meskipun demikian pembagian

antara enzim ini dengan enzim dinding sel atau enzim .

terikat-membran seringkali sukar. Enzim dapat terikat

dengan membran pada sel muda dan terlepas sebagai ekso-

enzim pada s a a t kultur memasuki fase stasioner atau

terlarut oleh perlakuan ringan misalnya pencucian sel

dengan air atau larutan garam (Priest, 1977).

Banyak jenis eksoenzim yang disintesis oleh basili

Dari Tabel 2 dapat difihat jenis protease ekstraseluler

yang dihasilkan oleh bakteri Bacillus.

Periplasma pada bakteri gram negatif dikenal sebagai

ruang yang mengandung enzim, ruang ini terletak antara

membran sitoplasma di bagian dalam dan membran sel di

bagian luar. Tidak adanya membran luar pada bakteri

gram positif menyebabkan tidak adanya lokasi yang dapat

Tabel 2. Enzim protease yang dihasilkan oleh

Bacillus (Priest, 1977)

Enzim Protease Spesies Keterangan

Alkalofilik Bacillus spp Enzim serin dari alkalo-

alkalofilik filik yang optimum pada

pH tinggi

Amilopeptidase B. licheniformis B. subtilis

Esterase B. subtilis Enzim serin dengan akti-

vitas esterolitik kuat dan proteolitik lemah

Halof ilik Bacillus sp Diproduksi optimal pada

medium yang mengandung NaCl 1M

Metal

Serin

B. amyloliaquefaciens Enzim yang membutuhkan Ca

B. megaterium untuk stabilitas dan Z n

B . polymyxa untuk aktivitasnya,

B. subtilis pH optimum pada pH netral

8. subtilis var atau dekat netrdl

amylosacchariticus

B. thermoprote?liticus B

.

thuringiensis

B . amyloliquefaciens Subtilisin;

B. lichenifor~nis pH optimum alkali,

B . pumilus residu serin pada atau

a . subtilis dekat sisi aktif B. subtilis var

sac~hariticus

Serin metal B. likheniformis Enzim hibrid dengan

B. pumilus karakteristik gabungan

antara protease metal dan serin.

dari Bacillus sering digambarkan sebagai enzim 'peri-

plasmik', yang menunjukkan cara yany sama dengan prose-

[image:22.595.79.537.33.723.2]

gram negatif. Lokasi yang pasti dari enzim ini sebagai

enzim ekstraseluler sejati tetap tidak jelas, tetapi

enzim tersebut mungkin mempunyai semacam periplasma yang

dilepaskan pada saat pembentukan protoplasma (Priest,

1977).

C. Bacillus licheniformis

Bacillus licheniformis termasuk dalam divisi Proto-

phyta, kelas Schizomycetes, ordo Eubacteriales, famili

Bacillaceae dan genus Bacillus (Clifton, 1958). B.

licheniformis dikenal sebagai spesies dari spektrum B.

subtilis. Yang termasuk dalam spektrum ini adalah B.

subtilis, B. licheniformis dan B. pumilus. Terjadinya

pengelompokan ini adalah karena ketiga spesies ini mem-

punyai bentuk morfologis yang mirip dan beberapa sifat

fisiologis yang juga mirip (Gordon, 1972).

Bakteri dari genus Bacillus adalah bakteri yang

bersifat aerobik atau anaerobik fakultatif, berbentuk

batang dan mempunyai endospora refraktil. Dibandingkan

dengan sel vegetatifnya, endospora lebih tahan terhadap

panas, keadaan kering, desinfektan dan bahan destruktif

lainnya, dan mungkin tetap hidup selama beberapa abad.

B. licheniformis merupakan bakteri gram positif, berben-

tuk batang dengan panjang antara 1.5 urn sampai 3 um dan

lebar antara 0 . 6 um sampai 0.8 um. Spora dari bakteri

sentral atau parasentral dari sel penghasil spora. B.

licheniformis bersifat motil dan memberikan hasil

positif pada uji katalase dan uji Voyeus-Proskauer.

Bakteri ini masih dapat tumbuh pada suhu 50 OC serta

dalam larutan NaCl 7%. Sifat lain dari bakteri ini adalah dapat menyebabkan dekomposisi kasein, dapat

menggunakan asam sitrat dan propionat, dapat mereduksi

NO3 menjadi NO2 dan menghidrolisi pati. B. lichenifor-

mis tumbuh pada suhu maksimum 50-55OC dan suhu minimum

15 OC (Gordon, 1972). B licheniforl~lis menghasilkan

beberapa enzim ekstraseluler yaitu a-amilase, amino

peptidase, protease metal, protease serin, protease

serin-metal, penicilinase (B-laktamase), Endo-N-asetil

glukoaminidase, dan lipase (Priest 1977), selain itu

juga menghasilkan antibiotik bacitracin (Hanlon dkk,

1983).

D

.

Protease B

.

licheniformis

B. licheniformis, merupakan spesies bakteri yang

mampu menghasilkan enzim protease dalam jumlah tinggi.

Jenis enzim protease yang dihasilkan oleh bakteri ini

adalah enzim ekstraseluler yang tergolong protease serin

alkali karena mempunyai residu serin pada sisi aktifnya

Enzim ini bekerja sebagai endopeptida dan dihambat kuat

oleh senyawa diisopropil fluorofosfat (DFP) karena

serin pada sisi aktif (Aunstrup, 1978).

Protease serin mempunyai berat molekul dengan

kisaran 25.000-30.000 dan dicirikan dengan adanya residu

serin pada sisi aktif. Akibatnya enzim ini dihambat

oleh diisopropil-fluorofosfat tapi tidak membutuhkan ion

metal, tahan terhadap EDTA (Ethylenediamine tetraacetic

acid). Adanya ion ~'+a dapat menstabilkan enzim ini

pada suhu tinggi. Protease serin dapat dibagi menjadi

dua grup berdasarkan sifatnya. Pertama grup A yang

dihasilkan oleh B. licheniformis (Subtilisin Carlsberg)

dan B. puinilus dan grup B protease serin yang disebut

Subtilisin Novo (Subtilisin BPN) dari B. stearothermo-

phillus dan B. amyloliquefaciens (Priest, 1977).

