IDENTIFIKASI KARAKTER AROMATIK BERDASARKAN
PCR DAN ORGANOLEPTIK BC
3F
2CIHERANG x MENTIKWANGI
HILDA NUR RIZKIANY
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Identifikasi Karakter Aromatik berdasarkan PCR dan Organoleptik BC3F2 Ciherang x Mentikwangi adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Penelitian ini didanai oleh BB-Biogen atas nama Dr. Tri Joko Santoso, SP, MSi. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
Bogor, Oktober 2013
ABSTRAK
HILDA NUR RIZKIANY. Identifikasi Karakter Aromatik berdasarkan PCR dan Organoleptik BC3F2 Ciherang x Mentikwangi. Dibimbing oleh DJAROT SASONGKO HAMI SENO dan TRI JOKO SANTOSO.
Karakter aroma pada padi aromatik varietas asli Indonesia belum banyak dilaporkan. Identifikasi karakter aroma pada padi varietas Mentikwangi dilakukan dengan teknik PCR menggunakan primer Bradbury dan secara organoleptik menggunakan KOH. Penggunaan kedua metode ini diharapkan dapat menyeleksi tanaman padi hasil persilangan Ciherang x Mentikwangi galur BC3F2 menjadi aromatik dan non-aromatik, sehingga diperoleh beberapa galur harapan baru dengan latar belakang Ciherang yang membawa sifat aromatik. Hasil seleksi tanaman padi menggunakan primer Bradbury, dari total 266 tanaman BC3F2 yang diuji, diperoleh sebanyak 55 tanaman memiliki fragmen DNA berukuran sama dengan tetua Mentikwangi yaitu 275 bp, sebanyak 34 tanaman memiliki fragmen DNA berukuran sama dengan tetua Ciherang yaitu 355 bp, serta 177 tanaman memiliki fragmen DNA heterozigot atau campuran keduanya yaitu 355 bp dan 275 bp. Hasil uji organoleptik dengan KOH tanaman yang membawa alel homozigot resesif sebagian besar menunjukkan skor beraroma.
Kata kunci: Padi Mentikwangi, aromatik, badh2, Bradbury
ABSTRACT
HILDA NUR RIZKIANY. Identification of aromatic character by PCR and organoleptic on paddy BC3F2 Ciherang x Mentikwangi. Supervised by DJAROT SASONGKO HAMI SENO and TRI JOKO SANTOSO.
Aroma character of the original Indonesian aromatic rice varieties have not been widely reported. Identification of aroma character in paddy Mentikwangi will be done using PCR with primer Bradbury and organoleptic using KOH. Use these methods are expected to select rice plants from crosses Ciherang x Mentikwangi BC3F2 be aromatic and non-aromatic, in order to obtain some new promising lines with background Ciherang carrying aromatic trait. Rice crop selection results using primer Bradbury, of the total 266 BC3F2 plants were tested, as many as 55 plants have the same sized DNA fragment with Mentikwangi about 257 bp, 34 plants have the same sized DNA fragments with Ciherang about 355 bp, and 177 plants had a heterozygous DNA fragments or a mixture of both about 355 bp and 257 bp. Organoleptic test results with 1.7% KOH homozygous recessive allele showed most flavorful score.
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
IDENTIFIKASI KARAKTER AROMATIK BERDASARKAN
PCR
DAN ORGANOLEPTIK BC
3F
2CIHERANG X MENTIKWANGI
HILDA NUR RIZKIANY
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Judul Skripsi : Identifikasi Karakter Aromatik berdasarkan PCR dan Organoleptik BC3F2 Ciherang x Mentikwangi
Nama : Hilda Nur Rizkiany NIM : G84090016
Disetujui oleh
Dr Djarot Sasongko Hami Seno, MS Pembimbing I
Dr Tri Joko Santoso, SP, MSi Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir I Made Artika, MApp, Sc Ketua Departemen
PRAKATA
Bismillahirrahmanirrahim
Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala nikmat dan karunia-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Karya ilmiah yang berjudul “Identifikasi Karakter Aromatik berdasarkan PCR dan Organoleptik BC3F2 Ciherang x Mentikwangi” ini telah dilakukan sejak bulan Februari hingga Juni 2013.
Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Dr Djarot Sasongko Hami Seno, MS dan Dr Tri Joko Santoso, SP, MSi selaku pembimbing. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada kedua orang tua, Mba Dewi, Ka Falin, Mba Mira, Apri, Vita, Tuhfah, Kiki, Sari, Siska, Sisca, Clara serta rekan-rekan Biokimia 46 yang lain atas doa dan dukungannya.
