Ekstraksi dan Pemurnian Protease dari Bacilus pumillus (Y1)

(1)

EKSTRAKSI

DAN

PEMURNIAN

PROTEASE

DARI

Bacillus pumiiius

(Y1)

1 9 9 4

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR

(2)

Julius. F 27. 0959. Ekstraksi dan Pemurnian Protease Dari Bacillus

pumillus (Y1). Di bawah bimbingan D r . Ir. Maggy T. Suhartono dan

I r . Sutrisno Koswara.

RINGKASAN

Bacillus adalah bakteri yang sangat potensial u n t u k dijadi kan

sumber enzim protease. Bacillus yang digunakan dalam penelitian i n i

adalah j e n i s B. pumillus (Y1) y a n g diisolasi d a r i limbah c a i r t a h u

( L i kumahwa, 1993). Sedangkan penelitian ini bertujuan u n t u k mela-

k u k a n e k s t r a k s i dan p e m u r n i a n enzim protease d a r i B.

purnillus (Y1 ) dengan menggunakan berbagai kolom kromatografi [DEAE ( d i e t i l a m i n o e t i l ) Sephadex A-50 dan Amberlitel u n t u k mendapatkan

enzim protease yang relatif murni.

Dalam penelitian ini dilakukan fermentasi bakteri untuk mengha-

s i l k a n enzim protease dalam limbah cair tahu dengan penambahan 2%

skim, lalu d i i k u t i ekstraksi enzim dengan garam ammonium sulfat 55%

( w / v ) , besi (111) klorida, aluminium (111) k l o r i d a dan aseton dan

d i l a r u t k a n kembali dalam b u f f e r sodium sitrat, sodium ditionat dan

f o s f a t 0.01 M pH 8.0, kemudian d i d i a l i s i s dalam k a n t u n g selofan.

Dialisat lalu di kromatografi dalam resin penukar anion (Amberlite I R A

400 dan DEAE Sephadex A

-

50) dan penukar kation (Amberlite DP-1).

Fraksi-fraksi yang diperoleh, dipekatkan dengan pengeringan beku

dan selanjutnya dielektroforesis dalam gel SDS-poliakrilamid.

Dari hasil ekstraksi dengan berbagai macam garam pengendap

(3)

setelah dilarutkan kembaii hasil l a r u t a n enzim yang mempunyai a k t i f i -

t a s t i n g g i dihasilkan pada pengendapan oleh besi (111) k l o r i d a yang

kernudian d i l a r u t k a n dalam b u f f e r s i t r a t y a i t u sebesar 1.482 IU/ml,

a k t i f i t a s spesifiknya 67.364 IU/mg dan konsentrasi proteinnya 0.022

rng/ml dan d i i k u t i dengan ammonium s u l f a t (0.348 IU/ml; 0.742 IU/mg;

0.742 mg/ml). Sedangkan u n t u k pengendapan dengan peiarut organik

(aseton t e k n i s ) , a k t i f i t a s t e r t i n g g i d i d a p a t k a n pada p e r b a n d i n g a n

aseton dengan ekstrak kasar enzim sebesar 1 : 3 yaitu 2.406 IU/ml

dengan konsentrasi protein 2.367 mg/mi. Namun karena pertimbangan

keamanan pangan oleh logam b e r a t (Fe) yang c u k u p riskan dan dilihat

d a r i segi ekonomis, maka l a r u t a n enzim yang berasal dari pengenda-

p a n dengan ammonium s u l f a t l a h (0.393 I U / m l ) yang d i p a k a i u n t u k

tahap pemurnian selanjutnya.

Dari hasil penelitian pemurnian protease dari Bacillus pumillus

( Y l ) , setelah pernisahan dengan Amberlite I R A 400 d i d a p a t k a n d u a

kelompok gabungan f r a k s i - f r a k s i dengan a k t i f i t a s protease c u k u p

t i n g g i y a i t u A ( f r a k s i nomor 2

-

5 ) dan B ( f r a k s i nomor 11

-

18)

dengan a k t i f i t a s masing-masing 0.186 IU/ml dan 0.159 IU/ml s e r t a

aktifitas spesifiknya 0.451 IU/mg dan 0.846 IU/mg. Konsentrasi pro-

t e i n u n t u k A dan B b e r t u r u t - t u r u t adalah 0.412 mg/ml dan 0.188

rng/ml. Pada pemisahan dengan Amberlite DP-1 hanya didapat satu

kelompok f r a k s i dengan a k t i f i t a s t e r t i n g g i yaitu C (fraksi nomor 2

-

6

dengan a k t i f i t a s protease 0.194, a k t i f i t a s spesifik 0.357 IU/mg, konsen-

t r a s i protein 0.442 mg/ml). Sedangkan untuk DEAE Sephadex A

-

50 didapatkan dua kelompok gabungan f r a k s i - f r a k s i yaitu E (nomor 6 -

(4)

0.131 IU/ml; 0.985 IU/mg; 0.133 rng/ml.

Untuk kelipatan pemurnian, niiai terbesar didapat pada pemur-

n i a n dengan r e s i n D E A E Sephadex A - 50 (sebesar 2.5

-

4.3 k a l i )

kernudian Arnberiite penukar anion (IRA 400) (sebesar 2

-

3.6 kali) dan

Arnberlite penukar kation (DP-1) (1.9 kali).