Enzim protease yang dihasilkan oleh B. lichenifor-

mis dikenal dengan nama Subtilisin Carlsberg, yang mana

enzim ini diisolasi pertama kali oleh Guntelberg Lang

dan Ottensen pada tahun 1952 dan mereka hanya melihat

satu komponen enzim. Hall dan kawan-kawan pada tahun

1966 berhasil memisahkan enzim protease yang dihasilkan

oleh bakteri ini m&njadi dua komponen enzim, sebuah

proteinase dan satu lagi peptidase. Selanjutnya pada

tahun 1972, Zuidweg memisahkannya menjadi tiga komponen

enzim dengan menggunakan elektroforesis dan menyimpulkan

bahwa ketiganya terbentuk bukan karena autodijes. B.

licheniformis memproduksi dua komponen proteinase utama

s i menjadi isoenzim melalui otodijes. Komponen utama

diidentifikasi sebagai Subtilisin Carlberg. Dalam

klasifikasi berdasarkan Komisi Penamaan dan Penygolongan

Enzim Internasional, Subtilisin mempunyai namor EC.

3.4.21.14 (ward, 1983).

Enzim Subtilisin Carlsberg mempunyai rantai peptida

tunggal dengan 274 residu asam amino tetapi tidak terda-

pat residu sestein maupun ikatan disulfida; berdiameter

4.2 nm, mengandung Ser 221, His 64, dan Asp 32 pada sisi

aktif, berat molekul 27.277 dan titik isoelektriknya

pada pH 9.4. Enzim ini dihambat aktivitasnya oleh

senyawa yang dapat bereaksi dengan serin seperti Dii-

soprfil fluorofosfat (DFP) dan Fenil meti1 sulfonil

fluorida (PMSF). Seperti protease serin .lainnya, kalsium

tidak diperlukan dan tidak inaktif oleh pengkelat

(EDTA). Subtilisin mempunyai spesifitas yang luas,

menghidrolisa hampir semua ikatan peptidan dan beberapa

ikatan ester, terutama yang mengandung residu asam amino

aromatik, beberapa frigliserida juga dihidrolisis,

misalnya tripropionat,dan tributirat. Subtilisin Carls-

berg mempunyai p H optimum untuk aktivitasnya antara 8.0

sampai 9.0, stabil pada selang pH luas dan dapat diinak- tifkan dengan cepat pada pH di bawah 5.0 dan diatas 11.0 (Ward. 1983). Agen oksidasi seperti hipoklorida dan

hidrogen perooksida cepat merusak enzim, tetapi hidrogen

perklorat, tidak membahayakan aktifitas enzim (Aunstrup,

1 9 7 9 ) . Gambar 2 menunjukkan deret asam amino dari

Subtilisin Carlsberg dibandingkan Substilisin BPN.

. r , ,

~arlsberg-

.

mr It, he uu ALP 1.1 Val ctn At, I n *

L,,

AU

B ~ N

4 W I ~ A I ~ C ~ n . s t r ~ V ~ I ~ P r ~ l ~ ~ ~ ~ h ' V ~ I ~ S ~ ~ G m ~ l L A ~ v A b H l ~ S C n C l ~ C h . S ~ r ~ A ~ n . V I l ~ L t l ~ V ~ I ~ A U u V I l ~ [image:27.599.126.548.187.724.2]

n a 10

Gambar 2 . Perbandingan deret asam amino Subtilisin

E. SINTESIS PROTEASE Bacillus

1: S i n t e s i s P r o t e a s e

S i n t e s i s enzim e k s t r a s e l u l e r dalam jumlah t e r b a n y a k t e r j a d i pada s a a t s e b e l u m s p o r u l a s i y a k n i

pada a k h i r f a s e e k s p o n e n s i a l d a n awal f a s e s t a s i o - n e r . Pada g e n u s B a c i l l u s s i n t e s i s p r o t e a s e n e t r a l akan mencapai a k t i v i t a s maksimum sebelum pembentukan

s e l mencapai b a t a s maksimum, Dalam h a 1 p r o t e a s e a l k a l i , s i n t e s i s n y a t e r t i n q q i d i c a p a i s e s u d a h f a s e

pertumbuhan s t a s i o n e r . Namun d e m i k i a n , k i n e t i k a i n i

d a p a t b e r u b a h dengan adanya pengaruh-penqaruh kompo- nen-komponen s u b s t r a t (Keay d k k , 1 9 7 2 yany d i k u t i p

o l e h Meyrath dan Volvasek, 1 9 7 5 ) .

Hubungan a n t a r a b i o s i n t e s i s dan a k t i v i t a s

p r o t e a s e d a n p r o s e s s p o r u l a s i pada s p e s i e s Bacillus

masih belum d a p a t d i t e n t u k a n s e c a r a p a s t i . Berda-

s a r k a n d a t a g e n e t i k dan f i s i o l o g i S c h a e f f e r (19G9) menyimpulkan bahwa a k t i v i t a s p r o t e a s e e k s t r a s e l u l e r t i d a k e s e n s i a l daiam s p o r u l a s i , d a n menduga a d a s a t u

a t a u l e b i h p r o t e a s e i n t r a s e l u l e r yang b e r p e r a n dalam p e r p u t a r a n p r o t e i n ( p r o t e i n t u r n o v e r ) . B i a r p u n

demikian Mandelstam dari W a i t e s (1968) menyatakan bahwa e k s o p r o t e a s e bertanggung jawab t e r h a d a p p e r p u - t a r a n p r o t e i n i n t r a s e l u l e r ; t e t a p i keduanya t i d a k

Meskipun aktivitas protease ekstraseluler tidak

mempunyai fungsi nyata dalam sporulasi, molekul

enzim mungkin mempunyai hubungan dengan enzim in-

traseluler. Protease intraseluler dibutuhkan untuk

(1) melepaskan enzim tertentu untuk pengaturan metabolisme sel, (2) menyediakan monomer yang dapat dioksidasi pada sel yang aktif, (3) menyediakan monomer untuk sintesis protein atau (4) merusak inhibitor sporulasi. Hubungan mutlak secara lang-

sung antara protease intraseluler dengan ekstrase-

luler tidak ada meskipun korelasi antara keduanya

mungkin ada (Schaeffer, 1969)

.