Penulis menyadari masih terdapat kekurangan dalam penulisan karya ilmiah ini. Oleh karena itu, saran serta kritik yang membangun sangat penulis harapkan demi perbaikan di kemudian hari. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Oktober 2013
DAFTAR ISI
ABSTRAK ii
DAFTAR TABEL viii
DAFTAR GAMBAR viii
DAFTAR LAMPIRAN viii
PENDAHULUAN 1
METODE 2
Waktu dan Tempat Penelitian 2
Bahan 2
Alat 3
Prosedur Penelitian 3
HASIL DAN PEMBAHASAN 5
Hasil 5
Pembahasan 8
SIMPULAN DAN SARAN 13
Simpulan 13
Saran 13
DAFTAR PUSTAKA 13
LAMPIRAN 15
DAFTAR TABEL
1 Skor evaluasi aroma padi menggunakan metode kimia KOH 5 2 Benih tanaman padi BC3F2 yang mampu tumbuh sampai masa
penumbuhan di media tanah 5
3 Kuantitas dan kemurnian DNA hasil isolasi tanaman padi BC3F2 galur
7.3 6
4 Pola amplifikasi fragmen DNA tanaman padi BC3F2 Ciherang x
Mentikwangi dengan primer Bradbury 7
5 Hasil evaluasi aroma tanaman padi BC3F2 Ciherang x Mentikwangi 7 6 Hasil evaluasi aroma tanaman padi BC3F2 Ciherang x Mentikwangi
galur 7.3 8
DAFTAR GAMBAR
1 Alur penumbuhan benih padi BC3F2 Ciherang x Mentikwangi 5 2 Elektroforegram hasil seleksi tanaman padi BC3F2 Ciherang x
Mentikwangi dengan primer Bradbury 7
3 Diagram dan prosentase progeni gen pada metode persilangan terarah 9
4 Jalur pembentukan 2-asetil-1-pirolin (2AP) 10
5 Pola amplifikasi dengan marka Bradbury 11
DAFTAR LAMPIRAN
1 Elektroforegram hasil seleksi tanaman padi BC3F2 Ciherang x
Mentikwangi 15
PENDAHULUAN
Tuntutan konsumen terhadap beras semakin meningkat baik dari segi kuantitas maupun kualitas. Segi kualitas dipengaruhi oleh banyak komponen seperti mutu giling, gizi, tanak, rasa, serta penampilan. Di antara sifat-sifat tersebut, konsumen banyak memberi perhatian lebih terhadap mutu rasa, sedangkan faktor yang mempengaruhi mutu rasa antara lain kadar amilosa, warna beras, bentuk beras, dan aroma (Wijaya 2010; Litbang 2001; Somantri et al. 1985). Aroma pada padi menjadi bahan pertimbangan penting untuk meningkatkan selera makan konsumen, karena padi aromatik mengandung butiran beras yang harum dan memiliki aroma, rasa, dan tekstur yang pulen (Weber et al. 2000).
Padi aromatik juga lebih dipilih oleh para petani daripada padi non-aromatik karena mengandung butiran beras dengan keharuman yang akan menarik konsumen dengan harga jual yang lebih tinggi. Indonesia memiliki padi aromatik varietas lokal seperti padi Mentikwangi yang banyak berkembang di Jawa Tengah dan banyak digemari oleh masyarakat karena aroma dan kepulenannya. Namun padi ini sering tidak dikehendaki karena produktivitas padi ini rendah, umur tanamnya panjang, dan kurang tahan terhadap hama atau penyakit, sehingga tidak cukup untuk memenuhi permintaan pasar (Litbang 2006). Tingginya permintaan padi aromatik dipasaran mendorong penelitian untuk memperbaiki kualitas aroma pada tanaman padi. Sejauh ini penelitian mengenai aroma pada padi belum banyak dikembangkan di Indonesia.
Dalam rangka mewujudkan ketahanan pangan nasional akan sangat prospektif jika aroma pada padi Mentikwangi dapat ditambahkan ke padi non-aromatik yang memiliki sifat unggul seperti produktivitas tinggi, tahan terhadap hama, dan memiliki kualitas yang baik, seperti padi Ciherang. Apabila tanaman padi Mentikwangi disilangkan dengan padi Ciherang akan didapatkan padi varietas unggul baru dengan sifat agronomi sebaik padi Ciherang ditambah dengan sifat aroma dari padi Mentikwangi tanpa merusak kelebihan-kelebihan padi tetua pemulih (Ciherang). Hal ini akan membuat petani mendapatkan produk beras aromatik dengan kemudahan, waktu, resiko dan produktivitas seperti menanam padi non-aromatik, serta memberikan nilai tambah bagi petani karena harga padi aromatik relatif mahal dibandingkan padi non-aromatik (Taufiq 2011).
Sifat aromatik sendiri pada tanaman padi disebabkan oleh mutasi gen badh2 di kromosom no. 8 dan menyebabkan enzim BADH2 terpotong sehingga mengakumulasi senyawa 2-asetil-1-pirolin (2AP), yang merupakan senyawa utama yang bertanggung jawab terhadap aroma pada padi (Bradbury et al. 2005a). Gen badh2 dalam tanaman padi terletak di dalam inti sel dan bersifat homozigot resesif. Oleh karena itu, karakter aroma pada padi aromatik dapat dimasukkan ke padi non-aromatik melalui inaktivasi gen badh2nya. Inaktivasi ini dapat dilakukan dengan metode persilangan terarah. Metode ini banyak digunakan karena akan didapatkan turunan yang homozigot resesif sehingga didapatkan produk bukan transgenik (Hami Seno et al. 2009).
2
Nasodikin (2013). Hasil persilangan padi yang sudah sampai pada turunan BC3F1 akan dilakukan perkawinan secara selfing, seperti pada metode persilangan terarah (Hami Seno et al. 2009) dan akan diperoleh galur BC3F2. Gen badh2 yang terintroduksi ke dalam padi CM galur BC3F2 perlu untuk diidentifikasi dengan marka aromatik berbasis PCR menggunakan primer Bradbury untuk mendapatkan tanaman padi yang positif membawa sifat aromatik. Selanjutnya tanaman padi yang positif membawa sifat aromatik, senyawanya akan dikonfirmasi secara organoleptik menggunakan KOH. Identifikasi karakter aromatik menggunakan kedua metode tersebut diharapkan diperoleh varietas unggul baru yaitu Ciherang yang membawa sifat aromatik yang berasal dari Mentikwangi.
Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi karakter aromatik dari gen badh2 pada galur padi BC3F2 hasil persilangan padi Ciherang dan padi Mentikwangi, baik secara molekuler dengan primer Bradbury maupun organoleptik dengan KOH, supaya didapatkan galur-galur baru yaitu Ciherang aromatik. Hipotesis penelitian ini adalah padi CM galur BC3F2 dapat teridentifikasi dengan metode PCR menggunakan primer Bradbury berdasarkan amplifikasi gennya sehingga dapat membedakan tanaman padi yang aromatik dan non-aromatik, serta senyawa pembawa aromanya dapat terdeteksi secara organoleptik menggunakan KOH. Diharapkan hasil dari penelitian ini dapat menyumbangkan varietas unggul baru yaitu Ciherang aromatik yang mudah untuk ditanam seperti menanam padi padi Ciherang, meningkatkan pendapatan petani, serta memperkuat ketahanan pangan nasional.
METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan selama lima bulan mulai bulan Februari hingga Juni 2013. Tempat penelitian adalah di laboratorium Biologi Molekuler, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian, Jalan Tentara Pelajar No.3A, Bogor.
Bahan
3
Alat
Alat-alat yang digunakan adalah cawan Petri, bak plastik, ember, tabung mikro, tabung reaksi, satu set pipet mikro, tip pipet mikro, sentrifus (Beckman rotor 12), inkubator, oven, spektrofotometer Nanodrop, PCR PTC-100, tangki elektroforesis, dan UV Illuminator ChemiDoc EQ Biorad.
Prosedur Penelitian
Penumbuhan tanaman padi galur BC3F2 Ciherang x Mentikwangi (CM)
Benih padi kontrol (Ciherang dan Mentikwangi) serta sampel (galur 7.3, 9.2, 9.9, 11.3, dan 16.8) dioven terlebih dahulu pada suhu 50oC selama semalam. Selanjutnya benih-benih padi disemai di cawan Petri yang telah dilapisi kertas saring basah. Setelah delapan hari akar dan batang tanaman padi sudah muncul ke permukaan, lalu tanaman padi dipindahkan ke dalam bak plastik sebagai masa adaptasi. Setelah dua minggu berada di dalam bak plastik, tanaman dipindahkan ke dalam ember dan dibiarkan tumbuh selama satu bulan untuk dapat diisolasi DNAnya.
Isolasi DNA Tanaman Padi (Doyle & Doyle 1987; Shure et al. 1983)
Isolasi DNA tanaman padi mengacu pada metode Shure et al. (1983) dan Doyle & Doyle (1987).Daun tanaman padi dipotong sepanjang 10 cm, dipotong kecil-kecil dan dimasukkan ke dalam tabung mikro 2 mL. Kemudian sampel direndam dalam nitrogen cair dan digerus dengan bantuan sumpit. Hasil gerusan kemudian ditambahkan bufer CTAB sebanyak 200 µL dan diinkubasi pada suhu 65oC selama 15 menit (selang 5 menit tabung dibolak-balik). Setelah itu sampel didinginkan dalam suhu ruang, kemudian ditambahkan natrium asetat 3M sebanyak 100 µL dan chisam (perbandingan klorofom:isoamil sebanyak 24:1) sebanyak 1 mL. Kocok hingga rata lalu disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm selama 5 menit.
Supernatan diambil dipindahkan ke dalam tabung mikro 2 mL yang baru dan ditambahkan natrium asetat sebanyak 1/10 µL volume supernatan dan isopropanol sebanyak 2/3 µL volume supernatan, kemudian di bolak-balik secara perlahan untuk pengendapan DNA. Sampel disentrifugasi kembali selama 15 menit dengan kecepatan 12000 rpm. Supernatan dibuang secara perlahan-lahan agar pelet DNA tidak ikut terbuang. Pelet DNA yang terbentuk ditambahkan etanol 70% sebanyak 200 µL dan disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm selama 5 menit. Selanjutnya supernatan dibuang dan pelet DNA dikeringkan di oven pada suhu 60oC sampai kering. Setelah itu sampel dihilangkan RNAnya dengan ditambahkan TE-RNase sebanyak 50µL dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 30 menit.
Uji Kuantitas DNA Genomik dengan Spektrofotometer Nanodrop
4
kemurnian yang biasa dipakai dalam analisis molekuler pada rasio A260/A280 adalah 1.8-2.0 (Sambrook et al. 1989). Selain nilai kemurnian DNA, alat ini juga dapat mengukur kemurnian DNA dengan satuan ng/ μL.
Lubang optik dibersihkan terlebih dahulu dengan tissue. Blanko yang digunakan adalah larutan TE. Selanjutnya sebanyak 2 µL larutan TE dimasukkan ke dalam lubang optik. Setelah itu lubang optik dibersihkan kembali sebelum sampel dimasukkan. Sebanyak 2 µL sampel DNA dimasukkan ke dalam lubang optik.
Seleksi Tanaman Padi BC3F2 Ciherang x Mentikwangi menggunakan PCR (Bradbury et al. 2005)
Seleksi tanaman padi dilakukan dengan marka aromatik berbasis PCR dengan primer Bradbury. Primer Bradbury terdiri atas dua buah primer eksternal dan dua buah primer internal. Primer eksternal terdiri atas EAP (external antisense primer) dengan sekuen 5’-AGTGCTTTACAAAGTCCCG-3’ dan ESP (external sense primer) dengan sekuen 5’-TTGTTTGGAGCTTGCTGATG-3’. Primer internal terdiri atas INSP (internal non-fragrant sense primer) dengan sekuen 5’- CTGGTAAAAAGATTATGGCTTCA-3’ dan IFAP (internal fragrant antisense primer)dengan sekuen5’-CATAGGAGCAGCTGAAATATATACC-3’.