Dari perhitungan hasil elektroforesis, u n t u k f r a k s i A didapat-

kan perkiraan berat rnolekul enzim adalah 19550.34 Dalton; f r a k s i 6

didapat dua pita dengan perkiraan berat rnolekul enzimnya 25202.17

Dalton dan 19550.34 Dalton. Untuk fraksi C tidak dapat ditentukan

berat rnolekul aproksimatnya karena p i t a yang dihasilkan dari elektro-

foresis tidak cukup jelas terlihat. Sedangkan u n t u k f r a k s i E dan G

didapat dua pita dengan berat moiekul dugaannya 22197.10 Dalton dan

(5)

I N S T I T U T PERTANIAN BOGOR

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN PROTEASE

DARI Bacillus purnillus (Y1 )

SKRIPSI

sebagai salah s a t u s y a r a t u n t u k mernperoleh g e l a r

SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN

p a d a J u r u s a n T e k n o l o g i Pangan d a n Gizi

F a k u l t a s T e k n o l o g i P e r t a n i a n

Institut P e r t a n i a n Bogor

Oleh

J U L I U S

F 27. 0959

1994

JURUSAN TEKNOLOGI PANGAN DAN GIZI

(6)

I N S T I T U T PERTANIAN BOGOR

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

DARI Bacillus pumillus (Y1 )

SKRIPSI

sebagai salah satu s y a r a t u n t u k memperoleh gelar

F a k u l t a s Teknologi P e r t a n i a n Institut P e r t a n i a n Bogor

Oleh

J U L I U S

F 27. 0959

Disetujui,

Bogor, September 1994

.

-?/,p-.-r

i

A/'.&

Dr. Ir. M&y T. S u h a r t o n o

(7)

KATA PENGANTAR

P u j i s y u k u r kepada T u h a n Yang Maha Kasih, karena b e r k a t

karunia-Nyalah p e n u l i s d a p a t rnenyelesaikan penulisan s k r i p s i i n i

dengan baik dan tepat pada waktunya.

Dengan tersusunnya laporan ini, rnaka penulis hendak rnengha-

t u r k a n terirna kasih kepada :

1. I b u Dr. Ir. Maggy Thenawijaya Suhartono, selaku dosen

pernbirnbing I dan Bapak Ir. Sutrisno Koswara selaku

dosen pernbirnbing 11, yang telah rnernberi kan bantuan dan

pengarahan selarna berlangsungn ya penelitian dan proses

penyusunan skripsi, s e r t a atas kesediaannya rnenjadi dosen

p e n g u j i I dan 11.

2. Bapak Ir. Feri K. yang telah bersedia untuk menjadi dosen penguji I11 pada u j i a n skripsi.

3. Yang kukasihi di Jakarta, Ibu, Ayah, Saudara-saudaraku

dan Rok kida yang telah rnernberi kan kasi h sayang, dorongan,

sernangat dan bantuan baik rnoril dan rnateriil.

4. Sernua ternan-ternan se-lab dan para laboran (Pak Putu "you're t h e most", Junaidi, Marcella, Mardi, Agus, Lili, Ricki,

Kang Yaya, I b u Eni, I b u Ika, Pak Angga, Pak Ujang dan

lain-lain) yang telah rnernberi kan banyak bantuan dan suasana

k e r j a yang rnenyenangkan.

5. Sernua ternan-ternanku di Bogor, Narto Sunarno, Evi Wirat-

(8)

8 _I

N., Suciono, Durrnan, Herijanto dan lain-lain yang telah

memberi kan a r t i sebuah persahabatan.

6. Semua pihak yang t u r u t pula rnernbantu penulis daiarn rnenye- iesai kan penyusunan laporan ini.

Penulis menyadari bahwa dalam pelaksanaan rnaupun daiarn

penyusunan s k r i p s i i n i masih jauh dari sernpurna dan tidak lepas dari

kesalahan, sehingga k r i t i k dan saran u n t u k kesempurnaan iaporan ini

sangat diharapkan. Akhirnya, semoga tuiisan ini dapat rnemberi kan

manfaat bagi yang rnembutuhkannya.

(9)

DAFTAR I S 1

KATA PENGANTAR

. . .

i

DAFTAR I S 1

. . .

iii

DAFTAR GAMBAR

. . .

v i DAFTAR T A B E L

. . .

v i i DAFTAR L A M P I R A N

. . .

v i i i

. . .

I

.

PENDAHULUAN 1 A

.

LATAR BELAKANG

. . .

1

B

.

TUJUAN

. . .

3

I 1

.

T I N J A U A N PUSTAKA

. . .

4

A

.

PROTEASE MIKROBA

. . .

4

. . .

B

.

PROTEASE

Baci77us pumi77us

6

C

.