Studi sintesis protease pada pertumbuhan kultur

dalam batch menyatakan bahwa hubungan antara kece-

patan sintesis yang maksimal pada permulaan spo-

rulasi. Lebih jauh lagi, analisis mutan

spa-

(mutan

yang tidak menghasilkan spora) mengungkapkan bahwa

strain ini tidak memproduksi protease elcstraseluler

dan kembalinya k<mampuan untuk berspora diikuti

dengan kemampuan untuk memsintesis protease

(Schaeffer, 1967 di dalam Priest, 1977). Semua

-mutan yang diisolasi memperlihatkan perubahan

aktivitas protease juga perubahan karakteristik

sporulasi. Kebanyakan dari contoh ini mungkin

akibat mutasi pleiotropik, tetapi meskipun demikian

mempunyai fungsi dalam proses sporulasi.

2. Produksi Protease

Dalam produksi protease dan enzim lain pada

umumnya ada dua aspek yang harus diperhatikan yakni

isolasi galur dan mutasi serta kontrol selama

produksi. Isolasi galur bertujuan untuk ineng-

hasilkan enzim dalam jumlah dan aktivitas yang

tinggi (Ward., 1983). Faktor-faktor yang perlu

dikontrol untuk mengoptimalkan produksi meliputi

suhu, pH, kondisi aerasi (transfer , 0 2 ) , komposisi

medium (surfaktan dan unsur kelumit), laju

pertumbuhan mikroba, induksi, represi umpan balik,

serta represi katabolik (Demain (1973) yang dikutip

oleh Schwimmer, 1981).

Untuk mendapatkan galur yang dapat memproduksi

protease dalam jumlah tinggi dilakukan prosedur yang

umuni diteraplcan pada enzim lain. Peiiiantauan aktivi-

tas protease dilbkukan dengan cara melihat luas

/

daerah difusi enzim pada media agar, yang umumnya

terlihat berupa daerah bening di sekeliling koloni,

akan tetapi pendekatan ini tak selamnya memberikan

hasil yang memuaskan untuk seleksi mikroba penghasil

protease. Smith menemukan bahwa pada kultur B.

licheniformis yang menghidrolisis kasein dalam

silkan protease dalam jumlah besar dengan menggunakan

kultur terendam (Ward, 1983).

F. MEDIA FERMENTASI

Pemilihan media fermentasi merupakan faktor

yang sangat penting dalam produksi enzim dari mikro-

ba, disamping faktor kondisi fermentasi, spesies

mikroba yang digunakan dan metoda pemurnian enzim

yang dihasilkan. Terdapat dua bentuk fermentasi

yang dapat dilakukan yaitu fermentasi terendam dan

fermentasi permukaan.' Pada media cair kedua metoda

fermentasi tersebut dapat diterapkan. Teknik kultur

terendam lebih menguntungkan karena tidak mudah

terkontaminasi dan waktu fermentasinya lebih singkat

(Aunstrup, 1979).

Menurut Blevin dan Davis (1979), keuntungan

penggunaan media cair dibandingkan dengan media

padat adalah antara lain komposisi dan komponen

media dapat dia,tur dengan mudah, dapat memberikan

kondisi optimum bagi pertumbuhan, penggunaan sub-

strat efesien, aerasi dapat disesuaikan, laju per-

tumbuhan mikroba dapat diukur dan resiko kontaminasi

kecil, sedangkan kekurangannya adalah dapat terben-

tuk buih, membutuhkan tingkat sterilitas yang ting-

gi, konsentrasi produk yang relatif rendah dan

Persyaratan media fermentasi dalam industri

enzim adalah tersedia sepanjang tahun, mudah dida-

[image:32.599.131.545.73.683.2]

pat, harganya murah dan efesien pengyunaannya.

Tabel 3 memperlihatkan komponen yang dapat digunakan

untuk menghasilkan enzim protease dari Bacillus.

Tabel 3. Komposisi media untuk Bacillus _penghasil

protease

Komposisi kultur terendam (gram / liter)

1. Hidrolisat pati 50; tepung kacang kedelai 20; kasein 20; Na2HP04 3,3.

2. Hidrolisat pati 150; protein kedelai 3.65; laktosa 4.3; tepung biji kapas 30; khamir 7.2; KH2P04 4.3; MgS04.2H20 1.25; loyam kelumit

3. Ampas gandum 100; tepung kacang kedelai 30; pH diatur dengan Na2C03

Limbah cair tahu

Limbah cair tahu dapat digunakan sebagai media

fermentasi karQna masih mengandung nutrisi yang

dapat digunakan untuk pertumbuhan mikroba. Prinsip

pembuatan tahu adalah menggumpalkan protein dari

susu kedelai hasil ekstraksi kedelai yang telah

dihancurkan dan ditambah air. Fraksi dari susu

kedelai yang tidak menggumpal disebut "whey" atau

limbah cair tahu. Komposisi whey berbeda-beda

kalsium sulfat) dan efesiensi ekstraksi. Komposisi

[image:33.599.138.537.113.430.2]

ini dapat dilihat pada tabel 4.

Tabel 4. Komposisi kimia limbah cair tahu

Penggumpal Komponen

casoqa CaS04 As. asetat

- -

Air ( % )

-

99.007 -

Pati

( % I

-

0.010 -

Glukosa ( % ) 0.009 - 0.037

Total N ( % ) 0.043 0.157 0.023

Abu ( % ) - 0.209 -

ca ( ppm) 34.030 24.37 2.940

CU (

P P ~ )

0.178 - 0.107

Na (PPm) 0.591 - 0.537

M9 (PPm)

-

2.961 -

Fe (

P P ~ )

-

0. .143 -

aKuswardani (1985) b~ochani (1986)

Dari hasil penelitian Nurdin (1988) diteniukan

bahwa aktivitas protease yang dihasilkan oleh Bacil-

lus licheniformis. pada media limbah cair tahu lebih tinggi dibandingkan dengan aktivitas protease pada

media sinteik yang direkomendasikan oleh Hanlon dkk

(1982) dan Hadiutomo (1987). Penelitian ini juga

menemukan bahwa penambahan glukosa dan molases

menurunkan aktivitas protease sedanykan ampas tapio-

ka meningkatkan. Semua fermentasi diatas dilakukan

D. BIOREAKTOR

Bioreaktor adalah sistem tertutup untuk reaksi

biologis darri suatu proses bioteknologi. Bioreaktor

memberikan lingkungan yang terkontrol bagi optimasi

pertumbuhan organisme dan aktivitas metabolisme. Bio-

reaktor ini hendaknya mencegah kontaminasi produksi

dari lingkungan k e kultur sambil mencegah pelepasan

kultur k e lingkungan. Selain itu, bioreaktor tersebut

sebaiknya memiliki instrumen untuk pemeriksaan agar

terjadi pengawasan proses yang optimum. Jenis parameter

dan peralatan yang digunakan dalam operasi suatu bio-

reaktor dapat dilihat pada Tabel 5 (Smith, 1 9 9 0 ) .