Reaksi PCR dilakukan dengan mesin PCR PTC-100 menggunakan program CKX-fast. Total volume yang digunakan adalah 10 μL, berisi 2,0 μL ddH2O, 5 μL 2XKapa 2G, 0,5 μL masing-masing primer (ESP, EAP, INSP, dan IFAP), 0,5 μL DMSO dan 0,5 μL cetakan DNA 100 ng/μL. Reaksi amplifikasi dilakukan sebanyak 30 siklus, yang terdiri atas denaturasi awal selama 3 menit pada suhu 95ºC, denaturasi selama 15 detik pada suhu 95ºC, penempelan primer selama 15 detik pada suhu 55ºC, dan perpanjangan primer selama 20 detik pada suhu 72ºC. Perpanjangan primer terakhir terjadi selama 10 menit pada suhu 72ºC
Konfirmasi DNA menggunakan Elektroforesis (Bradbury et al. 2005)
Produk PCR divisualisasi dengan elektroforesis gel agarosa 1%. Sebanyak 5 μL sampel DNA ditambahkan dengan 1 μL GelRed dan dimasukkan ke dalam sumur gel agarosa. Marka 1 kb ladder disertakan untuk melihat ukuran basa DNA. Tahap selanjutnya sampel DNA dialiri arus dengan tegangan listrik 70 volt selama 50 menit. Kemudian gel agarosa divisualisasi dengan chemidoc gel system.
Uji Aroma menggunakan Metode Organoleptik dengan KOH (Dong et al.
2001)
5 Kemudian skor dari panelis dirata-rata dan dikelompokkan ke dalam tiga kelompok, yaitu skor>1,0 digolongkan aroma, skor 0,6-1,0 digolongkan sedikit beraroma, dan skor<0,5 digolongkan tidak beraroma.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil Tanaman Padi BC3F2 Ciherang x Mentikwangi
Penumbuhan benih padi BC3F2 dilakukan secara bertahap (Gambar 1). Benih padi CM BC3F2 yang mampu tumbuh sampai masa penumbuhan di media tanah di dalam ember berjumlah 266 tanaman (Tabel 2). Padi-padi tersebut kemudian dibiarkan tumbuh kurang lebih satu bulan supaya DNAnya dapat diisolasi.
.
Gambar 1 Alur penumbuhan benih padi BC3F2 Ciherang x Mentikwangi. (A) Contoh benih tanaman padi BC3F2; (B) benih padi yang disemai di cawan Petri; (C) tanaman padi yang dipindahkan ke bak plastik; (D) tanaman padi yang dipindahkan ke ember
Tabel 2 Benih tanaman padi BC3F2 yang mampu tumbuh sampai masa penumbuhan di media tanah
Galur ∑ Benih yang ditumbuhkan ∑ Benih yang mampu tumbuh dengan baik di media tanah
Tabel 1 Skor evaluasi aroma padi menggunakan metode kimia KOH Skor Evaluasi aroma
0 Tidak ada aroma
1 Aroma lembut/agak beraroma
2 Sedikit beraroma
6
Kuantitas dan kemurnian menggunakan Spektrofotometer Nanodrop
Konsentrasi DNA yang didapatkan hasil pengukuran salah satu galur tanaman padi BC3F2 berada pada rentang 800-5000 ng/µ L dan kemurniannya berada pada rentang 1,7-2,0 (Tabel 3).
Hasil Analisis Aromatik Tanaman Padi BC3F2 Ciherang x Mentikwangi dengan PCR (Polymerase Chain Reaction)
Analisis aromatik tanaman padi BC3F2 menggunakan metode PCR dengan primer Bradbury. Prinsip kerja dari keempat primer Bradbury yaitu, primer eksternal (EAP dan ESP) akan mengamplifikasi fragmen DNA berukuran 580 bp pada tanaman padi aromatik maupun non-aromatik. Campuran primer ESP dan IFAP akan mengamplifikasi fragmen DNA berukuran 257 bp, yaitu menunjukkan alel dari padi aromatik (homozigot resesif). Campuran primer EAP dan INSP akan mengamplifikasi fragmen DNA berukuran 355 bp, yaitu menunjukkan alel padi non-aromatik (homozigot dominan) (Bradbury et al. 2005a).
Hasil analisis dari total 266 tanaman padi yang diseleksi, sebanyak 55 tanaman padi positif membawa alel homozigot resesif (sifat aromatik) yang diindikasikan dengan terbentuknya fragmen DNA berukuran 580 bp dan 257 bp (seperti tetua Mentikwangi) , sebanyak 34 tanaman padi membawa alel homozigot dominan yang diindikasikan dengan terbentuknya fragmen DNA berukuran 580 bp dan 355 bp (seperti tetua Ciherang), serta sebanyak 177 tanaman padi membawa alel keduanya atau heterozigot yang diindikasikan dengan terbentuknya fragmen DNA berukuran 580 bp, 355 bp, dan 257 bp (campuran padi Ciherang dan Mentikwangi) (Tabel 4). Sebanyak 55 tanaman padi yang positif membawa alel homozigot resesif (sifat aromatik), 13 tanaman berasal dari galur 7.3, 8 tanaman berasal dari galur 9.2, 5 tanaman berasal dari galur 9.9, 11 tanaman berasal dari galur 11.3, dan 18 tanaman berasal dari galur 16.8.