E K S T R A K S I DAN PEMURNIAN

. . .

7

D

.

ELEKTROFORESIS

. . .

1 5 I11

.

METODA P E N E L I T I A N

. . .

1 8 A

.

BAHAN DAN A L A T

. . .

18

1

.

BAHAN

. . .

1 8 2

.

A L A T

. . .

1 8 8

.

. . .

1 9 1

.

PRODUKSI E N Z I M

. . .

1 9

.

. . .

a P r o d u k s i I n o k u l u m 1 9 b

.

P r o d u k s i E n z i r n

. . .

1 9 2

.

PEMURNIAN E N Z I M

. . .

2 0 a

.

P e n g e n d a p a n d e n g a n b e r b a g a i p e r e a k s i

. .

21

.

. . .

(10)

c . K r o m a t o g r a f i

. . .

P e r s i a p a n k o l o m DEAE Seahadex A-50

. .

P e r s i a p a n k o l o m A m b e r l i t e

. . .

oenukar a n i o n dan k a t i o n

d . E l e k t r o f o r e s i s

. . .

P e r s i a p a n Sampel (Hames, 1987)

. . .

P e r s i a p a n b u f f e r r e s e r v o i r

. . .

(Sigma,1988)

Pembuatan Gel e l e k t r o f o r e s i s SDS ( 1 0 % )

. . .

(Hames, 1987)

Pewarnaan ( S t a i n i n q ) dan p e n g h i l a n g a n

warna ( d e s t a i n i n g l (Sigma, 1988)

. . .

Mo 7ecu7ar m a r k e r (Sigma, 1988)

. . .

3 . ANALISIS

. . .

a . Pengukuran j u m l a h p r o t e i n

b . P e n g u j i a n a k t i f i t a s p r o t e a s e

. . .

I V . HASIL DAN PEMBAHASAN

. . .

A . Pemurnian Enzim P r o t e a s e Dengan Kolom

A m b e r l i t e Penukar A n i o n

. . .

B . Pemurnian Enzim P r o t e a s e Dengan Kolom

A m b e r l i t e Penukar K a t i o n

. . .

C . Pemurnian Enzim P r o t e a s e Dengan Kolom

(11)

(12)

(13)

(14)

(15)

(16)

(17)

(18)

(19)

(20)

(21)

(22)

(23)

(24)

(25)

(26)

(27)

(28)

(29)

(30)

(31)

(32)

(33)

(34)

(35)

(36)

(37)

(38)

(39)

(40)

(41)

(42)

(43)

(44)

(45)

(46)

(47)

(48)

(49)

(50)

(51)

(52)

(53)

(54)

(55)

(56)

(57)

(58)

(59)

(60)

(61)

(62)

(63)

(64)

(65)

(66)

(67)

(68)

(69)

(70)

(71)

(72)

(73)

(74)

(75)

(76)

(77)

(78)

(79)

(80)

(81)

(82)

(83)

EKSTRAKSI

DAN

PEMURNIAN

PROTEASE

DARI

Bacillus pumiiius

(Y1)

1 9 9 4

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR

(84)

Julius. F 27. 0959. Ekstraksi dan Pemurnian Protease Dari Bacillus

pumillus (Y1). Di bawah bimbingan D r . Ir. Maggy T. Suhartono dan

I r . Sutrisno Koswara.

RINGKASAN

Bacillus adalah bakteri yang sangat potensial u n t u k dijadi kan

sumber enzim protease. Bacillus yang digunakan dalam penelitian i n i

adalah j e n i s B. pumillus (Y1) y a n g diisolasi d a r i limbah c a i r t a h u

( L i kumahwa, 1993). Sedangkan penelitian ini bertujuan u n t u k mela-

k u k a n e k s t r a k s i dan p e m u r n i a n enzim protease d a r i B.

purnillus (Y1 ) dengan menggunakan berbagai kolom kromatografi [DEAE ( d i e t i l a m i n o e t i l ) Sephadex A-50 dan Amberlitel u n t u k mendapatkan

enzim protease yang relatif murni.

Dalam penelitian ini dilakukan fermentasi bakteri untuk mengha-

s i l k a n enzim protease dalam limbah cair tahu dengan penambahan 2%

skim, lalu d i i k u t i ekstraksi enzim dengan garam ammonium sulfat 55%

( w / v ) , besi (111) klorida, aluminium (111) k l o r i d a dan aseton dan

d i l a r u t k a n kembali dalam b u f f e r sodium sitrat, sodium ditionat dan

f o s f a t 0.01 M pH 8.0, kemudian d i d i a l i s i s dalam k a n t u n g selofan.

Dialisat lalu di kromatografi dalam resin penukar anion (Amberlite I R A

400 dan DEAE Sephadex A

-

50) dan penukar kation (Amberlite DP-1).

Fraksi-fraksi yang diperoleh, dipekatkan dengan pengeringan beku

dan selanjutnya dielektroforesis dalam gel SDS-poliakrilamid.

Dari hasil ekstraksi dengan berbagai macam garam pengendap

(85)