Tujuan utama dalam merancang bioreaktor adalah untuk

menekan biaya produksi, namun usaha pengembangan selan-

jutnya diutamakan pada peningkatan kecepatan pen~bentu-

kan dan kualitas produk (Smith, 1 9 9 0 ) .

Ada tiga jenis utama pengoperasian bioreaktor yang

digunakan dalam proses bioteknologi dengan dua biokata-

lis. Bioreaktor dapat' dioperasikan dengan basis diskon-

tinyu, semi kontinyu (fed bacth) atau kontinyu. Reaksi

dapat terjadi dalam kultur statis atau yang diaduk,

dengan atau tanpa oksigen. Katalis biologis dapat

digunakan dalam bentuk bebas atau terikat pada suatu

permukaan zat pendukung atau merupakan sel yang sedang

Tabel 5. Jenis instrumen yang kini digunakan pada bioreaktor.

Parameter yang Peralatan yang digunakan

diukur* Tekanan Isi fermentor Volume Berat PH IZecepatan pengadukan

Laju aliran udara

Produksi karbon

Konsumsi oksigen

Oksigen terlarut

Suhu

Sensor pengukur tekanan udara atau pengukur tegangan

Sel pengukur perbedaan tekanan di atas dan di bawah

Sel pengukur beban fermentor

Elektroda gelas dan standar

Techometer

Flow meter, piringan berlubang

Penganalisis sinar merah

Penganalisis Zirkonia

Polarografi dengan elektroda oksigen

Termometer, termometer tahan an, termistor, kapiler

*sumber dari Smith, 1990

Optimasi suatu pdoses bioreaktor melibatkan minimi-

sasi penggunaan bahan baku, energi, serta maksimasi

kemurnian dan kualitas produk. Optimasi proses dapat

dicapai dengan memanipulasi parameter fisik dan kimia

yang berhubungan dengan proses (Smith, 1990).

Pengembangan proses proses mikrobial umumnya

[image:35.595.125.530.66.708.2]

rium, merupakan tahap studi a.wal; 2) skala pilot plant,

dimana kondisi operasi optimal mulai diterapkan; dan 3)

skala industri dimana proses prosesnya dilaksanakan

dengan memperhitungkan ekonomi industri fermentasi

111. BAHAN DAN

METODE

A. BAHAN DAN ALAT

1. Bahan

Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah

kultur murni Bacillus licheniformis galur Gibson

NCTC 10341 yang diperoleh dari Balai Penelitian

Veteriner Bogor, beberapa media serta bahan kimia.

Media yang dipakai adalah Nutrien Broth (Difco),

Nutrien Agar (Difco), kasein ; dan untuk media

fermentasi adalah limbah cair tahu yang diperoleh

dari pabrik tahu di Cibanteng (menggunakan

penggumpal CaS04), glukosa ( merk dagang Glukolin

dengan komposisi 98 % glukosa monohidrat) dan kasein teknis, antifoam silikon, KH2P04, MgS04, CaClZ,

FeSO, dan (NH4)2S04; untuk analisa adalah NaOH, HC1,

asam borat, boraks, kasein, kalsium klorida,

tirosin, Bovin

,

Serum Albumin (BSA), asam

trikloroasetat, gatrium karbonat, pereaksi fenol

(Folin Ciocalteau), Natrium klorida, Commasive

Brilliant Blue, etanol 9 5 % , asam fosfat 8 5 2 , asam

3,5-dinitrosalisilat, Na-K tartarat, fenol, Natrium

metabisulfit, glukosa standar (untuk analisa

2. Alat

Alat-alat yang digunakan adalah Fermentor

Biostat M beserta rekordernya, alat-alat gelas, sen-

trifuse SED 30, inkubator bergoyang Grant SS40-A2,

Spektrofotometer Spektronik 20, stirrer magnetik,

Heidolph MR 2000, vortex Genie-2, mikropipet Socorex

1 dan 5 ml, inkubator Lab-line 3550-1, oven WTB B

115, timbangan Mettler PJ 300, timbangan Libror AEL- 200, kulkas, otoklaf dan penangas air Thermolift.

B. METODE PENELITIAN

1. Persiapan Kultur

a. kultur stok

Untuk pembuatan kultur inokulum, kultur

bentuk ampul harus disegarkan dulu, Persiapan

kultur stok dilakukan dengan cara memecah ampul

kultur, tambahkan sedikit air steril ke dalam

ampul, lalu dikocok dan diinokulasikan ke dalam

!

NB steril, diinkubasi selama sehari. Bakteri

dari NB ini ditumbuhkan di media NA miring,

kemudian diinkubasi selama dua hari pada suhu

37Oc dan disimpan sebagai kultur stok. Kultur

stok disimpan pada 'suhu ~ O C dan disegarkan

kembali setiap 2 minggu. ~ a r i kultur stok ini

dalam persiapan kultur ini dilakukan secara

aseptik.

b. kultur inokulum

Bakteri dari kultur stok diinokulasikan k e

dalam 100 ml limbah tahu steril pH 7, diinkubasi pada 37Oc selama 24 jam dalam inkubator bergo-

yang. Kultur inokulum siap dipakai.

. -

2. Fermentasi

Bacillus licheniformis ditumbuhkan pada suhu

37 OC dalam fermentor Biostat M, dengan pengaturan

sebagai berikut pH 7.0, aerasi 0.4 l/menit, agitasi 400 rpm. Media yang digunakan untuk mempelajari

aktivitas protease adalah limbah cair tahu yang

ditambah dengan 2% glukosa, 5% glukosa, 0.5 % ka-

sein, 2.5 % kasein

,

2 % glukosa

+

0.5 % kasein, 2% glukosa

+

0.5 % kasein

+.

mineral (dalam g/l :

MgS04.7H20 0.4, KH2P04 1, CaC12.H20 0.5, (NH4)2S04 5). Sedangkan untuk! fermentasi fed batch menggunakan

media awal LCT ditambah 1 % glukosa

+

0.5 % kasein, dan media fed LCT

+

2 % glukosa

+

0.5 % kasein. Volume media yang digunakan adalah 1.5 liter untuk

sistem batch dan 1 liter untuk sistem feed batch

ditambah 0.5 1 untuk medium feed. Kecepatan

Media limbah cair tahu yang diperoleh dari

pabrik tahu disaring dengan kapas. Erlenmeyer yang

berisi glukosa dan atau kasein diisi dengan limbah

cair tahu yang sudah disaring sebanyak 1.5 1.