Contoh elektroforegram hasil seleksi tanaman padi galur BC3F2 Ciherang x Mentikwangi menggunakan Primer Bradbury ditunjukan pada Gambar 2. Terlihat satu tanaman positif membawa alel homozigot resesif (A9), enam tanaman membawa alel homozigot dominan (A1, A3, A4, A5, A6 dan A8), serta dua tanaman membawa kedua alel atau heterozigot (A2 dan A7) (Gambar 2). Hasil elektroforegram tanaman padi yang lebih lengkap dapat dilihat di Lampiran 1.
Tabel 3 Kuantitas dan kemurnian DNA hasil isolasi tanaman padi BC3F2 galur 7.3
No Sampel Konsentrasi (ng/µL) 260/280
7
Uji Aroma dengan KOH
Galur-galur tanaman padi BC3F2 Ciherang x Mentikwangi yang positif membawa alel homozigot resesif (seperti tetua Mentikwangi), yang disertakan dengan tanaman padi yang membawa alel homozigot dominan (seperti tetua Ciherang), dan heterozigot (campuran pita Ciherang dan Mentikwangi) diuji aromanya menggunakan KOH 1,7%. Berdasarkan uji aromanya, tanaman padi yang positif membawa alel homozigot resesif sebagian besar menunjukan skor beraroma, tanaman yang membawa alel homozigot dominan sebagian besar menunjukan skor sedikit beraroma, dan tanaman yang heterozigot memiliki skor yang sama antara beraroma dan sedikit beraroma (Tabel 5).
Gambar 2 Elektroforegram hasil seleksi tanaman padi BC3F2 Ciherang x Mentikwangi dengan primer Bradbury. A*: aromatik, N: non-aromatik, H: heterozigot. Marker: DNA 1 Kb ladder, Sampel: Mentikwangi (MW), Ciherang (Cih), Padi BC3F2 Cih/Mw (nomor A1-A9)
Tabel 4 Pola amplifikasi fragmen DNA tanaman padi BC3F2 Ciherang x Mentikwangi dengan primer Bradbury
No Galur Jumlah dan rasio pola amplifikasi fragmen DNA Mentikwangi
8
Contoh evaluasi aroma tanaman padi BC3F2 Ciherang x Mentikwangi salah satu galur ditunjukan pada Tabel 6. Terlihat dari lima tanaman padi yang positif membawa alel homozigot resesif, empat sampel diantaranya menunjukan skor evaluasi beraroma, sedangkan satu sampel sedikit beraroma. Tanaman padi yang membawa alel heterozigot, satu sampel menunjukan skor evaluasi tidak beraroma dan satu sampel menunjukan sedikit beraroma. Tanaman padi yang membawa alel homozigot dominan, keduanya menunjukan skor evaluasi tidak beraroma (Tabel 6). Hasil evaluasi aroma lebih lengkap dapat dilihat di Lampiran 2.
Pembahasan
Padi aromatik lokal yang digunakan dalam penelitian ini adalah padi Mentikwangi. Litbang (2006) menyebutkan padi Mentikwangi merupakan padi varietas javanica dengan karakteristik berbiji bulat, daun berwana hijau, dan memiliki tinggi tanaman berkisar 95 sampai 115 sentimeter. Kelebihan padi ini ialah memiliki aroma menyerupai pandan dan berstektur pulen. Namun produktivitas padi ini rendah dan tidak tahan terhadap hama. Padi non-aromatik lokal yang digunakan dalam penelitian ini adalah padi Ciherang. Padi ini memiliki sifat agronomi unggul, seperti umur tanamannya cukup singkat, menghasilkan anakan produktif 14 hingga 17 batang, tekstur nasi pulen, rata-rata produksi 5 hingga 8.5 ton/ha, serta tahan terhadap bakteri hawar daun dan wereng coklat, akan tetapi padi ini tidak aromatik (Hermanto 2006).
Introduksi sifat aromatik dari tanaman padi Mentikwangi ke dalam padi Ciherang dapat dilakukan melalui inaktivasi gen badh2nya. Inaktivasi ini dapat dilakukan dengan berbagai cara, antara lain ekspresi gen, kloning, dan insersi DNA yang diikuti dengan metode PCR skrining. Namun metode tersebut menghasilkan produk transgenik yang pemasarannya terhambat dengan regulasi GMO (Genetically Modified Organism). Aromatisasi pada penelitian ini Tabel 6 Hasil evaluasi aroma tanaman padi BC3F2 Ciherang x Mentikwangi galur
7.3
Ket: CIH: Ciherang, MW: Mentikwangi, N: Non-aromatik, A: Aromatik.
9 dilakukan melalui penggantian alel gen badh2 padi non-aromatik dengan alel gen yang membawa sifat aromatik menggunakan teknik persilangan terarah, sehingga didapatkan produk nontransgenik (Hami Seno et al. 2009).
Aromatisasi dari padi Mentikwangi ke dalam genom Ciherang telah dilakukan oleh Hami Seno et al. (2009) melalui persilangan tanaman kedua padi, dengan padi Ciherang sebagai induk betina dan padi Mentikwangi sebagai induk jantan sehingga terjadi pertemuan antara tepung sari dengan kepala putik dan menghasilkan embrio yang kemudian berkembang menjadi benih F1. Benih F1 yang dihasilkan kemudian disilangkan kembali dengan tetua Ciherang dan didapatkan turunan BC1F1 (Gambar 3). Selfing (penyerbukan sendiri) hanya diperlukan untuk introduksi sifat yang progeni gennya bersifat resesif seperti aromatik.