Larutan tersebut diatur pH-nya dengan menambahkan

NaOH 1.0 M. Setelah glukosa dan kasein larut erlen-

-

meyer disumbat dan disterilisasi bersama bejana

fermentor selama 15 menit pada 121 OC.

Sebelum dipakai dalam fermentasi pH meter dan

p02 meter dikalibrasi dulu. Media steril yang sudah

didinginkan, dimasukkan k e dalam bejana fermentor

secara aseptik. Kemudian dilakukan pengaturan suhu,

pH dan diaerasi sampai jenuh. Setelah pembacaan

stabil, inokulum sebanyak 100 ml dimasukkan secara aseptik dan rekorder dinyalakan. Skema pengopera-

sian fermentor dapat dilihat pada gambar 3 sedangkan prosedur perakitan dan pengoperasian yang lebih

Media LCT

+

glukosa

+

kasein

+

mineral

4

disterilkan

bejana fermentor

I

-

disterilkan

I

I

didinginkan

I

I

didinginkan

I

\

/

masukkan medium

I

secara aseptik

1

I

I

atur kontrol pH 7.0

1

I

suhu 37 O C

I

1

diaerasi sampai jenuh

\

inokulum inoulasi secara

/

1

fermentasi

1

ambil sampel

I

analisis aktivitas protease

% g.iukosa

% protein

[image:41.599.110.522.64.728.2]

I

massa sel

3. pengambilan dan persiapan sampel

Sekitar dua puluh ml sampel diambil dari

bejana fermentor secara aseptik melalui saluran

khusus pengambilan sampel. Sampel dimasukkan k e

dalam dua tabunq sentrifuse masing-masing se-

banyak 10 ml. Pemisahan supernata dan biomassa

dilakukan dengan sentrifuse selama 1 0 menit

dengan kecepatan 3500 rpm. Biomassa hasil

sentrifuse digunakan untuk penetapan massa sel

dengan metoda oven; supernatan digunakan untuk

analisa kadar giukosa, kadar protein dan aktivi-

tas proteolitik. Bila tidak seyera dianalisa

sampel disimpan di freezer denyan temperatur

-20 Oc.

4. Metoda Analisis

a. penetapan massa sel

Sampel hLsil fermentasi sebanyak 1 0 ml

dimasukkan k e dalam tabung sentrifuse yang

sudah diketahui beratnya; disentrifuse

selama 10 menit dengan kecepatan 3500.

Supernatan dikumpulkan untuk analisa yang

lain. Endapan hasil sentrifuse dicuci

0.85%) kemudian diaduk dengan vorteks dan

disentrifuse lagi. Setelah larutan pencuci

dibuang, tabung berserta sel dikeringkan

dalam oven pada suhu 105 OC selama 12 jam,

didinginkan dan ditimbang.

b. Penetapan kadar glukosa

Glukosa ditetapkan dengan menggunakan

metoda kolorimetri D N S (Asam dinitro-salisi-

lat) (Miller, 1959). Metoda ltolorimetri

berdasarkan pada pembentukan komponen warna

merah, sebagai akibat reduksi asam 3,5-

dinitrosalisilat menjadai asam 3-amino-5-

nitrosalisilat dan oksidasi gugus aldehid

dari gula pereduksi menjadi grup karboksil.

Warna merah yang dihasilkan dapat bervariasi

tergantung jenis gula yang terdekomposisi

dalam larutan alkali (Miller, 1959).

Sampel dilarutkan sehingga mengandung

0.2-1.0 g/l glukosa. Dalam tabung bertutup,

i

sampel .&ebanyak 1.0 ml ditambahkan 3 ml pereaksi D N S , kemudian dididihkan selama 15

menit. Setelah dingin, larutan diukur den-

sitas optiknya pada panajng gelombang 640 nm dan konsentrasi dihitung dari kurva standar

Pereaksi DNS menganduny ( 9 ) : asam

3,5-dinitrosalisilat 10, fen01 2 , sodium

sulfit 0.5, Na-K tartarat 200, dan Natrium

hidroksida 10.

penetapan protein terlarut

Protein terlarut ditetapkan dengan

metoda Bredford (Bredford, 1976). Perhbuatan

larutan Bradford adalah sebagai berikut 100

mg Commasive Brilliant Blue, ditambah 100 ml

etanol 95 %, 50 ml asam fosfat 85 % kemudian

Supernatan hasil protein baku (BSA)

sentrifuse diencerkan

10-100 kali

(konsentrasi 0.01-0.1 mg/ml)

ditambahkan 5 ml pereaksi Bradford

J

1

divorteks dan didiamkan

I

]

10 menit pada suhu kamar

1

I

diukur absorbansinya pada panjany

\

gelombang 595

nrn

dan protein

I

[image:45.602.75.527.92.701.2]

I

dihitung dari kurva baku (BSA)

Gambar 4. Skema analisis konsentrasi protein terlarut metode Bradford (Bradford, 1976 di dalam

d. penetapan aktivitas proteolitik

Aktivitas protease supernatan ditetap-

kan berdasarkan metode Bergmeyer.

Prinsip penetapan aktivitas adalah

sebagai berikut

Kasein

---

> peptida

+

asam amino

p r o t e a s e

Laju pembentukan peptida dan asam amino

dari reaksi di atas dapat dijadikan tolak

ukur aktivitas katalitik dari enzim pro-

tease. Asam amino yang telah terbentuk

harus diisolasi dan dipisahkan dari substrat

yang tersisa. Cara yang umum dilakukan

adalah dengan menambahkan asam trikloroase-

tat (TCA) atau asam perklorat. Asam amino

yang telah diisolasi dapat lanysung diukur

absorbansinya pada 280 atau diwarnai terle- bih dulu dpngan pereaksi Folin Ciocalteau

agar dapar dilakukan pembacaan pada daerah

sinar tampak.

Prinsip di atas dapat diaplikasikan

pada hampir semua jenis protease. Kondisi

optimal untuk protease tertentu dapat dilak-

ukan dengan mengatur kondisi fisik dan kimia

~.

dilakukan antara lain : penyaturan pH dan

suhu selama analisis, penanibahan CaC12,

pereaksi -SH atau senyawa lain yang dapat

meningkatkan aktivitas enzim yang dianali-

sis. Metode ini terutama ditujukan untuk

Subtilisin y a n g banyak dihasilkan oleh

Bacillus sp.