Penelitian ini menggunakan benih padi BC3F1 yang dibiarkan menyerbuk sendiri (selfing) untuk mendapatkan turunan BC3F2 (lihat Gambar 3). Pembentukan populasi hingga BC3F1 telah menghasilkan turunan dengan komposisi gen 93.75% mendekati tanaman tetua non-aromatik (Ciherang). Penyerbukan sendiri pada generasi BC3F1 diperlukan untuk memunculkan sifat-sifat dalam keadaan homozigot dominan, homozigot resesif, dan heterozigot, karena penyerbukan sendiri pada tanaman BC3F1 akan menyebabkan adanya segregrasi gen-den di dalamnya. Gen homozigot resesif yang dibawa oleh sifat aromatik akan didapatkan pada tanaman turunan BC3F2 yang telah mengalami segregrasi.
Penumbuhan benih padi BC3F1dimulai dengan pengeringan biji tanaman padi di dalam oven pada suhu 50oC selama semalam yang bertujuan untuk mengurangi kadar air dalam biji. Biji yang telah kering kemudian dilakukan penyemaian di dalam cawan Petri hingga terbentuk akar dan batangnya. Tanaman tersebut kemudian dipindahkan ke dalam bak plastik berisi tanah untuk menyesuaikan diri dengan kondisi lingkungan yang baru. Masa penyesuaian ini dilakukan selama kurang lebih dua minggu agar tanaman tidak stres dengan perubahan lingkungan. Tanaman kemudian dipindahkan ke dalam ember berisi tanah hingga dapat diisolasi DNAnya.
Jumlah tanaman yang mampu tumbuh sampai masa penyesuaian di ember berjumlah 266 tanaman. Beberapa tanaman tidak dapat tumbuh dikarenakan berbagai faktor, misalnya biji membusuk, tanaman tidak dapat menyesuaikan diri di lingkungan yang baru pada saat dipindahkan ke dalam bak plastik, serta pada saat tanaman berada di dalam ember mudah rebah terkena angin sehingga tanaman menjadi mati. Hal ini menyebabkan masing-masing galur memiliki jumlah yang berbeda-beda untuk jumlah tanaman padi sampel yang dapat tumbuh baik di dalam ember.
10
Selama penumbuhan di ember, senyawa aromatik dari tanaman padi telah tercium. Senyawa aromatik tersebut telah diketahui adalah senyawa 2AP yang bersifat volatil di udara (Buttery et al. 1983). Yoshishashi et al. (2002) telah membuktikan bahwa senyawa 2AP terbentuk pada saat tanaman padi tumbuh di areal sawah bukan setelah padi di masak. Pembentukan senyawa 2AP terjadi secara alami di dalam tanaman padi oleh gen badh2. Jalur pembentukan senyawa 2AP ditunjukkan seperti pada Gambar 4. Biosintesis jalur pembentukan 2-asetil-1-pirolin dimulai dari pemecahan prolin menjadi putresin kemudian membentuk komponen gama aminobutiraldehid (GABald). GABald merupakan substrat dari enzim BADH2, apabila enzim BADH2 aktif, maka enzim ini dapat mengubah GABald menjadi asam gama-aminobutirat (GABA), sedangkan apabila enzim BADH2 tidak aktif, maka GABald mengalami asetilasi (penambahan gugus asetil) membentuk 2-asetil-1-pirolin (Bradbury et al. 2005b).
Isolasi DNA tanaman padi hasil persilangan Ciherang x Mentikwangi BC3F2 menggunakan metode Shure et al. (1983) dengan modifikasi tambahan CTAB dari metode Doyle & Doyle (1987). Metode ini dipilih karena praktis, sampel yang digunakan berjumlah sedikit, cepat dan mudah. Bufer CTAB digunakan untuk mendegradasi senyawa-senyawa metabolit sekunder pada tanaman serta untuk memisahkan DNA dan RNA dari pengotor seperti karbohidrat dan protein. Hasil isolasi DNA tanaman BC3F2 di uji secara kuantitatif menggunakan spektofotometer Nanodrop.
Kemurnian DNA yang diperoleh menunjukkan bahwa sampel DNA kurang murni. Hal ini dapat dilihat dari rasio kemurniannya yang berada pada kisaran 1,7-2,0. Faktor penyebab ketidakmurnian ini ialah proses isolasi yang kurang berhati-hati sehingga masih terdapat pengotor baik protein ataupun RNA. Namun hal ini masih dapat ditolerir karena konsentrasi protein sangat kecil sehingga tidak mengganggu analisa selanjutnya (Taufiq 2011). Konsentrasi DNA yang diperoleh tidak seragam yaitu berada pada rentang 800-5000 ng/µ L. Konsentrasi DNA yang beragam kemudian diseragamkan menjadi 100 ng/µ L supaya pada saat PCR jumlah gen badh2 yang teramplifikasi berjumlah sama.
11 Tanaman padi hasil persilangan Ciherang x Mentikwangi galur BC3F2 perlu dilakukan seleksi untuk mendapatkan tanaman yang membawa sifat aromatik (homozigot resesif) menggunakan marka aromatik berbasis PCR dengan primer Bradbury. Penggunaan primer tersebut berdasarkan penelitian sebelumnya yang dilakukan Padmadi (2009). Prinsip kerja dari primer yang digunakan adalah dua primer eksternal (EAP dan ESP) akan mengamplifikasi daerah di 580 bp pada tanaman padi aromatik dan non-aromatik. Campuran primer ESP dan IFAP akan mengamplifikasi daerah di 257 bp, yaitu menunjukkan alel dari padi aromatik. Campuran primer EAP dan INSP akan mengamplifikasi daerah di 355 bp, yaitu menunjukkan alel padi non-aromatik (Gambar 5)(Bradbury et al. 2005a).