Setiap sampel yang akan dihitung unit

aktivitasnya akan memiliki nilai absorbansi

bagi sampel dan standar. Unit aktivitas

tiap sampel dapat dihitung berdasarkan rumus

di bawah ini.

U = A s p X P X l -

Ast T

dimana :

U = Unit aktivitas /ml

= nilai absorbansi sampel :st = nilai absorbansi standar

= faktor pengenceran sampel T = waktu inkubasi (menit)

Berdasarkan perjanjian internasional

dan untuk kepentingan ilmiah aktivitas

dinyatakan dalam Internasional Unit. Satu

IU protease menyatakan jum1,ah enzim yang

dapat menghasilkan satu mikromol produk

Tabel 4. Pengukuran aktivitas protease (Berymeyer, 1976)

blanko standar sampel . (ml) (ml) (ml)

Buffer borat 1.00 1.00 1.00 pH 8.0, 0.05M

Substrat kasein 1.00 1.00 1.00 (20 mg/ml, pH 8)

Enzim dalam CaC12

-

( 2

mM)

Tirosin standar

-

0.20 -

( 5mM)

Akuades 0.20 -

-

Inkubasi pada suhu 37 OC selama 10 menit tepat

TCA (0.1M) 2.00 2.00 2.00

CaC12 (0.2 mM) - - 0.20

Enzim dalam CaC12 0.20 0.20

-

Inkunasi pada suhu 37 OC selama 10 menit sentrifuse 1 0 menit pada 3500 rpm

Pereaksi Folin 1.00 1.00 1.00

IV. NASIL DAN PEMBAI-IASAN

Dalam percobaan ini dilakukan perbandingan aktivitas

protease Bacillus licheniformis yang ditumbuhkan pada media

limbah cair tahu dengan penambahan komponen variabel glukosa

sebagai sumber karbon dan kasein sebagai nitrogen, serta

mineral (MgS04, KH2P04, CaC12, (NH4) 2S04) untuk melihat

pengaruhnya terhadap aktivitas protease yang dihasilkan oleh

B. licheniformis yang ditumbuhkan pada suhu 37 OC dalam

fermentor Biostat M dengan pengaturan kondisi fermentasi

sebagai berikut : pii 7.0 -

+

0.05, aerasi 0.4 l/menit (setara

0.26 vvm), dan agitasi 400 rpm. Medium yang digunakan

adalah sebanyak 1.5 1 untuk sistem batch dan 1 1 untuk

sistem fed batch, ditambah 0.5 1 untuk medium fed. Untuk

pengaturan pH digunakan larutan NaOH 1 M dan HC1 1 M; se- dangkan untuk menghilangkan buih digunakan silikon dioksida.

Pembahasan hasil penelitian diuraikan berurutan berdasarkan

eksperimen dengan media fermentasi yang berbeda.

A. LCT

+

2% GLUKOSA

Percobaan ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh

glultosa sebagai sumber karbon terhadap aktivitas pro-

tease yang dihasilkan. Hasil percobaan menunjukkan

bahwa Bacllus licheniformis yang ditumbuhkan pada media

limbah cair tahu yang ditambah glukosa sebanyak 2 %

setelah kurva pertumbuhan bakteri mulai memasuki fase

stasioner (Gambar 5). Aktivitas tertinggi yang dicapai adalah 0.630 U/ml pada umur kultur 4 8 jam. Massa sel

yang dihasilkan adalah 3.44 g/l.Dari Gambar 5 dapat

dilihat glukosa dikonsumsi dengan cepat pada fase loga-

ritmik

.

Pertumbuhan awal bakteri pada medium ini hampir

tidak mengalami fase adaptasi. Hal ini terjadi karena

kondisi medium yang cukup sesuai untuk pertumbuhan sel.

Hanlon (1981) mengemukakan bahwa B. licheniforn~is yang

ditumbuhkan pada media glukosa mempunyai waktu penggan-

daan yang paling singkat yaitu 1.00 jam dibandingkan

dengan gliserol, asam piruvat, asam sitrat, dan asam

laktat yang masing-masing berturut-turut adalah 1.13,

2.00, 3.16, dan 3.95 jam. Dari Gambar 6 dapat dilihat

bahwa pada waktu pertumbuhan logaritmik sampai memasuki

fase stasioner sampai jam ke-27 konsumsi oksigen juga

sangat tinggi, sehingga oksigen yany terlarut menjadi

sangat rendah. Setelah itu konsentrasi O 2 mulai mening-

kat lagi. Dari kedua gambar di atas dapat dilihat

hubungan antara kurva pertumbuhan, konsumsi glukosa,

konsentrasi protein terlarut, aktivitas protease, oksi-

gen terlarut dan kebutuhan larutan alkali-asam untuk

mempertahankan p H mendium tetap 7.

Pada fase logaritmik, uhtuk mempertahankan pH tetap

0 _{10 20 30 40 60} 60 ₇₀

lam -.- _{masea sel}

[image:51.602.96.533.44.696.2]

4- k protein ierlerut

Gambar 5 . Kurva m a s s a s e l , k o n s e n t r a s i g l u k o s a , k o n s e n t r a - s i p r o t e i n t e r l a r u t , d a n a k t i v i t a s p r o t e a s e s e l a m a f e r m e n t a s i p a d a media LCT i 2 % y l u k o s a

% okalgen rnl 1

M

60

60

a

40

a

I

30

-

1

a

20 a

a

rn

.

10

0

0 10 20 30 40 6 0 _{60 70}

jam

-

% okalgen terlarut + alkall-aaarn

karhon melepaskan banyak asam/ ion H+ k e dalam medium,

asam ini dapat juga merupakan produk metabolisme sel

selama pertumbuhan. Pada fase pertumbuhan lambat alkali

tidak ditambahkan, baru setelah memasuki fase stasioner

terjadi penambahan asam pada medium. Penambahan alkali

dan asam k e dalam medium sangat erat hubunyannya dengan

metabolisme yang terjadi dalam sel dan senyawa-senyawa

yang dilepaskan oleh sel. Dari grafik peniompaan alkali

asam dapat dilihat kecenderungan perubahan pH medium

bila pH tidak dikontrol. Bila pada awal fermentasi ini

alkali tidak ditambahkan akan tejadi penurunan pH,

pertumbuhan sel akan lambat kemudian segera memasuki

fase stasioner. Pada fase perturnbuhan loyaritmik,

glukosa dimetabolimne dengan cepat dan sel melepaskan

produk metabolik yang dapat berupa asam k e medium; pada

rase pertumbuhan lambat kebutuhan larutan pengatur

sedikit; setelah kultur memasuki fase stasioner terjadi

keseimbangan antara sel-sel hidup denyan sel-yang mati,

meskipun pertumbuhan terhenti, metabolisme dan akumulasi

produk masih terjadi di dalam sel atau di dalam cairan. Massa sel tetap konstan pads fase stasioner, tetapi

jumlah sel hidup cenderung menurun. Pada saat ketahanan

hidup menurun lisis sel mungkin terjadi dan massa sel

akan menurun. Lisis sel akan menyebabkan terjadinya

suatu medium yang kompleks dari produk-produk hasil

B. LCT

+

5% GLUKOSA

Pada fermentasi LCT dengan penambahan glukosa yany

lebih tinggi, pengaruh glukosa terlihat jelas, aktititas

protease rendah sekali selama fermentasi berlangsung.

-.

Aktivitas protease mulai ada setelah jam k e 26, ter-

tinggi pada saat umur kultur 69 jam sebesar 0.059 U/ml,

nilai ini sepersebelas kali lebih kecil dibandingkan

dengan medium yang menggunakan 2 % g l h o s a . Bernlohr (1971) menemukan bahwa meningkatnya konsentrasi glukosa

dapat mengningkatkan efek represi katabolik terhadap

sintesis protease. Dengan menggunakan konsentrasi

glukosa yang tinggi sedangkan kadar protein dalam media

hanya berasal dari limbah cair tahu, komposisi antara C

dan N tidak seimbang sehingga massa sel ynng d i h a s i l k ; ~ ~ .

kecil (kurang dari 1 g/ml). Glukosa yany tersisa sete-

lah fermentasi berlangsung.60 jam masih tetap tinggi

yaitu 1.67 % . Karena massa sel yang dihasilkan sedilcit

maka konsentrasi oksigen yang menurun dengan cepat pada

awal fermentasi meningkat lagi setelah jam k e 9. Per-

tumbuhan bakteri mulb;: memasuki stasioner setelah jam k e

18.

Dari Gambar 8 terlihat bahwa kebutuhan alkali pada

3 jam awal fermentasi rendah, ini menunjukkan penggunaan glukosa yang lambat dan adaptasi yang lama dibandingkan

0 10 20 30 40 60 60 70 80 ₉₀

[image:54.599.95.539.68.671.2]

jam

Gambar 7. Kurva massa sel, konsentrasi glukosa, konsentra- si protein terlarut, dan aktivitas protease selama fermentasi pada media LCT

+

5 % glukosa

% oksigen rnl 1

M

,~ ...

.. .. . , .. ,

0 10 20 _{30 40} 50 ₆₀ 70 80 ₉₀

jam

-- % okeigen terlarut + alkall-aeam

i n h i b i s i o l e h s u b s r a t m u l a i t e r j a d i d i a t a s k o n s e n t r a s i

5 0 g / l , j a r a n g t e r j a d i i n h i b i s i - b a r u d i m u l a i s e t e l a h m e l e w a t i 1 0 0 g / m l . Dengan m e n i n g k a t n y a k o n s e n t r a s i

s u b s t r a t t e r l a r u t d a p a t m e n i n g k a t k a n t e k a n a n o s m o s i s l a r u t a n s e h i n g g a menyebabkan d e h i d r a s i p a r s i a l s e l d a n

menurunkan k e c e p a t a n p e r t u m b u h a n s e l .

C . LCT

+

0 . 5 % K A S E I N

P e r c o b a a n penambahan k a s e i n s e b a g l s u b s t r a t e n z i m p r o t e a s e b e r t u j u a n u n t u k m e l i h a t a p a k a n e n z i m t e r s e b u t d i s e n t e s i s s e c a r a k o n s t i t u t i f a t a u i n d u k t i f . Penambahan

k a s e i n p a d a media LCT t i d a k menunjukkan p e n i n g k a t a n

a k t i v i t a s p r o t e a s e y a n g b e r a r t i . Massa s e l y a n g d i h a -

s i l k a n j u g a s e d i k i t ( 0 . 8 2 g / m l )

.

A k t i v i t a s p r o t e a s e

m u l a i a d a s e t e l a h 3 3 jam d a n h a n y a s e d i l c i t m e n i n g g k a t s a m p a i 0.01G U / m l p a d a s a a t k u l t u r b e r u m u r 5 1 jam (Gambar 9 ) . K a s e i n merupakan m o l e k u l p o l i m e r a s a m a m i n o

y a n g b e r u k u r a n b e s a r . P r o t e i n i n i t i d a k d a p a t s e y e r a b e r p e n e t r a s i m e l a l u i , d i n d i n g membran s e l b a k t e r i .

B a k t e r i h a r u s mengelua'rkan e n z i m p r o t e a s e e k s t r a s e l u l e r u n t u k d a p a t m e n d e g r a d a s i p r o t e i n i n i m e n j a d i monomer-

monomer y a n g d a p a t masuk k e d a l a m s e l . K a r e n a p a d a a w a l f e r m e n t a s i b e l u m d i h a s i l k a n e n z i m p r o t e a s e ( e n z i m p r o -

t e a s e y a n g a d a h a n y a b e r a s a l d a r i k u l t u r i n o k u l u n i ) maka

0 10 20 _{30 40} 60 ₆₀ 70

jam

.

--

_{ma868 e e l + a k l l v l l a ~ ~ protease}

J- X prolein Ierlarut + % giuiioaa

[image:56.602.59.524.59.715.2]

-

Gambar 9. Kurva massa sel, konsentrasi glukosa, konsentra- si protein terlarut, dan aktivitas protease selama fermentasi pada media LCT

+

0.5 % kasein

mi 1 M % okslgen

60

...

- 40

a

I

20 k

a

I

0

-

I

a

-20 a

a

m

-40

I t I I I I

I

_-60

0 10 20 30 40 5 0 _{60 70}

jam

-

% okslgen terlarut + alkall-aaarn

dengan massa sel tertinggi hanya 0.82 g/l.