Hasil analisis menggunakan primer Bradbury menunjukkan sebanyak 266 sampel tanaman padi dapat dibedakan pola fragmen DNAnya menjadi homozigot dominan, homozigot resesif, dan heterozigot. Perbedaan pola fragmen DNA ini dapat dilihat pada elektroforegram berdasarkan ukuran DNA yang teramplifikasi (Lampiran 1). Tanaman padi yang teramplifikasi di 580 bp dan 257 bp menunjukkan bahwa pola fragmen DNAnya berbentuk homozigot resesif dan membawa sifat aromatik (badh2), karena gen aroma di dalam tanaman padi dikendalikan oleh sifat yang resesif. Sedangkan tanaman padi yang teramplifikasi di 580 bp dan 355 bp atau teramplifikasi di 580 bp, 355 bp, dan 257 bp, menunjukkan masing-masing tanaman memiliki pola fragmen DNA homozigot dominan dan heterozigot, serta membawa sifat non-aromatik. Ukuran amplikon padi aromatik lebih kecil dibandingkan dengan padi non-aromatik disebabkan pada padi aromatik terjadi delesi 8 basa di ekson no 7 pada kromosom no 8 (Bradbury et al. 2005a).
Pada penelitian ini ditemukan beberapa sampel padi tidak teramplifikasi di 580 bp baik pada padi aromatik maupun non-aromatik (Lampiran 1). Hal ini disebabkan oleh aroma pada tanaman padi merupakan karakter resesif sehingga marka yang digunakan harus marka kodominan. Penggunaan primer Bradbury dengan sistem multipleks (4 primer) kurang memuaskan dikarenakan primer ini tidak stabil untuk mengamplifikasi di daerah 580 bp meskipun pada beberapa varietas aromatik dan turunannya dapat teramplifikasi (Hami Seno et al. 2011). Namun, primer Bradbury telah dilengkapi dengan primer internal (IFAP dan INSP) yang mengamplifikasi secara spesifik pada padi yang membawa alel homozigot resesif (257 bp), homozigot dominan (355 bp), dan heterozigot (257 bp dan 355) sehingga skoring tanaman padi cukup dengan melihat pola fragmen DNA yang dihasilkan dari primer ini.
12
Pola segregrasi sifat aromatik pada populasi F2 telah dilaporkan mengikuti perbandingan 1:2:1 (non-aromatik:heterozigot:aromatik) (Sood & Sidiq 1978). Hasil dari penelitian ini ke lima galur tanaman padi tidak mengikuti pola tersebut. Segregrasi gen badh2 dalam penelitian ini bukan berarti tidak mengikuti hukum Mendel, akan tetapi dapat disebabkan oleh faktor lain, seperti jumlah minimal tanaman yang digunakan bisa saja jumlahnya kurang sehingga peluang untuk mendapatkan perbandingan 1:2:1 sangat kecil, serta sifat aromatik di dalam tanaman hasil persilangan merupakan sifat yang kompleks dan tidak sederhana (Kumari et al. 2012).
Tanaman padi yang positif membawa alel homozigot resesif, yang diikutkan dengan tanaman padi yang homozigot dominan, dan heterozigot diuji aromanya menggunakan KOH 1,7%. Panelis yang digunakan ialah panelis yang berada di laboratorium Biologi Molekuler, BB-Biogen, yang terdiri atas peneliti, staf, asisten laboratorium dan mahasiswa. Panelis yang digunakan pada uji aroma dipilih secara acak.
Senyawa pembawa aroma, 2AP dapat ditemukan disemua tanaman padi (batang, daun, dan biji-bijian) kecuali pada bagian akar. Ujung daun padi mengandung 2AP dalam jumlah yang lebih tinggi daripada bagian pangkal daun, sementara daun muda lebih beraroma daripada daun tua (Lourieux et al. 1996). Hal ini disebabkan senyawa putresin ditemukan dalam jumlah tinggi pada jaringan yang tumbuh aktif membelah. Senyawa ini kemudian dipecah menjadi GABald oleh enzim diamina oksidase (DAO) selama proses pembentukan lignin dan dinding sel, setelah sebagian besar pembelahan sel telah terjadi. Oleh karena itu, pembentukan GABald cenderung terjadi di jaringan muda yang secara aktif membelah dan membuat dinding sel menjadi kaku. Hal ini yang menyebabkan pada daun padi muda lebih beraroma dibandingkan daun yang sudah tua. Berdasarkan pernyataan tersebut, maka uji aroma digunakan daun padi yang masih muda. Diharapkan senyawa 2AP banyak terakumulasi dan lebih mudah didapatkan.
Metode uji aroma melibatkan uji bau dengan melibatkan jaringan atau butir padi yang dipanaskan dalam air atau dalam pereaksi KOH atau I2KI. Karaketer aroma pada padi hasil uji bau menunjukkan korelasi yang kuat dengan konsentrasi senyawa 2AP yang terdapat pada tanaman padi (Ishitaniki and Fushimi 1994). Meskipun ini merupakan metode konvensional akan tetapi metode ini tetap digunakan untuk uji kualitas aroma pada padi dan cukup untuk membedakan antara padi aromatik dan padi non-aromatik (Garland et al. 2000).
13
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Analisis aromatik melalui teknik PCR dan organoleptik pada tanaman padi BC3F2 hasil persilangan Ciherang dan Mentikwangi berhasil dilakukan. Keberhasilan analisis aromatik dengan teknik PCR dapat dibuktikan dengan teramplifikasinya fragmen DNA berukuran 355 bp, 257 bp, atau keduanya. Keberhasilan analisis aromatik secara organoleptik dapat dibuktikan dengan aroma pada sampel padi yang dapat dibedakan berdasarkan penggunaan panca indera. Melalui dua metode ini telah diperoleh tanaman-tanaman BC3F2 Ciherang x Mentikwangi yang membawa alel-alel aromatik dan menunjukkan sifat aroma.
Saran
Perlu dilakukan penentuan urutan basa nukleotida pada padi varietas aromatik dan non-aromatik lokal yang berguna untuk menentukan marka aromatik yang lebih spesifik untuk padi-padi tersebut. Serta perlu dilakukan penelitian lebih lanjut hingga dihasilkan benih BC5F2 untuk mendapatkan varietas aromatik nontransgenik.
DAFTAR PUSTAKA
Bradbury LMT, Fitzgerald TL, Henry RJ, Jin Q, Waters DLE. 2005a. The gene for fragrance in rice. J Plant Biotechnology 3: 363-370.
Bradbury LMT, Henry RJ, Jin Q, Reinke RF, Waters DLE. 2005b. A perfect marker for fragrance genotyping in rice. J Mol Breed 16:279–283.
Buttery RG, Ling LC, Juliano BO, Turnbaugh JG. 1983. Cooked rice aroma and 2-acetyl–1-pyroline in rice. J Agric Food Chem 31:823–826.
Dong, Y, E Tsuzuki, and H.Terao. 2001. Genetic analysis of aroma in three rice cultivars (Oryza sativa L.). J Genet Breed 55: 39-44.
Doyle JJ, Doyle JL. 1987. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Foccus 12: 13-15
Garland S, Lewin L, Blakeney A, Reineke R, Henry R. 2000.PCR-based molecular markers for the fragrance gene in rice (Oryza sativa L.). Theor Appl Genet 101:364–371.
Hami Seno DS, Santoso TJ, Tri Jatmiko KR, Padmadi B, Praptiwi D. 2009. Konstruksi padi non-aromatik yang beraroma wangi menggunakan PCR berbantuan marka gen badh2. Prosiding Seminar Hasil-Hasil Penelitian IPB 2009, 678-688. ISBN: 978-602-8853-03-3, 978-602-8853-08-8.
14
Hermanto. 2006. Padi Ciherang makin popular. Warta Penelitian dan Pengembangan Pertanian 28: 14-15
Ishitani K, Fushimi C. 1994. Influence of pre- and post-harvest conditions on 2 acetyl-1-pyrroline concentration in aromatic rice. The Koryo 183:73-80
Kumari Pummy, Ahuja Uma, Jain Sunita, and Jain. 2012. Fragrance analysis among recombinant inbread lines of rice. J Plant
Litbang. 2001. Padi Aromatik Varietas Sintanur. Lembar informasi pertanian. [LITBANG] Balai Penelitian Bahan Pangan. 2006. Mengenal padi VUTB
Fatmawati. http://jakarta.litbang.deptan.go.id/klinika gribisnis. J Litbang 12:1-6.
Lorieux M, Petrov M, Huang N, Guiderdoni E, Ghesquiere A. 1996. Aroma in rice: genetic analysis of a quantitative trait. Theor App Genet 93:1145–1151 Nasodikin M. 2013. Identifikasi gen aroma BC5F1 Ciherang-Pandan Wangi dan
BC4F1 Ciherang-Mentik Wangi [skripsi]. Bogor; Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Praptiwi D. 2010. Pembentukan dan seleksi F1 padi Ciherang-Pandan Wangi dan Fatmawati-Mentik Wangi menggunakan marka aromatik [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Sambrook J, Russell DW. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Ed
ke-2. New York: Cold-Spring Harbor Laboratory Pr.
Shure, Wessler MS, Fedorrof N. 1983. Molecular identification and the isolation of the waxy locus in maize. J Cell 35:225-233.
Somantri, I.H., A. Baihaki, Z. Harahap dan D. Suwandi. 1985. Pewarisan kadar amilosa pada padi. J Penelitian Pertanian 5(3): 33-35.
Sood BC, Sidiq EA. 1978. A rapid technique for scent determination in rice Indian. J Genet Plant Breed 38:268-271.
Taufiq. 2011. Seleksi menggunakan PCR berdasarkan marka gen badh2 pada pembentukan BC2F1 Ciherang/Mentikwangi dan BC3F1 Ciherang/Pandanwangi [skripsi]. Bogor; Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor
Weber DJ, Rohilla, Singh US. 2000. Chemistry and biochemistry of aroma in scented rice. Di dalam: Singh RK, US Singh, GS Khush, editor. Aromatic Rice Science. USA : Publisher Inc. hlm 29-46
Wijaya HC, Kusumaningrum H, Kusbiantoro B, dkk. 2010. Karakteristik sensori nasi dari beberapa varietas padi aromatik lokal Indonesia. Pangan vol 20 No 1. Jakarta
15
LAMPIRAN
18
19 Lampiran 2 Hasil evaluasi aroma tanaman padi BC3F2 menggunakan KOH 1,7% Galur 7.3
Ket : CIH: Ciherang, MW: Mentikwangi, N: Non-aromatik, A: Aromatik *Skor evaluasi rata-rata
20
Ket : CIH: Ciherang, MW: Mentikwangi, N: Non-aromatik, A: Aromatik *Skor evaluasi rata-rata
21
Ket : CIH: Ciherang, MW: Mentikwangi, N: Non-aromatik, A: Aromatik *Skor evaluasi rata-rata
22
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Ponorogo pada tanggal 28 Mei 1991 dari pasangan Achmad Nur Zainy dan Sri Andah Winarti. Penulis merupakan putri pertama dari tiga bersaudara. Penulis menyelesaikan pendidikan menengah atas di SMAN 1 Cilegon tahun 2009. Pada tahun yang sama, penulis meneruskan pendidikan di Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