Pada Gambar 10 terlihat bahwa konsumsi oksigen pada fase adaptasi rendah sekali sehingga oksigen yang terla-

rut dalam medium tetap jenuh. Penurunan konsentrasi

terjadi mulai jam ke-9 sampai jam ke-18, tapi konsentra-

s i masih tetap tinggi yaitu 22 % . Hal ini menunjukkan

konsumsi oksigen yang rendah karena massa sel yang

dihasilkan sedikit. Pada fermentasi ini, larutan penga-

tur pH yang pertama kali digunakan adal HC1 (sampai jam

ke-G) setelah itu baru NaOH sampai jam Ice-18, kemudian

HCL lagi. Pola penggunaan larutan pengatur ini berbeda

dengan fermentasi LCT yang ditambah glukosa, yang mana

larutan yang digunakan perfama kali adalah NaOH. Hal

ini disebabkan karena pada fermentasi dengan menggunakan

kasein, bakteri terpaksa hanya menggunakan kasein seba-

gai sumber karbon (sumber karbon dari limbah cair tahu

dapat diabaikan (0.02% berasal dari pati dan glukosa

pada tabel 4). Peningkatan konsentrasi ion OH- yang dapat menyebabkan peningkatan pH ini disebabkan oleh

terjadinya degradasi!protein.oleh protease yang dapat

menghasilkan asam amino. Asam amino hasil hidrolisis

digunakan oleh bakteri sebagai sumber karbon. Proses

ini melibatkan pembebasan amonia yang dikenal dengan

deaminasi. Menurut Cooney (1980) proses deaminasi dapat

berlangsung dalam beberapa cara tergantung pada enzim

deaminasi reduksi yang menghasilkan asam lemak jenuhdan

amonia

,

dan dikatalisis oleh dehidrogenase dengan

hidrogen sebagai donor hidrogen. Reaksi yang berlangsung

adalah sebagai berikut

R - CH2 - CH - COOH + 2 H+

---

> R - CH2 - CH2 - COOH + NH3 I

NH2

b. deaminasi desaturasi yang menghasilkan asam lemak

tak jenuh.

R - CH2

-

CH - COOH ---> R - CH = CH

-

COOH + NH3

I

NH2

Menurut Priest (1977) produk hasil hidrolisis enzim ekstraselular mungkin merepresi sintesis enzim dengan

cara yang sama dengan represi sintesis enzim endoselular

oleh produk akhir. Produksi enzim ekstraselular yang

diatur dengan cara ini direpresi secara kuat oleh

adanya asam amino atau peptida di lingkungannya. Pada

beberapa Bacillus asam amino tersendiri tidak merepresi

pada tingkat yang sama dibandingkan dengan yang diaki-

.

batkan oleh beberapa;asam amino sekaligus. Bacillus

amyloliquefaciens pada fase akhir eksponensial menerus-

kan sintesis protease apabila suspensi medium mengandung

konsentrasi kasein hidrolisat yang rendah (0.25 mg/ml),

tetapi represi secara kuat terjadi bila konsentrasi

makin tinggi (0.5 mg/ml). Dari 16 asam amino yang diuji, prolin, isoleusin, glutamat dan aspartat mengha-

D . LCT

+

2.5 % KASEIN

. . -

Pola pertumbuhan pada media LCT dengan penambahan

kasein yang lebih banyak (2.5 % ) berbeda dibandingkan

dengan media sebelumnya (LCT

+

glukosa atau LCT

+

0.5 %

kasein). Pada medium ini fase adaptasi berlangsung lama

seperti yang terjadi pada medium LCT

+

0.5 % kasein.

FaSe pertumbuhan logaritmik berlangsung lambat karena

terbatasnya nutrien mikro yang dapat diserap oleh sel.

Kasein dalam medium harus dihidrolisis dulu oleh pro-

tease menjadi asam amino dan polipepticla sebelum diguna-

kan sel sebagai sumber karbon dan sumber nitrogen. Asam

amino dipakai sebagi sumber karbon karena tidak ada

sumber karbon lain selain yang berasal dari limbah cair

tahu. Fase peralihan antara fase layaritmik ke t a s e

stasioner, atau yang disebut juga fase pertumbuhan

lambat berlanqsunq lama. Perubahan fase pertumbuhan

lamabat k e fase stasioner tidak telihat jelas karena

kurvanya landai (Gambar 11). Massa sel tertinggi tinggi yang dihasilkan oleh m{dium ini adalh 5.04 g/l, dicapai

setelah umur kultur 6 8 _{jam. Aktivitas protease mening-}

kat setelah umur kultur 40 jam dan meningkat terus

sampai 0.173 U/ml. Nilai ini sepuluh kali lipat lebih

besar dibandingkan aktivitas pada media LCT

+

0.5 %

kasein, tapi tidak lebih besar dari media yang mengguna-

Gambar 11. Iturva massa sel, konsentrasi glukosa,. konsentra- si protein terlarut, dan aktivitas protease selama fermentasi pada media LCT

+

2.5 % kasein

% okslgen m l 1 M

.

4 0

20

0

a

I

-20 k

a

-40 1

I

-60

-

a

-80

;

-

100 rn

-

120

- 140

0 10 20 30 40 60 80 70

jam

-

% okslgen terlarut 4- alkall-asarn [image:60.599.114.476.68.342.2] [image:60.599.62.521.196.666.2]

protease yang dihasilkan maka dapat disimpulakan bahwa

enzim protease ekstraseluler B. licheniformis adalah

enzim konstitutif. Menurut (Priest, 1977) sintesis

enzim ekstraseluler pada genus Bacillus munqkin bersifat

indusibel, konstitutif sebagian dan konstitutif. Enzim

yanq termasuk indusibel pada genus ini ada dua yaitu

levasukrase dan penicilinase.

Dari Gambar 12 dapat dilihat bahwa konsumsi oksigen

selama fermentasi kasein cukup tinggi sehingqa konsen-

trasi oksigen terlarut dipertahankan 0% sampai jam ke-

6 0 . Konsumsi oksigen ini disebabkan karena massa sei

yang banya dan fase pertumbuhan lambat yang lama.

Menurut Wang etal. (1979) kecepatan absorbsi volumetrik

oksiqen berkaitan erat denqan kecepatan tumbuh, konsen-

trasi sel dan jugan konsentrasi produk ( bila produk

metabolisme teroksidasi). Kurva kebutuhan alkali-asam

alkali menunjukkan perbedaan yang n